Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Dieses Protokoll zeigt, wie man ein Maus-Fußpolster-Gangrän-Modell unter Verwendung der Verabreichung von Masseninhibitor und Femurarterie-Gerinnung erstellt. Die DiI-Perfusion ermöglicht dann eine hochauflösende Visualisierung des Gefäßsystems des Fußpolsters. Dieses Modell ist klinisch relevant und kann für präklinische Arzneimitteltests und zur Untersuchung der Ischämie der Gliedmaßen verwendet werden.

Die hochauflösende Visualisierung von Gefäßen bietet eine technisch einfache Möglichkeit, die Neovaskularisation zu beurteilen. Dieses Fußpolster-Gangränmodell hat wichtige Anwendungen in der präklinischen Erforschung der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit und der kritischen Ischämie der Gliedmaßen. Die DiI-Perfusion ist ein nützliches Werkzeug, um die Neovaskularisation in Tiermodellen zu untersuchen.

Das Verfahren wird von Antoine Ribieras, einem chirurgischen Assistenzarzt, und Yulexi Ortiz, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert. Machen Sie zunächst eine DiI-Arbeitslösung, indem Sie unmittelbar vor dem Gebrauch 200 Mikroliter DiI-Stammlösung zu 10 Millilitern der Arbeitsverdünnungslösung hinzufügen. Von Hand schütteln, um gut zu mischen.

Verbinden Sie zwei oder drei Drei-Wege-Absperrhähne und eine 25-Gauge-Schmetterlingsnadel in Serie. Bereiten Sie 10 Milliliter Spritzen mit vier Millilitern PBS, 10 Milliliter DiI-Lösung und 10 Milliliter 10% neutrales gepuffertes Formalin vor. Schließen Sie die Spritze mit Formalin an den proximalen Zuflussanschluss an und injizieren Sie die Lösung, um Luft aus der Leitung zu spülen.

Drehen Sie dann den Absperrhahn, um den Anschluss zu schließen. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang und verbinden Sie die Spritzen mit DiI und dann PBS mit den mittleren bzw. distalen Zuflussanschlüssen. Nach der Euthanasie legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein saugfähiges Pad und sichern Sie Achselhöhlen und untere Extremitäten mit Nadeln.

Machen Sie mit einer Schere einen Querschnitt, um die Bauchhöhle zu öffnen, und legen Sie dann die linke und rechte Membran frei, um Zugang zur Brusthöhle zu erhalten. Schneiden Sie die Brustwand auf beiden Seiten des Brustbeins von den unteren Rippen zu den ersten oder zweiten Rippen. Verwenden Sie einen Hämostat, um das untere Ende des Brustbeins zu greifen und es in Richtung des Kopfes des Tieres zu reflektieren, um die Brusthöhle freizulegen.

Identifizieren Sie den linken Ventrikel, der heller erscheint als der rechte. Fassen Sie das Herz vorsichtig mit stumpfer Pinzette und führen Sie die Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel ein. Verwenden Sie eine Schere oder eine 18-Gauge-Nadel, um den rechten Vorhof zu punktieren, so dass Blut und Perfusionslösungen zum Abfluss in das Herz zurückkehren können.

Öffnen Sie den Anschluss der Spritze mit PBS und injizieren Sie manuell zwei bis vier Milliliter mit einer Rate von ein bis zwei Millilitern pro Minute für ein bis zwei Minuten, um Blut aus dem Gefäßsystem zu spülen. Stellen Sie eine erfolgreiche Durchblutung sicher, indem Sie Blutungen aus dem rechten Vorhof beobachten. Schließen Sie nach der Injektion den Anschluss der PBS-Spritze.

Öffnen Sie den Anschluss der Spritze mit DiI und injizieren Sie fünf bis 10 Milliliter mit einer Rate von ein bis zwei Millilitern pro Minute für fünf Minuten. Schließen Sie nach der Injektion den Anschluss der DiI-Spritze und warten Sie zwei Minuten, bis der Farbstoff vor der Injektion des Fixiermittels eingearbeitet werden kann. Öffnen Sie den Port der Spritze mit Formalin und injizieren Sie fünf bis 10 Milliliter mit einer Rate von ein bis zwei Millilitern pro Minute für fünf Minuten.

Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel aus dem linken Ventrikel. Verteilen Sie mit einer schweren Schere das Schienbein am Knöchel und trennen Sie den linken und rechten Fuß vollständig vom Unterschenkel. Legen Sie die geernteten Füße in eine 12-Well-Platte mit ein bis zwei Millilitern 10% Formalin-Lösung.

Den Teller mit Folie umwickeln und über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Fixierlösung in einer 12-Well-Platte mit ein bis zwei Millilitern PBS pro Well. Machen Sie einen Längseinschnitt mit einem Skalpell am plantaren und dorsalen Teil des Fußes.

Entfernen Sie dann mit einer Zahnzange und einem kleinen Hämostat vorsichtig die gesamte Haut vom Fuß und den Fingern, ohne die darunter liegenden Weichteile zu beschädigen. Um Taschentücher zu montieren, platzieren Sie die Füße einzeln zwischen zwei Glasmikroskopobjektträgern mit einem Schaumbiopsie-Pad, das an jedem Ende über sich selbst gefaltet ist. Verwenden Sie zwei kleine Bindemittelclips, um die Glasschienen an jedem Ende zu komprimieren.

Alternativ können Sie das Fußpolster auf eine 12-Well-Platte mit ein bis zwei Millilitern PBS zurückführen. Nachdem Sie es mit Folie bedeckt haben, lagern Sie es bei vier Grad Celsius, um die Fluoreszenz für bis zu einem Monat aufrechtzuerhalten. Schalten Sie das Bildgebungssystem ein, starten Sie die Erfassungssoftware, und verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung oder niedriger numerischer Blende, um Bilder aufzunehmen.

Klicken Sie im Dialogfenster Bühne aktivieren auf Ja. Aktivieren Sie den 561-Nanometer-Laser auf der Registerkarte Konfiguration. Aktivieren Sie auf dem Hauptbildschirm einen sichtbaren Balkenpfad, indem Sie auf den sichtbaren Button klicken.

Stellen Sie einen Detektor auf den Bereich von 570 bis 600 Nanometern, indem Sie auf die entsprechende aktive Checkbox klicken. Wählen Sie das Kachelscan-Symbol auf der Registerkarte "Erfassung" aus und legen Sie die gewünschte Auflösung fest. Positionieren Sie trocken montierte Gewebeproben komprimiert zwischen Glasobjektträgern auf dem Mikroskoptisch und bringen Sie das Gewebe in den Fokus.

Navigieren Sie zu einer Ecke des Beispiels. Klicken Sie im Menü Kachelscan auf die Schaltfläche Markierungsposition. Navigieren Sie zur gegenüberliegenden Ecke und klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Position markieren, um die Scangrenzen festzulegen.

Um die Tiefe des Z-Stacks einzustellen, klicken Sie auf den Live-Button. Navigieren Sie zur Mitte des Beispiels, und verwenden Sie den Knopf der z-Achse, um zum Ende des Beispiels zu scrollen. Klicken Sie auf der Registerkarte Erfassung unter dem Z-Stack-Menü auf die Schaltfläche Beginn.

Scrollen Sie zum Anfang des Beispiels und klicken Sie auf die Schaltfläche Ende. Klicken Sie auf die Z-Schritt-Größe und stellen Sie sie auf den gewünschten Wert ein. Klicken Sie dann auf Start, um mit der Bildaufnahme zu beginnen.

Die Abbildung zeigt die Variation des Gewebeverlusts, die von diesem Modell eine Woche nach der Operation erwartet werden kann, wobei FABER-Werte in der unteren rechten Ecke jedes Bildes aufgezeichnet werden. Rekonstruktionsmikroskopische Bilder zeigen eine normale vaskuläre Anatomie in einem nicht ligierten Kontrollfußpolster im Vergleich zu einer stark verminderten Durchblutung des Fußpolsters der ligierten Hinterbeingliedmaßen fünf Tage nach der Operation. 20 Tage nach der Operation hat sich die Durchblutung des Fußpolsters deutlich verbessert, wenn auch nicht in dem Maße wie bei der nicht-ligierten Kontrolle.

Das Video zeigt, dass dann das Oberflächenrendering mithilfe der Animationsfunktion erstellt wurde. Spülen Sie alle Luftblasen aus der Perfusionsbaugruppe. Wenn sich die Lunge während der Perfusion ausdehnt und rosa wird, hat die Nadel den rechten Ventrikel durchdrungen und sollte leicht zurückgezogen werden.

Gliedmaßengewebe kann zur Immunfärbung verwendet werden, um Muskelnekrose, Geweberegeneration, Gefäßdichte und Rekrutierung von Vorläuferzellen und anderen Gewebereparaturzellen zu beurteilen. Die Technik der DiI-Perfusion in diesem murinen Gangränmodell wurde in Studien zu Gen- und Zelltherapien eingesetzt. Die Forschung zielt darauf ab, die Perfusion in den Gliedmaßen von Patienten mit kritischer Extremitätenischämie zu verbessern.