Name: Schnelle Isolierung wilder Nematoden durch Baermann Funnel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Erfahren Sie die schnelle Isolierung wilder Nematoden aus natürlichen Substraten mit dem Baermann-Trichter. Diese Methode ermöglicht Ökologie- und Populationsgenetik-Studien vor Ort.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R35GM141906 und R21ES031364 sowie das Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19 unterstützt.

1. Vorbereitung von ausgesäten NGM-Platten auf dem Feld
<ol><li>Vor der Reise 23.005 g Nematode Growth Medium (NGM) Pulver (siehe Materialtabelle) einwiegen und in einem verschließbaren Plastikbeutel vorverpacken. Machen Sie eine Tasche für jeden Liter gewünschtes Medium. HINWEIS: Die Vorverpackung vor der Reise umgeht die Notwendigkeit eines funktionalen Gleichgewichts im Feld.</li>
	<li>Bereiten Sie vor der Reise 1 mL 1M MgSO4, 1 mL 1M CaCl2 und 25 ml 1M Kaliumphosphatpuffer für jeden Liter gewünschtes Medium vor. Um 1 l Kaliumphosphatpuffer herzustellen, lösen Sie 108,3 g KH2PO4 und 35,6 g K2HPO4 in Wasser auf, wie in WormBook20 beschrieben.</li>
	<li>Machen Sie vor der Reise eine Übernachtungskultur von OP50 (siehe Materialtabelle), die in LB bei 37 ° C gezüchtet wurde, wie in WormBook20 beschrieben. Aliquotieren Sie die Kultur in 50 ml konische Rohre und wickeln Sie die Oberseiten mit Paraffinfolie ein, um ein Auslaufen zu verhindern.</li>
	<li>Lösen Sie im Feld den Inhalt der NGM-Packung in 973 ml doppelt destilliertes Wasser (ddH20) oder das reinste, sterilste Wasser auf, das in einem 1-Liter-Kolben oder einer Flasche erhältlich ist.</li>
	<li>Stellen Sie den Medienkolben oder die Flasche mit einem losen Deckel oder einer Aluminiumfolienabdeckung in ein kochend heißes Wasserbad auf einer Heizplatte oder einem Herd. Gelegentlich umrühren, bis sich das gesamte Pulver aufgelöst hat und klar ist (dies dauert ~ 30 min). HINWEIS: Wenn eine magnetische Heizplatte verfügbar ist, ist ein Rührstab eine ausgezeichnete Option, um die Menge des manuellen Rührens zu begrenzen.</li>
	<li>Das Medium aus dem Wasserbad nehmen und mit gelegentlichem Schütteln oder mit einem Rührstab auf ~58 °C abkühlen lassen. Sobald das Medium auf 58 ° C abgekühlt ist, verwenden Sie serologische oder Standardpipetten, um 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer, 1 ml 1 M MgSO4 und 1 ml 1 M CaCl2 hinzuzufügen und zwischen jedem Schritt gut zu mischen.</li>
	<li>In der sterilsten verfügbaren Umgebung pipettieren oder gießen Sie das Medium in Platten der gewünschten Größe und lassen Sie es über Nacht abkühlen und erstarren. Gießen Sie eine 60 mm Platte (~ 10 ml) für jede Substratprobe. Gießen Sie eine 35-mm-Platte (~ 3,5 ml) für jede isofemale Linie; Die Anzahl der benötigten kleinen Platten ist im Voraus schwer vorherzusagen.</li>
	<li>50 μL OP50-Kultur auf jede Platte pipettieren und über Nacht trocknen lassen, bevor sie verwendet wird.</li>
</ol>2. Sammlung der Nematodensubstrate
<ol><li>Identifizieren Sie ein bakterienreiches Substrat im Feld. Einige Beispiele sind verrottende Früchte, Blumen, Pilze und Stängel von krautigen Pflanzen. Erde und Laubstreu sind ebenfalls geeignet, obwohl sie selten Caenorhabditis enthalten.</li>
	<li>Legen Sie mit einer behandschuhten Hand eine Probe dieses Substrats (1-15 cm3) in einen verschließbaren Plastikbeutel (siehe Materialtabelle), der mit einer eindeutigen Proben-ID gekennzeichnet ist (Abbildung 1A).</li>
	<li>Zeichnen Sie die Proben-ID, den Breitengrad, den Längengrad, das Datum, die Beschreibung des Substrats und alle anderen lokalen Umweltmessungen auf, die für das Experiment relevant sind, einschließlich Umgebungs- und Substrattemperatur, Zeitpunkt der Sammlung, Zustand des Substrats, Vorhandensein von substratassoziierten Makroinvertebraten usw. Um diesen Prozess zu optimieren, steht eine Smartphone-App zur Verfügung21.</li>
</ol>3. Vorbereitung einer Reihe von Baermann-Trichtern
<ol><li>Verwenden Sie für jeden Trichter eine Schere, um ein Segment aus Gummischläuchen (siehe Materialtabelle) von ca. 3 cm Länge zu schneiden.</li>
	<li>Passen Sie das Schlauchsegment über das Ende eines Kunststofftrichters an (siehe Materialtabelle). Dies kann einige Anstrengungen erfordern, da die Passform sehr eng ist.</li>
	<li>Schieben Sie eine Schlauchschelle über den Gummischlauch und klemmen Sie ihn zu.</li>
	<li>Um einen Trichterhalter herzustellen, schneiden Sie mit einem Skalpell kreisförmige Löcher mit einem Durchmesser von 35 mm in den Boden eines Papp-Fliegenfläschchentabletts (siehe Materialtabelle), das nicht aus seiner flachen Versandausrichtung zusammengefaltet wurde. Ein Standardfach bietet Platz für 12 dieser Löcher in einem 3 x 4-Array.</li>
	<li>Drehen Sie den Karton um, falten Sie die Seiten einmal herunter (nicht zweimal, wie man es tun würde, um ein Fly-Vial-Tablett herzustellen), und kleben Sie die Seiten zusammen, um das umgekehrte Pappfach anzuheben (Abbildung 2).</li>
	<li>Platzieren Sie Trichter in den Löchern und stellen Sie zunächst sicher, dass sich die Schlauchschellen in der geschlossenen Position befinden.</li>
</ol><img alt="Tropftrocknungsanlage für umgedrehte Plastikbecher in einem Labor; Trocknungsprozess, Verwendung der Ausrüstung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Umfunktionierte Fliegenfläschchenschalen aus Pappe, gefaltet und geschnitten, um jeweils 12 Baermann-Trichter zu tragen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
4. Transfer der Proben in die Trichter
<ol><li>Gießen Sie Wasser (so steril wie möglich) in jeden Trichter und füllen Sie ihn etwa 3 cm unter dem Rand. Wenn Luftblasen im Schlauch eingeschlossen sind, klopfen Sie auf den Trichter, um sie freizugeben.</li>
	<li>Legen Sie mit behandschuhten Händen ein fusselfreies Tuch oder speziell ein Kimwipe (in zwei Hälften gefaltet, um ein Quadrat zu bilden) über den Trichter und drücken Sie auf die Mitte, so dass es in das Wasser getaucht wird.</li>
	<li>Brechen Sie große feste Stücke natürlicher Substrate (Früchte, Blüten, Erde, Laubstreu usw.) manuell in kleinere Fragmente auf, um die Entfernung zu minimieren, die Würmer zurücklegen müssen, um aus dem Substrat zu fallen. HINWEIS: Laubstreu und ungeschickt geformte Proben können in einer Küchenmaschine oder einem Mixer vorverarbeitet werden.</li>
	<li>Legen Sie eine Probe des natürlichen Substrats (1-15 cm3) vorsichtig auf das Gewebe/ fusselfreie Tuch in einem Trichter, ohne das Gewebe zu punktieren und ohne dass die Probe über den Rand hinausragt.</li>
	<li>Beschriften Sie den Trichter oder den Karton neben dem Trichter mit der Beispiel-ID, die den Feldsammelnotizen entspricht.</li>
	<li>Falten Sie die Ecken des Gewebes/fusselfreien Wischens über die Probe (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, die probe im gewebe- / fusselfreien Wisch zu halten, damit kein Boden oder Schutt an den Boden des Trichters gelangen kann. HINWEIS: Dieser Schritt soll verhindern, dass die Ecken über den Rand des Trichters drapiert werden, wo sie das Wasser aus dem Trichter über die Seiten leiten würden.</li>
	<li>Wählen Sie mit Händen, einem Spatel oder einer Pipettenspitze aktive Insekten, Tausendfüßler oder andere Tiere aus, die von Trichter zu Trichter wandern und Proben kreuzkontaminieren können. Wickeln Sie das Gewebe / fusselfreie Tuch vollständig um die Probe oder legen Sie ein zweites Gewebe über die Oberseite der Probe, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Geben Sie mehr Wasser in die Trichter, damit die gesamte Probe untergetaucht wird (Abbildung 3).</li>
</ol><img alt="Experimentieren Sie mit Teeprobenexperimenten mit Aufgusstechniken, Ziehzeitanalyse und Verkostungseinrichtung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: Montierte Baermann-Trichter. Jede Probe wird in gewebe-/fusselfreies Wischtuch gewickelt und unter Wasser in den Trichter getaucht, der geschlossen wird. Über einen Zeitraum von ~ 12 h wandern die Nematoden durch das Gewebe und zum Boden des Trichters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
5. Extraktion von Nematoden aus den Trichtern
<ol><li>Warten Sie ~ 12 h oder über Nacht. Während dieser Zeit winden sich aktive Würmer aus dem Substrat, durch das gewebe- / fusselfreie Wischen und bis zum Boden des eingeklemmten Trichters. HINWEIS: Wenn Sie viel länger als 12 h warten, besteht das Risiko einer Wurmsterblichkeit aufgrund von Hypoxie oder pathogener Infektion, die bei kürzeren Proben, die besonders mit Würmern und Bakterien überfüllt sind, auch ein Risiko darstellen kann.</li>
	<li>Schreiben Sie die Proben-ID eines Trichters auf den Boden einer 60 mm NGM-Wurmplatte, die mit einem Fleck von OP50 E. coli-Bakterien ausgesät ist. Entfernen Sie den Deckel von der Platte.</li>
	<li>Entfernen Sie den Trichter, der diese Probe enthält, aus dem Trichterständer. Verwenden Sie eine Hand, um den Trichter aufrecht über der offenen Schneckenplatte zu halten, und verwenden Sie die andere Hand, um Druck auf die Schlauchschelle abzulassen, so dass ein Tropfen Wasser vom Schlauch auf die Schneckenplatte fallen kann (Abbildung 1C). Sobald Wasser aus dem Trichter fällt, klemmen Sie es schnell wieder zu, um ein Überfluten der NGM-Platte zu verhindern. HINWEIS: Um Würmer auszuwählen, die von OP50 angezogen werden, einschließlich Caenorhabditis-Arten , geben Sie den Tropfen vom Bakterienrasen ab. Wenn das Wasser in die Platte eindringt oder verdunstet, kriechen Caenorhabditis-Nematoden in den Bakterienrasen.</li>
	<li>Aufräumen: Werfen Sie den Inhalt der Trichter weg. Waschen Sie die Trichter mit heißem Wasser zur späteren Wiederverwendung.</li>
</ol>6. Etablierung der Kulturen
<ol><li>Beobachten Sie die isolierten Nematoden unter dem Stereomikroskop bei einer Vergrößerung von 5x-50x. Die Platten sollten Nematoden und bei viel niedrigeren Frequenzen kleine Oligochaete Anneliden, Bärtierchen, Rädertierchen und kleine Krebstiere enthalten (Abbildung 4). HINWEIS: Wenn der Trichter richtig eingerichtet wurde, haben es keine Milben, Insekten oder sichtbares nicht lebendes Material durch den Trichter geschafft.</li>
</ol><img alt="Mikroskopische Aufnahme von Nematoden, die die Populationsdichte zeigen; nützlich für die Analyse biologischer Studien." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4: Inhalt des ersten Tröpfchens, das aus einem Baermann-Trichter auf eine NGM-Platte freigesetzt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig04large.jpg" target="_blank"></a>
<ol start="2"><li>Um Isohermaphrodit- oder Isofemale-Linien zu etablieren, verwenden Sie einen Wurmpickel, um jeden L4-Hermaphroditen oder jedes gepaarte erwachsene Weibchen (erkennbar an ihrer größeren Körpergröße und dem Fehlen des ausgeprägten männlichen Schwanzes22) auf eine separate 35-mm-NGM-Platte zu übertragen, die mit OP50 ausgesät ist (Abbildung 1D). Verwenden Sie ein Feuerzeug, um den Wurmpickel vor und nach dem Übertragen von Würmern zu sterilisieren.</li>
	<li>Verwenden Sie Paraffinfolie, um die Teller gründlich für die Reise zu wickeln.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Das zentrale Prinzip dieser Methode besteht darin, dass Nematoden das in Wasser getauchte Gewebe passieren, während ihr Substrat und größere wirbellose Verunreinigungen dies nicht tun. Die kritischen Schritte des Protokolls sind (1) das Sammeln eines geeigneten Substrats, (2) das Eintauchen des in ein Filtermaterial eingewickelten Substrats in Wasser, (3) das Sammeln von Würmern, die den Filter passiert haben und auf den Boden des Wassers gesunken sind, und (4) die Isolierung einzelner Würmer, um isofemale oder isohermaphrodite Linien zu erzeugen. Alle anderen Teile der Methode können je nach den verfügbaren Ressourcen, der Art der Substrate oder den Feldarbeitszielen bei Bedarf modifiziert werden. Einige Änderungen, die es wert sind, in Betracht gezogen zu werden, sind wie folgt.
Ködern der Würmer durch Pflanzen von Früchten Wenn auf dem Feldgelände kein ausreichendes Angebot an bakterienreichem Fäulnismaterial vorhanden ist, kann man eine Probe, wie ein Stück Apfel oder eine Tomate, mitbringen, um sie verrotten zu lassen. Stecken Sie den Köder gut mit ein paar Pfählen fest, damit größere Tiere ihn nicht entfernen und so später leicht zur Abholung gefunden werden kann. Vermeiden Sie direkte Sonneneinstrahlung, bei der der Köder trocknen könnte, bevor er verrottet.
Trichterapparatur aus allen verfügbaren Materialien konstruieren Jede Struktur mit Löchern, die groß genug sind, um die Rohrklemme aufzunehmen, und stabil genug, um einen kopflastigen Trichter zu tragen, funktioniert. Für einen einzelnen Trichter ist ein Trinkglas ein geeigneter Halter. Jede Art von Taschentuch – Gesichtstücher, Toilettenpapier oder Papierhandtücher – kann verwendet werden.
Weniger Material in Trichter geben oder die Wartezeit anpassen, um Hypoxie oder Infektionen zu verhindern Wenn die Probe eine sehr hohe Konzentration an Würmern oder Bakterien aufweist, können Nematoden an Hypoxie oder Infektion sterben, bevor die 12-stündige Inkubation abgeschlossen ist. Wenn dies ein Problem darstellt, kann der Forscher die Trichter früher überprüfen oder einen zusätzlichen Trichter mit einer sehr kleinen Teilstichprobe des dicht besiedelten Substrats vorbereiten.
Anpassung der NGM-Plattenvorbereitung an experimentelle Bedürfnisse und Einschränkungen NGM-Platten können mit jedem Medium und jeder Nahrungsquelle zubereitet werden, die für das Experiment geeignet sind. Das oben beschriebene Feldprotokoll wurde entwickelt, um das Gepäckgewicht zu minimieren. Abhängig von den Gepäckbeschränkungen und dem Zeitpunkt der Feldarbeit kann das Mitbringen bereits gegossener NGM-Platten - entweder im Labor vorbereitet oder kommerziell gekauft - dem Ausgießen von Platten im Feld vorzuziehen sein.
Durchführung der Trichterisolierungen im Labor Das Protokoll beschreibt die Durchführung des gesamten Verfahrens unter Feldbedingungen, um die Nematodenpopulation so zu erfassen, wie sie in der Natur vorkommt. Für einige Forschungsziele kann es ausreichen, Nematoden später zu isolieren, nachdem sie mit Proben in versiegelten Beuteln ins Labor zurückgekehrt sind. Selbst dann liefert die Baermann-Trichtermethode eine sauberere und vollständige Probe der überlebenden Nematoden als andere Isolationsmethoden. Proben in versiegelten Beuteln können jedoch während der Reise ausgewählt werden, da sie potenziellen Extremen von Temperatur und Hypoxie ausgesetzt sind. Dies kann minimiert werden, indem so schnell wie möglich nach der Probenentnahme Isolierungen durchgeführt werden.
Eine gängige Alternative zum Baermann-Trichter besteht darin, das Substrat direkt auf eine NGM-Platte zu legen und darauf zu warten, dass Würmer herauskriechen, was entweder sehr arbeitsintensiv ist oder zu einer unvollständigen Sammlung der Population führt. Es liefert auch Platten, die mit Milben und Insektenlarven kontaminiert sind. Die Baermann-Trichtermethode ist eine kostengünstige Low-Tech- und Low-Labor-Strategie, um die gesamte Population aktiver Würmer schnell von ihrem Substrat zu trennen.
Die Baermann-Trichtermethode ist nicht universell für die Sammlung aller Arten von wilden Nematoden anwendbar. Einige pflanzenbewohnende Nematoden brauchen viel länger als 12 h, um aus ihrem Substrat auszutreten, und fehlen in einem zu früh freigesetzten Tröpfchen, während einige Insektenparasiten eher an die Spitze des Trichters als an den Boden kriechen und sich ebenfalls der Sammlung entziehen14. Alternativen zum Baermann-Trichter erfordern entweder eine speziellere Ausrüstung oder mehr Arbeit, um die Würmer zu bergen. Sie können jedoch immer noch bevorzugt werden, wenn die oben genannten Vorbehalte ein Problem für das Experiment darstellen. Alternative Optionen, die von van Bezooijen14 überprüft wurden, umfassen die Trichtersprühmethode, die den Trichtern einen konstanten Wassernebel zur Verfügung stellt, Sauerstoff hinzufügt und den Überlauf von Bakterien in Suspension ermöglicht. Dies ermöglicht eine längere Extraktionsdauer von Nematoden aus Pflanzen. Die Blender-Zentrifugalflotationsmethode gewinnt langsam bewegende, inaktive oder nach oben kriechende Nematoden zurück, indem sie nach ihrem spezifischen Gewicht getrennt werden, der Oostenbrink-Elutriator wendet eine Unterströmung an, um sedimentierende Sedimente von suspendierten Nematoden zu trennen, und Cobbs Methode verwendet eine Reihe von Sieben, um Nematoden nach ihrer Größe, Form und Sedimentationsrate zu isolieren14. Um Rhabditiden zu sammeln, produziert der Baermann-Trichter jedoch effektiv saubere Proben schnell und mit minimalem Aufwand.

Wertvolle biologische Erkenntnisse zeichnen sich ab, da Forscher, die C. elegans im Labor untersuchen, ihren Fokus auf C. elegans und verwandte rhabditide Nematoden in freier Wildbahn ausdehnen. Studien an wilden Nematoden stellen Gene und Genome in ihren natürlichen Kontext und enthüllen Funktionen, die möglicherweise durch Laborbedingungen verdeckt werden1,2,3,4,5. Diese Studien liefern Erkenntnisse über die Voraussetzungen für die Evolution selbst, die genetische Variation6,7,8,9,10. Die natürliche genetische Variation, die von Wildproben erfasst wird, bietet auch Einblicke in die genetische Grundlage vieler komplexer Merkmale11,12,13.
Bei der Gestaltung von Studien, die die Isolierung natürlicher Populationen von Nematoden erfordern, insbesondere bei der Durchführung von Fernfeldarbeit, treten praktische Überlegungen in den Vordergrund. Dieses Protokoll zielt darauf ab, ganze Populationen aktiver Nematoden, die auf OP50 kultiviert werden können, aus Ködern oder wilden Substraten sauber zu isolieren. Die Methode eignet sich gut zur Extraktion freilebender Rhabditiden und Diplogasteriden, einschließlich Caenorhabditis, Oscheius und Pristionchus.
Es gibt viele Techniken, um Nematoden von ihren Substraten zu isolieren14,15. Der grundlegendste Ansatz besteht darin, das Substrat direkt auf eine Nematoden-medium-Platte zu legen und Tiere zu pflücken, während sie herauskriechen8,15. Diese Methode erfordert viel Zeit und Arbeit, wenn das Ziel darin besteht, alle Nematoden aus einer Probe zu isolieren. Ausgefeiltere Techniken nutzen das Gewicht, die Größe, die Mobilität oder eine Kombination davon der Tiere aus14. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile in Bezug auf Einrichtung und Durchsatz. Sie unterscheiden sich auch in ihren Stichprobenverzerrungen und können für bestimmte Nematoden selektieren, wenn die Tiere in der Probe entlang der Achse des Trennprinzips der Methode variieren.
Die Baermann-Trichtermethode wurde erstmals 1917 vom niederländischen Arzt G. K. T. F. Baermann beschrieben, der das Gerät auf Java erfand, während er bodenbewohnende Nematoden, einschließlich des parasitären Hakenwurms, untersuchte16. Der Baermann Funnel funktioniert nach dem Prinzip der Mobilität. Das Substrat wird in einen Trichter gegeben, der mit einem Stoff- oder Papierfilter ausgekleidet ist (für diese Studie wird ein "Kimwipe" verwendet, im aktuellen Protokoll als "fusselfreies Tuch" bezeichnet) und unten verschlossen verschlossen. Der Trichter wird dann mit Wasser gefüllt und taucht die Probe ein, während der Filter sie vom versiegelten Auslass trennt. Aktive Nematoden in der Probe geben sich selbst ins Wasser ab und schwimmen durch den Filter, wobei sie sich schließlich am Boden des Trichters absetzen. Der Trichterauslass wird geöffnet und ein Tropfen Nematoden wird auf eine Platte ausgestoßen (Abbildung 1).
<img alt="Zersetzungsprozess, Extraktion des Berlese-Trichters, Diagramm der Insektenisolierung, Aufbau einer entomologischen Studie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Zusammenfassung der Baermann-Trichtertechnik. (A) Sammeln einer bakterienreichen Probe von einer interessanten Stelle. (B) Die Probe wird in einen Baermann-Trichter getaucht und wartet darauf, dass sich Würmer herauswinden und sinken. (C) Loslassen eines einzelnen Tropfens aus dem Trichter. (D) Bewegen einzelner Hermaphroditen oder gepaarter Weibchen auf getrennte Platten. Illustration erstellt von Ramin Rahni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der Baermann-Trichter funktioniert nicht für jede Art von Nematoden (siehe Diskussionsabschnitt für spezifische Alternativen) und eignet sich am besten für diejenigen, die aktive Formen im Größenbereich von Caenorhabditis oder kleiner sind14. Wenn eine Studie jedoch den Baermann-Trichter nutzen kann, gibt es viele Vorteile. Die Methode ist praktisch im Feld und erfordert eine begrenzte Einrichtung, praktische Zeit und Kosten. Dem Forscher bleibt eine saubere Probe ohne die Behinderung des Substrats auf der Platte, was die Kommissionierung erleichtert. Die Verwendung eines Filters verhindert auch die Kontamination der Platte durch Insektenlarven oder Milben, die Platten kauen oder Nematoden in der Probe erbeuten. Am wichtigsten ist, dass der Baermann-Trichter effizient fast die gesamte Population aus dem Substrat extrahiert14, was je nach Studiendesign erforderlich sein kann. Zum Beispiel könnten Forscher, die daran interessiert sind, das Stadium oder die Geschlechtsverteilung wilder Populationen zu zählen, langsam wachsende oder seltene Genotypen zu finden oder Nematoden zu beproben, die nicht von OP50 angezogen werden, von dieser Methode profitieren. Dies ist für Forscher geeignet, die ökologische17, populationsgenetische18 oder metagenetische19 Fragen untersuchen, da das Stichprobenschema eine Momentaufnahme der Population zum Stichprobenzeitpunkt erstellt.
Das vorliegende Manuskript beschreibt ein vollständiges Protokoll zur Isolierung von Nematodenpopulationen unter Verwendung des Baermann-Trichters und zur Etablierung von Isofemale- und Isohermaphroditlinien im Feld unter Verwendung von Geräten, die für einen einfachen Transport ausgewählt wurden. Für Forscher, die Feldforschung in der Nähe ihrer Labore durchführen, können viele dieser Schritte weggelassen oder vereinfacht werden.

<table><tbody><tr><td>1 L Glasflasche</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Step 1 - Gefäß für die Herstellung von Plattenmedien</td></tr><tr><td>1 mL Pipettenspitzen</td><td>beliebig</td><td>NA</td><td>Step 1 - Dispensieren von Schneckenzusätzen und Saatplatten</td></tr><tr><td>1 mL Pipette</td><td>beliebig</td><td>NA</td><td>Step 1 - Dosieren von Schneckenzusätzen und Saatplatten</td></tr><tr><td>35 mm Schneckenplatten</td><td>Tritech</td><td>T3500</td><td>Step 1 - Schneckenplatten</td></tr><tr><td>4mm ID Gummischlauch</td><td>Fisher</td><td>14178A</td><td>Schritt 3 - Teil des Trichters</td></tr><tr><td>60 mm Schneckenplatten</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Stufe 1 - Schneckenplatten</td></tr><tr><td>65 mm Trichter</td><td>Fisher</td><td>22170156</td><td>Schritt 3 - Teil des Trichters</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Schritt 1 - Schneckenplatte mittel</td></tr><tr><td>Kochtopf</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stufe 1 - ein Wasserbad zum Schmelzen des Agars zum Gießen von Platten</td></tr><tr><td>E. coli Stamm OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td>Schritt 1 - Wurmfutter</td></tr><tr><td>Feldmikroskop</td><td>OMAX</td><td>G223CS</td><td>Schritt 6 - zum Betrachten von Würmern im Feld</td></tr><tr><td>Aufbewahrungstablett für Fläschchen</td><td>Azer Scientific</td><td>ES-260T</td><td>Schritt 3 - zum Bau einer Plattform für 12 Trichter</td></tr><tr><td>Kochplatte oder Herd</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Schritt 1 - zum Erhitzen des Wasserbades</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KimberlyClark</td><td>34120</td><td>Step 4 - Filter für die Trichter</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Step 1 - für den Anbau OP50</td></tr><tr><td>Feuerzeug</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Step 6 - sterilisieren Sie den Wurmpickel</td></tr><tr><td></td><td>Magnesiumsulfat Fisher</td><td>M63-500</td><td>Step 1 - Wurmplatte medium</td></tr><tr><td>NGM-lite Agar</td><td>USBiological</td><td>N1000</td><td>Step 1 - Wurmplatte medium</td></tr><tr><td>Parafilm M Wickelfolie</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td>Step 6 - Wurmplatten für die Reise verpacken</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasig</td><td>Fisher</td><td>BP363-500</td><td>Step 1 - Wurmplatte mittel</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasig</td><td>Fisher</td><td>P285-3</td><td>Step 1 - Wurmplatte medium</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Step 3 - Löcher für die Trichterschere</td></tr><tr><td></td><td>schneiden NA</td><td>NA</td><td>Schritt 3 - Gummischlauch abschneiden</td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Schritt 3 - Trichterhalter zusammenkleben</td></tr><tr><td>Schlauchschellen</td><td>Fisher</td><td>5869</td><td>Schritt 3 - Teil des Trichters</td></tr><tr><td>Wurmstocher</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Schritt 6 - zur Isolierung einzelner Würmer</td></tr><tr><td>Aufbewahrungsbeutel</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Schritt 2 - zum Einsacken einer Substratprobe</td></tr></tbody></table>

schnelle isolierung wilder nematoden durch baermann funnel

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Caenorhabditis elegans und seine Verwandten sind nicht nur robuste experimentelle Modellorganismen, sondern auch echte Tiere, die in der Natur leben. Studien an wilden Nematoden in ihrer natürlichen Umgebung sind wertvoll für das Verständnis vieler Aspekte der Biologie, einschließlich der selektiven Regime, in denen sich unverwechselbare genomische und phänotypische Charaktere entwickeln, der genetischen Grundlage für komplexe Merkmalsvariationen und der natürlichen genetischen Vielfalt, die für alle Tierpopulationen von grundlegender Bedeutung ist. Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Extraktion von Nematoden aus ihren natürlichen Substraten, einschließlich verrottender Früchte, Blumen, Pilze, Laubstreu und Erde. Die Baermann-Trichtermethode, eine klassische nematologische Technik, isoliert selektiv aktive Nematoden aus ihren Substraten. Da fast alle aktiven Würmer aus der Probe gewonnen werden, ermöglicht die Baermann-Trichtertechnik die Wiederherstellung seltener und langsam wachsender Genotypen, die zusammen mit reichlich vorhandenen und schnell wachsenden Genotypen auftreten, die bei Extraktionsmethoden, die mehrere Generationen der Fortpflanzung beinhalten, übersehen werden könnten. Die Technik eignet sich auch gut, um metagenetische, populationsgenetische und ökologische Fragen zu beantworten. Es erfasst die gesamte Population gleichzeitig in einer Stichprobe und ermöglicht so einen unvoreingenommenen Blick auf die natürliche Verteilung von Alter, Geschlecht und Genotypen. Das Protokoll ermöglicht den Einsatz im großen Maßstab im Feld, die schnelle Umwandlung von Substraten in Schneckenplatten, und die Autoren haben es durch Feldforschung auf mehreren Kontinenten validiert.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um Nematoden aus Früchten, Blüten, Pilzen, Erde und Stängeln auf Barro Colorado Island, Panamá, an der Feldstation des Smithsonian Tropical Research Institute im August 2018 zu isolieren. Von 131 Substraten, die von einem einzigen Prüfarzt über vier Tage verarbeitet wurden, ergaben 130 Substrate (99,2%) Nematoden. Vierundvierzig der Substrate (33,6%) ergaben Caenorhabditis-Nematoden (Abbildung 5). Die anschließende Analyse von Kulturen, die aus diesen vierundvierzig Substraten durch PCR und Paarungstests ermittelt wurden23, ergab das Vorhandensein von sechs verschiedenen Caenorhabditis-Arten – C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. 57 und C. panamensis.
Dieses Protokoll wurde erneut verwendet, um Nematoden aus verschiedenen Substraten in der Tschernobyl-Sperrzone, Ukraine, an vier Tagen im August 2019 zu isolieren. Lebende Würmer wurden aus 62 von 63 Bodenproben, 1 von 17 wirbellosen Proben, 31 von 75 Fruchtproben, 1 von 12 Köderproben (siehe Diskussionsabschnitt) geborgen, und es wurden keine Würmer aus Pilz-, Flussschilf- oder Wolfskotproben (jeweils eine Probe entnommen) geborgen. Die anschließende Sequenzierung von 18S ribosomaler DNA15 identifizierte diese Nematoden als Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus und Pelodera, aber es wurde keine Caenorhabditis identifiziert (Abbildung 5).
<img alt="Balkendiagramm der Nematoden- und Caenorhabditis-Proben in Panama, Ukraine nach Standort und Prozentsatz der Sammlungen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5: Erfolgsquoten von zwei Sammelreisen. Panama 2018 (links) und Ukraine 2019 (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur effizienten Extraktion lebender Nematoden aus natürlichen Substraten im Feld.

Schnelle Isolierung wilder Nematoden durch Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Caenorhabditis nematoden sind echte Tiere, die in der Natur leben. Das Sammeln wilder Nematoden ermöglicht es uns, Gene und Genome in ihrem natürlichen Kontext zu untersuchen und Funktionen aufzudecken, die durch die künstlichen Bedingungen des Labors verdeckt werden können. Diese Technik extrahiert Würmer aus bakterienreichen organischen Substraten im Feld und erzeugt saubere Kulturen auf Petrischalen, wobei eine Momentaufnahme jeder Population zum Zeitpunkt der Sammlung erfasst wird.Diese Populationen eignen sich gut für Fragen der Ökologie, Populationsgenetik oder Metagenetik. Wilde Stammkulturen sind auch wertvoll für quantitative genetische Studien. Diese Technik ist einfach und leicht auszuführen, auch für einen Feldforschungsanfänger.Eine erfolgreiche Sammelreise erfordert jedoch eine sorgfältige Vorbereitung der Materialien vor der Reise. Identifizieren Sie ein bakterienreiches Substrat auf dem Feld, wie verrottende Früchte, Blumen, Pilze, Stängel krautiger Pflanzen, Erde oder Laubstreu. Legen Sie ein kleines Volumen des Substrats in eine beschriftete Plastiktüte.Wenn verrottendes Material auf der Feldseite von Interesse selten ist, legen Sie etwas Obst als Köder. Lassen Sie es felsen, holen Sie es dann und alle Würmer, die es besiedelt haben. Notieren Sie die Proben-ID, den Breitengrad, den Längengrad, das Datum und die Beschreibung des Substrats.Zeichnen Sie alle anderen lokalen Umweltmessungen auf, die für das Experiment relevant sind, z. B. Umgebungs- und Substrattemperatur, Substratzustand, Zeitpunkt der Sammlung und Vorhandensein von substratassoziierten Makroinvertebraten. Verwenden Sie eine Schere, um ein drei Zentimeter langes Segment aus Gummischläuchen aus jedem Trichter zu schneiden. Passen Sie den Schlauch über das Ende eines Kunststofftrichters an.Schieben Sie eine Schlauchschelle über den Gummischlauch und klemmen Sie ihn zu. Um einen Trichterhalter zu machen, schneiden Sie kreisförmige Löcher in der Mitte eines entfalteten Pappfliegen-Vile-Tabletts. Drehen Sie den Karton um, falten Sie die Seiten einmal nach oben und kleben Sie sie zusammen.Dadurch entstehen Beine, die die Löcher über die Bank heben. Stellen Sie sicher, dass sich die Schlauchklemmen in der geschlossenen Position befinden, und platzieren Sie Trichter in den Löchern. Gießen Sie steriles Wasser in jeden Trichter und füllen Sie es etwa drei Zentimeter unter dem Rand.Tippen Sie auf den Trichter, um eingeschlossene Luftblasen im Schlauch freizugeben. Falten Sie ein fusselfreies Wischen in zwei Hälften, um ein Quadrat zu bilden, und legen Sie es über den Trichter. Drücken Sie dann das Tuch nach unten, um es ins Wasser zu tauchen.Brechen Sie manuell alle großen festen Stücke des natürlichen Substrats auf. Legen Sie vorsichtig einen Teil der Probe auf das Tuch im Trichter. Achten Sie darauf, das Tuch nicht zu durchstechen oder eine Probe über den Rand hinausragen zu lassen.Falten Sie die Ecken des Tuchs vorsichtig über die Probe, um zu verhindern, dass Wasser über den Rand des Trichters ableitet. Beschriften Sie den Trichter mit der Beispiel-ID, die den Feldsammlungsnotizen entspricht. Wählen Sie alle aktiven Insekten oder andere Tiere aus, die reisen und Proben kreuzkontaminieren können.Fügen Sie jedem Trichter mehr Wasser hinzu, um die gesamte Probe einzutauchen. Während der Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht wackeln aktive Nematoden durch das Gewebe und sinken auf den Boden des Trichters. Schreiben Sie die Proben-ID eines Trichters auf den Boden einer sechs Zentimeter langen NGM-Wurmplatte, die mit einem Fleck von OP50 E. coli-Bakterien sitzt.Entfernen Sie den Deckel von der Platte, entfernen Sie den Trichter, der die Probe aus dem Trichterständer enthält, und halten Sie ihn mit einer Hand aufrecht über der offenen Wurmplatte. Lösen Sie mit der anderen Hand den Druck auf die Schlauchschelle und lassen Sie ein oder zwei Tropfen Wasser vom Schlauch auf die Schneckenplatte neben dem Bakterienrasen fallen. Sobald das Wasser aus dem Trichter fällt, klemmen Sie es schnell wieder zu, um ein Überfluten der NGM-Platte zu verhindern.Um aufzuräumen, werfen Sie den Inhalt der Trichter weg und waschen Sie sie mit heißem Wasser zur späteren Wiederverwendung. Beobachten Sie die isolierten Nematoden unter dem Stereomikroskop. Neben Nematoden gibt es gelegentlich kleine Oligo-Kit-Anneliden, Bärtierchen, Rädertierchen und kleine Krebstiere.Um ISO-Hermaphrodit oder ISO-Weibchenlinien zu erstellen, übertragen Sie jeden L4-Hermaphroditen oder jedes gepaarte erwachsene Weibchen auf eine separate 3,5-Zentimeter-NGM-Platte, die mit OP50 sitzt. Sterilisieren Sie den Wurmpickel vor und nach jedem Transfer. Zum Schluss wickeln Sie die Teller gründlich für die Reise mit einem Paraffinfilm ein.Auf der Insel Barro Colorado Panama wurden 2018 131 Substrate mit dieser Methode verarbeitet. 99% davon ergaben Nematoden. 34% ergaben Caenorhabditis nematoden.In der Tschernobyl-Sperrzone Ukraine wurden 2019 170 Substrate nach dieser Methode verarbeitet. 56% davon ergaben Nematoden, von denen keiner Caenorhabditis war. Diese Methode funktioniert, weil die Nematoden durch das Tuch schwimmen.aber das Substrat und andere Tiere bleiben oben. Viele Aspekte eines Protokolls können geändert werden, um die im Feld verfügbaren Ressourcen zu nutzen. Proben, die mit dieser Methode gesammelt wurden, ermöglichen es den Forschern, eine breite Palette von populationsbiologischen Fragen in etablierten Kulturen für nachfolgende Laborstudien zu behandeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

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Dieses Protokoll kann verwendet werden, um groß angelegte ökologische Untersuchungen von sich selbst lebenden Caenorhabditis-Nematoden durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die effiziente Organisation und Analyse von ökologischen und molekularen Daten, die mit den aus der Natur gesammelten Nematoden verbunden sind.

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Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

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Schnelle Isolierung wilder Nematoden durch Baermann Funnel

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