Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer
30. November 2021
Hier stellen wir ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll für die genetische Manipulation von primären Kleinhirn-Granulazellvorläufern (GCPs) vor, das kostengünstig, effizient und lebensfähig ist. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll auch eine einfache Methode für die molekulare Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Hedgehog-Signalwege in primären GCP-Zellen.
Dieses Protokoll demonstriert eine einfache in vitro genetische Modifikationsmethode für die molekulare Untersuchung des primären Cilium-abhängigen Signalwegs in den primären Granulazell-Vorläuferkulturen. Aufgrund der Kosten, der geringen Lebensfähigkeit und der geringen Effizienz der aktuellen Transfektionsmethode führen wir eine einfache, kostengünstige und effiziente Elektroporationstechnik zur Untersuchung des Cilium-abhängigen Signalwegs in primären GCP-Kulturen ein. Geben Sie zunächst 0,5 Milliliter Kulturmedium in jede Vertiefung der 24-Well-Kulturplatte mit beschichteten Deckblättern und halten Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator warm.
Die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang bei 200x G drehen. Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern Opti-MEM. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um sicherzustellen, dass kein Restkulturmedium in der Röhre vorhanden ist.
Stellen Sie die Parameter der Elektroporation wie aufgeführt ein. Die Elektroporationsreaktion vorsichtig pipettieren, um gut zu mischen, und verwenden Sie eine lange P200-Pipettenspitze, um ein genaues Volumen von 100 Mikrolitern der Mischung in die Zwei-Millimeter-Spaltküvette zu übertragen. Sobald sich die Küvette in der Küvettenkammer befindet, drücken Sie die Omega-Taste des Elektroporators und notieren Sie den Impedanzwert, indem Sie sich an ein genaues Volumen von 100 Mikrolitern halten.
Der Impedanzbereich sollte ungefähr 30 und 35 betragen. Drücken Sie die Starttaste, um den Impuls zu starten. Zeichnen Sie die gemessenen Aktuellewerte in Joule auf, die auf dem Leserahmen angezeigt werden.
Nehmen Sie die Küvette aus der Kammer. Sofort 100 Mikroliter vorgewärmtes Kulturmedium in die Küvette geben und durch zwei- bis dreimaliges Pipettieren resuspendieren. Übertragen Sie die Zellsuspension sofort auf die zuvor vorbereitete 24-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. Beobachten Sie die Zellen am nächsten Tag unter dem Fluoreszenzmikroskop. In der vorliegenden Studie schien die Elektroporationseffizienz von DMSO- und SAG-behandelten Gruppen vergleichbar zu sein.
Die Immunfärbung des primären Ciliummarkers Arl13b zeigt, dass die Flimmerrate von GCP bei div-2 der Kultur sowohl in der Vehikel- als auch in der SAG-behandelten Gruppe erfolgt. Die Kiliationsrate veranschaulicht den Prozentsatz der Pax6-exprimierenden GCPs, die ein primäres Cilium auf der Zelloberfläche bei div-2 nach der Elektroporation tragen. Die Abbildung zeigt einen signifikanten Anstieg der geglätteten EGFP-Lokalisation auf dem primären Ciliumaxtonem von Pax6-Expressions-GCP-Zellen 24 Stunden nach der SAG-Behandlung, was auf eine tiefgreifende Aktivierung des primären Cilium-abhängigen Hedgehog-Signalwegs hinweist.
Um eine höhere Elektroporationseffizienz zu erreichen, sollte eine hohe Reinheit des verwendeten Plasmids sichergestellt werden, und es sind keine Rückstandskulturmedien in der Plasmidelektroporationsmischung vorhanden. Dieses Protokoll sollte für In-vitro-Experimente zur genetischen Veränderung an Primärkulturen und Zelltypen, die schwer zu transfizieren sind, einschließlich Neuronen und humaninduzierter pluripotenter Stammzellen, direkt anwendbar und vorteilhaft sein.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll dar, das für die genetische Manipulation primärer zerebellarer Granulazellvorläufer (GCPs) entwickelt wurde. Es konzentriert sich auf eine Methode, die sowohl kostengünstig als auch effizient ist, um die primärer Zilien-abhängigen Hedgehog-Signalwege zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Genetische Manipulation
- Zellsignalübertragung
Hintergrund
- Primäre cerebelläre Granulazellvorläufer (GCPs) sind entscheidend für die Untersuchung der neuronalen Entwicklung.
- Aktuelle Transfektionsmethoden sind häufig ineffizient und kostspielig.
- Das primäre Cilium ist für verschiedene Signalwege, einschließlich der Hedgehog-Signalübertragung, von entscheidender Bedeutung.
- Die Elektroporation bietet eine mögliche Lösung für diese Herausforderungen.
Zweck der Studie
- Einführung einer effizienten Elektroporationstechnik für die Kultur von GCPs.
- Erleichterung der Untersuchung von primärer Zilien-abhängiger Signalübertragung.
- Verbesserung der Ergebnisse genetischer Manipulationen bei schwer zu transfizierenden Zelltypen.
Verwendete Methoden
- Das Experiment verwendete In-vitro-Kulturen primärer GCPs.
- Das Elektroporationsprotokoll umfasste spezifische Parameter für eine effektive genetische Modifikation.
- Im Studienansatz wurde kein Multiomik-Ansatz erwähnt.
- Kritische Schritte beinhalteten die Zellresuspension und die Elektroporationssequenz.
- Mithilfe von Immunfärbungen wurde die Zilienbildung und die Aktivierung von Signalwegen analysiert.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll zeigte eine signifikante Steigerung der Aktivierung des Hedgehog-Signalwegs in behandelten GCPs.
- Die Immunfärbung zeigte eine deutliche Zunahme der Zilienbildung in GCPs nach der Elektroporation.
- Die Studie lieferte Erkenntnisse zur Effizienz der Elektroporation im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Sie kam zu dem Schluss, dass eine hohe Plasmidreinheit für den Erfolg der Elektroporation entscheidend ist.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt ein wertvolles Protokoll für die genetische Manipulation primärer GCPs bereit.
- Die Ergebnisse vertiefen das Verständnis zilienabhängiger Signalmechanismen.
- Zukünftige Anwendungen könnten verschiedene Zelltypen umfassen, die schwer zu transfectieren sind.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Eine effiziente genetische Manipulation primärer Granulazellvorläufer (GCPs) ist entscheidend, um Zilien-abhängige Signalmechanismen aufzuklären, die neurodevelopmentellen und Krankheitswegen zugrunde liegen. Dieses Elektroporationsprotokoll ermöglicht eine hohe Transfektionseffizienz und Zellviabilität und erlaubt dadurch eine robuste Untersuchung der Hedgehog-Signalwegdynamik in krankheitsrelevanten Systemen. Die Methode unterstützt eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der frühen Entdeckung und Zielvalidierung von Modulatoren von Signalwegen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle genetische Untersuchung der zilienabhängigen Hedgehog-Signalübertragung in primären GCPs.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung durch direkte Visualisierung der Lokalisation von Signalweg-Komponenten.
- Erleichtert die Zielvalidierung durch reproduzierbare Manipulation von Signalknoten in krankheitsrelevanten Zellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte primäre Zellsysteme für die nachgeschaltete Untersuchung von Signalwegmodulatoren vor.
- Ermöglicht eine hohe Transfektionseffizienz (~80–90 %) und Reproduzierbarkeit für quantitative Assayausgaben.
- Ermöglicht die skalierbare und kosteneffiziente Assayentwicklung für schwer zu transfectierende neuronale Modelle.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt die Übereinstimmung zwischen in-vitro-Befunden und krankheitsrelevanten zellulären Phänotypen für eine translationale Kontinuität her.
- Unterstützt die Biomarker-Entdeckung durch die dynamische Verfolgung der Lokalisation von Signalproteinen.
- Verringert das biologische Risiko bei der präklinischen Entwicklung, indem robuste mechanistische Daten bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll wird in die frühen Phasen der Entdeckung und Zielvalidierung integriert und verbindet die genetische Manipulation mit der quantitativen Analyse von Signalwegen in primären neuronalen Systemen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in primären GCPs.
- Screening: Bietet eine reproduzierbare, hochwirksame Transfektion für die Assay-Bereitschaft und quantitative Auswertungen.
- Analytik: Ermöglicht die Messung von Zilienbildungsrate und Signalwegaktivierung mittels Immunfärbung und Fluoreszenzmikroskopie.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse aus In-vitro-Studien mit krankheitsrelevanten zellulären Kontexten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine breit anwendbare Plattform für genetische Modifikationen in anspruchsvollen primären Zelltypen bereit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in Pfadstudien.
- Operativer Wert: Standardisiert genetische Manipulationen mit hoher Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten sowie die Kapitalnutzungseffizienz, indem belastbare Daten aus frühen Entwicklungsstadien bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Signaltransduktionsweg-Zielen und deren Modulatoren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der primären Neuronenkultur und Elektroporations-Techniken.
- Benötigt Zugang zu Elektroporationsgeräten und Fluoreszenzmikroskopie für die Analyse.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Plasmidreinheit und den Protokollen zur Mediumentfernung voraus.
- Kann durch Optimierung des Protokolls auf andere schwer zu transduzierende primäre Zelltypen übertragen werden.
- Die Effizienz hängt von der genauen Kontrolle der Elektroporationsparameter und der Probenvorbereitung ab.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
