Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Die Meiose ist ein evolutionär konserviertes Ereignis in Eukaryoten, das für die Gametogenese und sexuelle Fortpflanzung unerlässlich ist. Unser Protokoll bietet eine effektive Methode zur Untersuchung der meiotischen Teilung und Spermatogenese. Wir haben eine Reihe von Protokollen für die Analyse von Spermatozyten beschrieben.

Diese Technik kann zur Beobachtung der meiotischen Spindel, homologer Chromosomen und der subzellulären Organellen in Spermatozyten eingesetzt werden. Diese Methode kann für die Analyse der meiotischen Teilung, die Generierung von Gen-Editing-Tiermodellen und die Gentransfektion in Geweben oder Organen eingesetzt werden. Die Experimentatoren sollten während der Bauchoperation eine sterile Umgebung aufrechterhalten und auf die Temperatur, die Zeit und die wichtigsten experimentellen Bedingungen dieses Protokolls achten.

Das Verfahren wird von Frau Meng-Fei Xu, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Konstruktion des GSK923295-vermittelten Zentromerproteins E- oder CENP-E-Inhibitions-Mausmodells, indem Sie die anästhesierten Mausgliedmaßen zusammenbinden und auf der Wachsschale fixieren. Nachdem Sie den Operationsbereich desinfiziert haben, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um eine Öffnung von fünf Millimetern in die Bauchhöhle der Maus zu bohren, und platzieren Sie anschließend sterile chirurgische Klammern auf der Haut.

Ziehen Sie dann das Nebenhodenfettpolster mit einer sterilen Präparierzange, um die Hoden mit Hilfe einer sterilen Pinzette zu lokalisieren. Nachdem Sie die Hoden mit einer sterilen Pinzette unter einem Stereoskop fixiert haben, injizieren Sie langsam 10 Mikroliter GSK923295 in Samenkanälchen mit einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren mit 10 Mikrolitern Riodin. Wenn Sie fertig sind, schieben Sie die Hoden zurück in die Bauchhöhle und nähen Sie die Operationsstelle wie im Textmanuskript beschrieben.

Für die Gradientendehydratisierung der gesammelten Maushoden wird die Probe sequenziell in verschiedenen Medien inkubiert, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie nach der seriellen Inkubation das Gewebe auf den Boden der Einbettbox und geben Sie das geschmolzene Paraffin in die Box. Für die vollständige Erstarrung des Paraffins kühlen Sie die Proben sechs Stunden lang bei vier Grad Celsius ab.

Fixieren Sie die Probe später auf der Halterung des Ultramikrotoms, während Sie den Winkel zwischen der Probe und der Messeroberfläche bei 5 bis 10 Grad halten. Stellen Sie die Schichtdicke auf fünf Mikrometer ein, um die fünf Mikrometer dicken Abschnitte mit einem Ultramikrotom zu präparieren. Nach der Präparation wird der Objektträger in einem Wasserbad bei 40 Grad Celsius ausgebreitet, bevor die Abschnitte 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Objektträgertrockner getrocknet werden.

Führen Sie nach 12 Stunden eine sequentielle Inkubation der Objektträger durch, wie zuvor beschrieben. Als nächstes spülen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in destilliertem Wasser ab und färben sie anschließend sechs Minuten lang bei Raumtemperatur mit Mayers Hämatoxylinlösung. Spülen Sie die verschmutzten Objektträger dann fünf Minuten lang unter fließendem Wasser ab und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang mit destilliertem Wasser.

Inkubieren Sie die Objektträger drei Sekunden lang in 1%igem Ethanolhydrochlorid und spülen Sie sie dann zwei Minuten lang unter fließendem Wasser ab. Färben Sie die Probe 15 Sekunden lang mit 1%Eosin, gefolgt von einer seriellen Inkubation. Wenn Sie fertig sind, versiegeln Sie die Objektträger mit 15 Mikrolitern neutralem Gummi und einem 24 x 50 Millimeter großen Deckglas.

Für die Immunfluoreszenz legen Sie den Objektträger in die Antigen-Retrieval-Lösung, um ihn vier Minuten lang unter hohem Druck in einem Schnellkochtopf zum Kochen zu bringen, um das Antigen zu gewinnen. Kühlen Sie den Objektträger dann auf natürliche Weise auf Raumtemperatur ab, bevor Sie ihn fünf Minuten lang zweimal mit destilliertem Wasser und fünf Minuten lang mit PBS abspülen. Um die Zellen zu permeabilisieren, inkubieren Sie den Objektträger 10 Minuten lang in 500 Mikrolitern 0,25 % Triton X-100 in PBS und spülen Sie die Objektträger dann dreimal fünf Minuten lang mit PBS aus.

Zur Antigenblockierung inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang mit 300 Mikrolitern 3%igem Rinderserumalbumin oder BSA und mit den Primärantikörpern in 3%BSA in PBST für 16 Stunden bei vier Grad Celsius. Legen Sie den Objektträger nach der Inkubation in eine befeuchtete Box, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern. Erwärmen Sie die Objektträger 30 Minuten lang auf Raumtemperatur.

Verwerfen Sie den primären Antikörper und spülen Sie den Objektträger anschließend dreimal fünf Minuten lang in PBST. Sekundäre Antikörper mit 3 % BSA und PBST verdünnen. Anschließend wird die Probe mit verdünnten Sekundärantikörpern für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Nachdem Sie die Probe fünfmal fünf Minuten lang in PBST gespült haben, färben Sie die Zellkerne fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 50 Mikrolitern DAPI. Montieren Sie das Deckglas mit dem lichtbeständigen Montagemedium und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Für die Durchflusszytometrie sammeln Sie Mäusehoden in sechs Zentimeter großen Petrischalen und schneiden die Hoden mit einer chirurgischen Schere in Stücke von einem Kubikmillimeter.

Anschließend werden die Hoden in einem Milliliter 1%Kollagenase in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius verdaut. Um spermatogene Zellen auszufällen, zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 1.000 g und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie einen Milliliter 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in die Probe geben. Später zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 1.000 g.

Verwerfen Sie den Überstand, um die ausgefällten Zellen mit einem Milliliter 70%igem kaltem Ethanol für mehr als acht Stunden bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Nach der fünfminütigen Zentrifugation bei 1.000 g werden Zellsedimente gesammelt und die spermatogenen Zellen mit 500 Mikrolitern Propidiumiodid oder PI-Färbelösung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten angefärbt. Nach der Inkubation wird die Probe mit einem 300-Maschensieb filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Zellen in einem Durchflussrohr gesammelt, um die Zellen bei vier Grad Celsius zu lagern.

Detektion von Fluoreszenzsignalen und Lichtstreuung bei der Anregungswellenlänge bei 488 Nanometern mit einem Durchflusszytometer. Analysieren Sie den DNA-Gehalt in der Probe und die Lichtstreuung mit der Software ModFit MF LT 32. Nach Hodeninjektion von GSK923295 war die spermatogene Welle in den Samenkanälchen durch CENP-E-Hemmung verändert.

Die spermatogene Welle in den Samenkanälchen war jedoch in der Kontrollgruppe regelmäßig und organisiert. Es wurde beobachtet, dass die verschiedenen homologen Chromosomen nach CENP-E-Inhibition nicht an der Äquatorplatte ausgerichtet waren. Des Weiteren führte die CENP-E-Inhibition zu einem Anstieg der Metaphase-I-Spermatozyten in Samenkanälchen.

Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte die verringerte Anzahl von anti-synaptonemalen Komplexproteinen drei oder SYCP3-positiven Zellen pro Samenkanälchen nach CENP-E-Hemmung. Andererseits waren die SYP3-Punkte pro Metaphasenzelle und die SYP3-Strecken pro Zelle in den GSK92395 Gruppen nicht betroffen. Die Abstände der Spindelpole in Metaphase-I-Spermatozyten waren aufgrund der CENP-E-Inhibition erhöht.

Die repräsentative Analyse zeigt, dass die CENP-E-Hemmung im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einer Abnahme der haploiden Zellen in der GSK-923295-Gruppe führte. Das Verhältnis der diploiden Zellen und der Aneuploidiezellen wurde nach CENP-E-Inhibition nicht signifikant beeinflusst. Umgekehrt stiegen die Verhältnisse der tetraploiden Zellen in der GSK923295 Gruppe an als in der Kontrollgruppe.

Die transmissionselektronenmikroskopische Analyse der spermatogenen Zellen zeigte die gestörte Organisation der spermatogenen Zellen in der GSK923295 Gruppe. Der Experimentator sollte während der Bauchoperation und der Hodeninjektion auf die Injektionsposition, die Medikamentendosis, die Injektionsmethode und die Nahtmethode achten. Diese Technik kann zusammen mit der in vivo Elektroporation, die sich auf die Zielproteine konzentriert, und den Gen-Editing-Werkzeugen im Bereich der Miot-Teilung und Spermatogenese eingesetzt werden.