Generierung eines Hakenischämie-Reperfusionsmodells unter Verwendung eines dreitägigen Kükenembryo

Hallo, ich bin Dr. Syed Shadab Raza, der leitende Forscher für das Labor für Stammzellen und restaurative Neurologie, das sich an der Abteilung für Biotechnologie am Era University Campus in Lucknow, Indien, befindet. In meinem Labor bemühen wir uns, den pathophysiologischen Mechanismus zu verstehen, der Ischämie-Reperfusionsstörungen zugrunde liegt, und die Interventionen, die diese Prozesse umkehren können. In diesem Zusammenhang verwenden wir häufig das in vitro und das in vivo Modell des ischämischen Schlaganfalls.

Vor kurzem haben wir ein ischämisches Reperfusionsverletzungsmodell in einem dreitägigen Sich entwickelnden Kükenembryo erstellt. Jetzt werden meine Schüler Ihnen zeigen, wie Sie die Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem sich drei Tage entwickelnden Kükenembryo replizieren können. Jetzt zeigen wir Ihnen, wie Sie Ischämie-Reperfusion in einem dreitägigen Kükenembryo erzeugen können.

Unser Modell ist kostengünstig, zeiteffizient und hoch reproduzierbar. Also lasst uns loslegen. Erster Tag.

Anforderungen für den ersten Tag. Verfahren. Reinigen Sie das Zero-Day-Ei mit 70% Ethanol mit Seidenpapiertüchern. Als nächstes schreiben Sie den aktuellen Tag, datum, auf Eier mit OHP-Marker und legen Sie dann die Eier in einen Eierinkubator mit einer Temperatur von 36 bis 37 Grad Celsius und 60 bis 65% Luftfeuchtigkeit.

Bebrüten Sie die Eier für die nächsten 24 Stunden. Zweiter Tag. Voraussetzungen für den zweiten Tag. Verfahren.

Wischen Sie die chirurgische Schere mit 70% Ethanol oder gefolgt von einem Autoklaven ab. Nach 24 Stunden Inkubation das Ei zur Schichtung aus dem Inkubator nehmen. Als nächstes befestigen Sie ein kleines Stück Sellotape etwa einen Zoll Länge und Breite an der Kante des Eies und machen Sie dann ein kleines Loch in den Rand der Eierschale mit der scharfen Spitzenrandschere, gefolgt von einem Einsetzen einer Fünf-ml-Spritze in einem Winkel von etwa 75 Grad.

Nachdem Sie die Nadel in den Dottersack eingeführt haben, ziehen Sie langsam fünf bis sechs ml Albumin ab. Nachdem Sie das Albumin entfernt haben, verschließen Sie das Loch erneut mit Sellotape und geben Sie das Ei für die nächsten 48 Stunden wieder in den 37 Grad Celsius schweren Ei-Inkubator. Vierter Tag.

Voraussetzungen für den vierten Tag. Verfahren. Bereiten Sie die Ringer-Lösung, 0,9% normale Kochsalzlösung und eine X-Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung gemäß den Tabellen in diesem Manuskript vor. Dann autoklavieren Sie die drei Lösungen.

Nach dem Autoklaven können die jeweiligen Lösungen bei Raumtemperatur platziert werden. Als nächstes nehmen Sie das Ei aus dem 37-Grad-Ei-Inkubator heraus. Bevor Sie nun die Schale schneiden, bedecken Sie den Bereich der Fenster mit Sellotape.

Und jetzt machen Sie ein kleines Loch auf die Eierschale und beginnen Sie, eine kreisförmige Öffnung zu schneiden. Dieser Vorgang wird als Windowing bezeichnet. Stellen Sie sicher, dass der kreisförmige Schnitt groß genug ist, damit der Embryo aus jeder Richtung leicht zugänglich ist, da die Positionierung des Eies möglicherweise entsprechend der Position des Embryos angepasst werden muss.

Lokalisieren Sie nun mit einem Stereozoom-Operationsmikroskop die richtige Vitallinienarterie oder RVA. Hier zeigt der Pfeil das dreitägige Entwicklungsstadium des Embryos an. Sobald die RVA lokalisiert ist, machen Sie mit einer 26 G Nadel zwei kleine Löcher auf der linken und rechten Seite der RVA.

Als nächstes stellen Sie die Doppler-Blutfluss-Bildgebungssonde auf die RVA ein. Die Doppler-Blutfluss-Bildgebungssonde sollte fünf plus minus einen Millimeter von der Stelle der Ischämie und zwei Drittel vom distalen Ende der RVA entfernt platziert werden. Nehmen Sie die Flussmessung nach Belieben für 30 Sekunden bis zwei Minuten vor.

Dies wird die Normoxie-Phase ablesen. Formen Sie nun den Rand der Spinalnadel manuell, um der Kante mit Hilfe einer Nasenzange gefolgt von einer Zahnzange eine Hakenform zu geben. Führen Sie nun mit einem Mikromanipulator die Spinalnadel direkt unter der rechten Vitallinienarterie ein.

Sie sind bereit, die Spinalnadel anzuheben. Heben Sie nun mit Hilfe des Mikromanipulators die Arterie langsam an, bis der Doppler-Blutflussfluss eine minimale Abnahme des arteriellen Flusses um 80% zeigt. Sobald ein Drop von 80% oder mehr im Dopplerfluss erreicht ist, lassen Sie die Spinalnadel nach oben angehoben und ziehen Sie die Arterie fünf Minuten lang.

Dies wird die Periode der Ischämie sein. Nach diesem ischämischen Timing von fünf Minuten lassen Sie die Arterie mit Hilfe eines Mikromanipulators langsam frei, um den normalen Blutfluss wiederherzustellen. Jetzt sollte der Doppler-Blutflussmesser Messwerte anzeigen, die denen ähneln, die während der Normoxie beobachtet wurden.

Dies wird die Periode der Reperfusion in der RVA sein. Nach dem I / R-Prozess tragen Sie zwei, drei Tropfen 1X PBS auf den Embryo auf. Zum Schluss das Fenster mit Sellotape wieder verschließen und das Ei dann für fünf Stunden und 55 Minuten wieder in den Eierinkubator legen.

Nach fünf Stunden und 55 Minuten das Ei aus dem Eierinkubator herausnehmen und auf die Eierschale legen und das Fenster wieder öffnen. Behandlungsanforderungen. Verfahren. Für die Behandlung der Arterien mit den Medikamenten, Aktivatoren oder Inhibitoren sollte die RVA nach einer Stunde I / R-Prozess herausgeschnitten werden.

Entfernen Sie den Embryo aus der Schale, indem Sie ihn aus der Schale auf eine sterile 100 mm Petrischale nehmen. Sobald der Embryo in der Petrischale freigesetzt wurde, schneiden Sie die RVA mit der Augeniris unter Führung des Stereozoom-Operationsmikroskops aus. Das Exzisionsmaß von RVA sollte bis zu 15 plus minus einen Millimeter distal vom Rumpf und zwei plus minus einen Millimeter zum Rumpf betragen.

Nachdem Sie den RVA herausgeschnitten haben, waschen Sie ihn mit 1X PBS in einer neuen, sterilen Petrischale. Für gewünschte Behandlungen legen Sie die Arterie in ein sterilisiertes 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen, das mit 500 Mikrolitern Ringers Lösung gefüllt ist. Und nachdem Sie die Arterie in das Zentrifugenröhrchen gelegt haben, legen Sie es für fünf Stunden in den 37 Grad Celsius Laborinkubator.

Nehmen Sie nach fünf Stunden Inkubation die RVA aus dem 37 Grad Celsius-Laborinkubator heraus und fahren Sie mit den gewünschten Behandlungen fort. Und nun, um die Ergebnisse zu präsentieren. Um den Nutzen unseres Modells in der ischämischen Reperfusionsforschung in ischämischen Arterien zu überprüfen, untersuchten wir zunächst die Aktivitäten der sauerstoffregulatorischen Proteine 150 oder ORP150, der zytoplasmatischen Superoxiddismutase eins oder SOD1 und der Katalase.

Die I/R-behandelten RVAs zeigten eine erhöhte Aktivität von ORP150, zytoplasmatischem SOD1 und Katalase im Vergleich zur Kontrollgruppe, jedoch reduzierte die Ergänzung mit N-Acetyl-L-Cystein oder NAC, einem ROS-Quencher, den oxidativen Stress in der I/R-Gruppe, wie in der aktuellen Zahl ersichtlich ist. Um den Nutzen dieses Modells für entzündliche Untersuchungen zu ermitteln, untersuchten wir die Expression von I/R-1 beta und TNF-alpha in I/R-behandelten RVAs im Vergleich zu Kontroll-RVAs. Beide Interleukine wurden in der Hook-I/R-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe überexprimiert.

Die Supplementierung von Naringenin, einem entzündungshemmenden Medikament, reduzierte signifikant die Spiegel von IL1-beta sowie TNF-alpha. Als nächstes untersuchten wir die Expression von NLRP3 und NF-kappa beta durch Western Blotting. Diese Analyse ergab Hinweise auf die Aktivierung des NLRP3-Inflamasoms sowie von NF-kappa beta als Reaktion auf die in der RVA erzeugte I/R.

Ähnlich wie bei früheren Ergebnissen reduzierte Naringenin die Expression von NLRP3 und NF-kappa beta. Diese Ergebnisse zeigten, dass unser Modell zur Untersuchung entzündlicher Veränderungen verwendet werden kann. Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von I / R auf Apoptose- und Autophagiewege.

Zuerst haben wir in Abbildung A auf den Ausdruck der gespaltenen Caspase-3 zugegriffen. Wir beobachteten eine verbesserte Expression von gespaltener Caspase-3 in der I/R-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, während die I/R-Gruppe, die ZVADFMK erhielt, eine Abnahme der Expression von Caspase-3 zeigte. In ähnlicher Weise wies die I/R-Gruppe für die Autophagie hohe Proteinspiegel von LC3, dem Autophagosom-Marker Beclin-1, einem Schlüsselregulator der Autophagie in Säugetierzellen, und ATG-7, einem für die basale Autophagie benötigten Protein, auf als die Kontrollgruppe, während die Gruppen, die 3-ma, einen Autophagie-Inhibitor, erhielten, eine Abnahme der Expression der oben genannten drei Autophagieproteine zeigten. wie aus den Abbildungen B bis D hervorgeht.Die Abbildung E zeigt die Wirkung von Hook-vermittelter I/R auf ambra-1- und ATG-7-mRNA-Spiegel.

Diese Ergebnisse stimmten mit den vorherigen Ergebnissen überein, d.h. es wurde eine verbesserte mRNA-Expression für Ambra-1 und ATG-7 in I/R-behandelten RVAs im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen beobachtet. Die Ergebnisse wurden jedoch umgekehrt, als 3-ma zur I / R-Gruppe hinzugefügt wurde. Die aktuelle Zahl stellt die Wirksamkeit unseres Modells zur Untersuchung der Veränderungen in der DNA dar.

Wir beobachteten einen intensiven DNA-Abstrich in der mit I/R behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Ergänzung von NAC zur I/R RVA-Gruppe kehrte das Ergebnis jedoch um. Um zu untersuchen, wie effektiv unser Modell im Gegensatz zu anderen Modellen ist, haben wir die Daten verglichen, die von unserem Hook-I/R-Modell und dem MCAO-Modell im vorliegenden Experiment generiert wurden.

Kurz gesagt, die Expression des apoptotischen Proteins, gespaltene Caspase-3, der Autophagieproteine Beclin-1 und ATG-7 und der entzündlichen Interleukine, TNF und IFN, musste in I / R-behandelten RVAs höher sein als in Kontroll-RVAs. Interessanterweise lieferte das Hook-I / R-Modell Ergebnisse, die denen des MCAO-Modells sehr ähnlich waren, sei es die Analyse auf entzündlichen Stress oder zelluläre Todeswege. Unser Modell kann für routinemäßige Ischämie-Reperfusionsexperimente verwendet werden, entweder allein oder parallel zu den bestehenden Modellen.

Während der Nachahmung der Ischämie-Reperfusion sollte jedoch eine höchste Vorsichtsmaßnahme beim Bohren, der rechten und linken Seite der RVA, und auch beim Verschließen oder Freigeben der RVA getroffen werden, so dass sie keine Arterien oder Venen schädigen sollte. In der routinemäßigen Molekularbiologie wie Western Blotting, QRT-PCR-Analysator, chemischen Säuren und bildgebenden Verfahren könnten improvisiert werden, um Pathophysiologie im Zusammenhang mit der Ischämie-Reperfusion in einem sich drei Tage entwickelnden Kükenembryo zu assoziieren. Dieses Modell könnte effizient verwendet werden, um die molekulare Mechanik auf DNA-, RNA- und Proteinebene zu untersuchen.

Wie wir Ihnen gezeigt haben, die I / R-Modellierung in einem dreitägigen sich entwickelnden Kükenembryo, glauben wir, dass unser Modell neue Wege auf dem Gebiet der I / R-Forschung eröffnen wird. Mit dieser Arbeit wünsche ich Ihnen alles Gute für Ihre Experimente. Vielen Dank.