Raumzeitliche subzelluläre Manipulation des Mikrotubuli-Zytoskeletts im lebenden Präimplantations-Mausembryo mittels Photostatinen
30. November 2021
Typische Mikrotubuli-Inhibitoren, die in der Grundlagen- und angewandten Forschung weit verbreitet sind, haben weitreichende Auswirkungen auf Zellen. In jüngster Zeit haben sich Photostatine zu einer Klasse von photoschaltbaren Mikrotubuli-Inhibitoren entwickelt, die in der Lage sind, mikrotubuli augenblicklich, reversibel, räumlich-zeitlich präzise zu manipulieren. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt die Anwendung von Photostatinen in einem 3D-lebenden Präimplantations-Mausembryo.
Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Photostatine auf den lebenden Präimplantationsmausembryo anwendet und die Verwendung von lichtschaltbaren Medikamenten auf anderen physiologischen 3D-Systemen berücksichtigt. Lichtschaltbare Photostatine ermöglichen die Manipulation des Mikrotubuli-Wachstums in Raum und Zeit und können wieder in einen Aus-Zustand umgewandelt werden. Unbeabsichtigtes Aussetzen von Photostatinen gegenüber blauem Licht vor dem Experiment kann sie vorzeitig aktivieren.
Daher empfehlen wir, bei der Vorbereitung Ihrer Proben jederzeit in völliger Dunkelheit oder bei rotem Licht zu arbeiten. Unter strengen dunklen Bedingungen, bei denen nur rotes Licht zur Beleuchtung verwendet wird, beginnen Sie mit der Herstellung von Vorrats- und Zwischenarbeitslösung von PST-1P in Reinstwasser. Wie im Textmanuskript beschrieben.
Verdünnen Sie dann PST-1P in frischem KSOM, um die Endkonzentration von 40 zu erreichen, M.To bereiten Sie den Kammerobjektträger für die Live-Bildgebung vor, fügen Sie 10 L PST-1P-behandeltes KSOM in die Mitte eines Brunnens hinzu, um ein halbkugelförmiges Tröpfchen zu bilden. Um zu verhindern, dass das Tröpfchen verdunstet, bedecken Sie es mit ausreichend Mineralöl. Wickeln Sie dann die vorbereitete Kulturschale lose in Folie oder legen Sie die Kulturschale in einen nicht luftdichten, undurchsichtigen Behälter im Inkubator, um sicherzustellen, dass keine Lichteinwirkung erfolgt.
Stellen Sie nach dem Transfer der Embryonen in den PST-1P-behandelten KSOM-Tropfen sicher, dass die Embryonen in der Mitte des Tröpfchens gruppiert und auf dem Boden der Schale abgelegt werden. Sobald die Tauchobjektivlinse vorbereitet ist, montieren Sie den Kammerschieber auf dem Mikroskop in einer Umgebungskammer. Auf 37 ° C und 5% CO2 eingestellt und in völliger Dunkelheit, um sicherzustellen, dass sich alle PST-1Ps in der inaktiven Transkonfiguration befinden und dass Embryonen auf den Boden der Schale sinken können.
Verwenden Sie eine Rotlichtlampe, um die Objektivlinse in Kontakt mit dem Tauchmedium zu positionieren. Suchen Sie dann den Rand des Tröpfchens des Mediums und positionieren Sie das Objektiv direkt darüber. Mit dem Live-Scanning-Modus und einem 561-nm-Laser lokalisieren Sie die Embryonen im Tröpfchen.
Verwenden Sie Bühnencontroller und Live-Scanning-Modus, um die Start- und Endpunkte für die Aufnahme eines Z-Stacks des gesamten Embryos festzulegen. Passen Sie die Laserleistungseinstellungen bis zu maximal 5% entsprechend Ihrem Signal an. Und stellen Sie den digitalen Offset auf maximal 0,900 ein, entsprechend Ihrem Signal, um das Aussehen der EB3-dTomato-Kometen zu optimieren.
Minimieren Sie Hintergrundgeräusche. Stellen Sie das Loch auf 2 m. Pixelauflösung bei 512 x 512.
Und die Pixelverweilzeit liegt bei 3,15 s. Und stellen Sie den Zoom auf 2x ein. Erwerben Sie einen Z-Stapel des gesamten Embryos mit 1 m Abschnittsintervallen, um die Bereiche des Mikrotubuliwachstums im gesamten Organismus zu beurteilen.
Öffnen Sie für EB3-dTomato-Kometenverfolgungsexperimente das 3D-Z-Stack-Bild und erhöhen Sie den Zoom auf das Dreifache. Und zeichnen Sie einen rechteckigen ROI um den spezifischen subzellulären Bereich von Interesse. Erfassen Sie dann den Zeitrafferfilm einer einzelnen Z-Ebene unter Verwendung der eingestellten Parameter mit einem Zeitintervall von 500 ms.
Um PST-1P zu aktivieren, wechseln Sie zu einem 405-nm-Laser und erfassen Sie einen weiteren Zeitraffer, wobei der Laser auf 10% Leistung eingestellt ist, Lochblende maximal geöffnet ist, Pixelauflösung von 512 x 512, die Pixelverweilzeit von 3,15 s, Zoom von dreimal, in einem Zeitintervall von 500 ms, und stellen Sie 20 Bilder ein, die erfasst werden sollen. Wechseln Sie unmittelbar nach der Aktivierung zurück zum 561-nm-Laser und wiederholen Sie die Erfassung, wie zuvor gezeigt, um den Verlust von EB3-dTomato-Kometen nach der Aktivierung von PST-1P zu bestätigen. Um PST-1P nun wieder in seinen inaktiven Trans-Zustand zu versetzen, schalten Sie einen 514-nm-Laser ein und erfassen Sie einen weiteren Zeitraffer mit festgelegten Parametern.
Um die Wiederherstellung von EB3-dTomato-Kometen zu visualisieren, wechseln Sie zurück zu einem 561-nm-Laser und wiederholen Sie die Erfassung. In unbehandelten Kontrollembryonen war das EB3-dTomato-Signal vor der Beleuchtung mit einem 405-nm-Laser im gesamten Zytoplasma der Zelle mit Ausnahme des Kernbereichs hoch. Nach der Beleuchtung wurden Veränderungen im Signal nicht erkannt.
Dies deutet darauf hin, dass der 405-nm-Laser keine Photoschäden am Embryo oder die Mikrotubulidynamik verursacht hat. Während der PST-1P-Behandlung von Embryonen im 16-Zellstadium unter strengen dunklen Bedingungen wurde im 3D-Bild eine starke EB3-dTomato-Expression festgestellt, was zeigt, dass inaktives PST-1P keine Hemmung der Mikrotubulipolymerisation unter dunklen Bedingungen hervorruft. Vor der Aktivierung von PST-1P bestätigte die Zeitraffer-Bildgebung einer einzelnen Z-Ebene eine starke EB3-dTomato-Expression und Mikrotubuli-Polymerisation in einer subzellulären Region.
Nach 405 nm Lichtaktivierung wurde innerhalb von Sekunden eine Verringerung des EB3-dTomato-Kometensignals festgestellt. Und die Wiederherstellung des Signals wurde bei der Deaktivierung von PST-1P mit einem 514-nm-Laser erreicht. Die Embryonen, die mit EB3-dTomato mikroinjiziert und mit PST-1P inkubiert wurden, zeigten ein normales embryonales Potenzial und entwickelten sich bis zum Blastozystenstadium.
Und normale Mikrotubuli-Dynamik während der Mitose. Anzeige der Nichttoxizität eines aktiven PST-1P für den Embryo. In den erworbenen Zeitrafferfilmen erschien die EB3-dTomato-Etikettierung als kometenartige Strukturen und ermöglichte die Verfolgung wachsender Mikrotubuli-Filamente.
In PST-1P-behandelten Embryonen, die unter dunklen Bedingungen gehalten wurden, gingen einzelne EB3-dTomato-Kometen von der Interphasenbrücke aus, die im frühen Mausembryo als nicht-zentrosomales Mikrotubuli-Organisationszentrum fungiert. Ein T-Stack zeigt EB3-dTomato-Kometen im Bereich der Interphasenbrücke. Nach der Aktivierung von PST-1P wurden EB3-dTomato-Kometen an der Basis der Interphasenbrücke und im t-Stack reduziert.
Denken Sie daran, dass weißes Licht PST-1P vorzeitig aktivieren kann. Verwenden Sie also nur rote Lichtquellen für die Sichtbarkeit. Grünes Licht deaktiviert auch PST-1P, also vermeiden Sie bitte die Verwendung von grün fluoreszierenden Etikettenmarkierungen.
Diese Technik wurde in Drosophila, Amöben, Mäusen und mehreren In-vitro-Systemen eingesetzt, um das Wachstum von Mikrotubuli zu bekämpfen, um die Zellmigration und die Gewebebildung zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt die Verwendung von Photostatinen zur Beeinflussung von Mikrotubuli in lebenden präimplantationsfähigen Maus-Embryonen vor. Es unterstreicht die Bedeutung der Lichtbedingungen während der Probenvorbereitung, um eine vorzeitige Aktivierung der Photostatine zu verhindern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Mikrotubuli-Inhibitoren werden in der Forschung häufig eingesetzt.
- Photostatine sind eine neue Klasse von photoschaltbaren Mikrotubuli-Inhibitoren.
- Sie ermöglichen eine präzise räumliche und zeitliche Kontrolle der Mikrotubuli-Dynamik.
- Die Anwendung in 3D-physiologischen Systemen ist ein neuartiger Ansatz.
Zweck der Studie
- Anwendung von Photostatinen in lebenden präimplantationsfähigen Maus-Embryonen.
- Untersuchung der gezielten Beeinflussung des Mikrotubuli-Wachstums mittels lichtschaltbarer Wirkstoffe.
- Entwicklung von Protokollen für die Verwendung von Photostatinen unter Dunkelbedingungen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Stammlösungen und Arbeitslösungen von PST-1P in ultrareinem Wasser.
- Durchführung der Experimente vollständig im Dunkeln oder unter rotem Licht.
- Anwendung von lichtschaltbaren Photostatinen zur Beeinflussung von Mikrotubuli.
- Überwachung der Auswirkungen der Lichtexposition auf die Aktivierung von Photostatinen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Manipulation der Mikrotubulusdynamik in lebenden Embryonen.
- Nachweis der Bedeutung von Lichtbedingungen in Experimenten.
- Entwicklung eines neuen Protokolls zur Anwendung von Photostatinen in 3D-Systemen.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die reversiblen Kontrolle des Mikrotubuluswachstums.
Schlussfolgerungen
- Photostatine sind wirksam für die präzise Manipulation von Mikrotubuli.
- Die Arbeit unter dunklen Bedingungen ist entscheidend für den experimentellen Erfolg.
- Diese Methode eröffnet neue Ansätze zur Untersuchung der Dynamik von Mikrotubuli in verschiedenen biologischen Kontexten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die präzise räumliche und zeitliche Kontrolle der Mikrotubulusdynamik ermöglicht eine mechanistische Entschärfung in der frühen Zielvalidierung, indem zytoskelettale Beiträge zu zellulären Phänotypen isoliert werden. Dieser Ansatz unterstützt ein vorhersagebasiertes Vertrauen in die phänotypische Bildschirmidentifizierung, da er eine reversiblen, subzelluläre Störung ohne globale Zytotoxizität ermöglicht. Der Einsatz in 3D-physiologischen Systemen wie Embryonen erhöht die translationale Relevanz für die Entschärfung von Wirkstoffkandidaten, die zytoskelettale Signalwege anvisieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung mikrotubulusabhängiger Mechanismen in phänotypischen Assays durch lichtgesteuerte, reversible Inhibition.
- Operativer Wert: Bietet ein nicht-toxisches, photoschaltbares Werkzeug zur Validierung subzellulärer Zielstrukturen in lebenden 3D-Modellen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Isolierung zytoskelettaler Variablen in komplexen biologischen Kontexten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Herstellung standardisierter, lichtgesteuerter Systeme zur Mikrotubuli-Störung für reproduzierbare Wirkstoff-Screenings.
- Operationeller Wert: Gewährleistet die Bereitschaft des Assays durch handhabungsbedingte Dunkelbedingungen und präzise Parameter der Lichtaktivierung.
- Skalierbarkeit: Unterstützt die Wiederverwendung der Plattform in 3D-Modellen wie Organoiden und Blastoiden für Untersuchungen zur Wechselwirkung mit zytoskelettalen Zielstrukturen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert krankheitsrelevante zytoskelettale Manipulationen in Säugetierembryonen und unterstützt dadurch die Validität präklinischer Modelle.
- Operativer Wert: Schafft Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Anwendung durch reversible, nicht-störende Modulation der Mikrotubuli.
- Risikominderung: Bestätigt die Nicht-Toxizität aktiver Photostatine in sich entwickelnden Embryonen und verringert damit mechanistische Unschärfen in der Sicherheitsbewertung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in die Entdeckungsbiologie zur Überprüfung von Zielhypothese, ermöglicht die Assay-Entwicklung für zytoskelettale Zielstrukturen und unterstützt translationsorientierte Forschung durch reversibele Mikrotubuli-Manipulation in 3D-Systemen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem präzise, reversible Untersuchungen der Mikrotubulusdynamik in lebenden Embryonen ermöglicht werden.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch definierte Protokolle zur Lichtaktivierung/-deaktivierung und gezielte Ansteuerung subzellulärer ROI-Bereiche.
- Analytik: Bietet quantitative Auswertungen mittels EB3-dTomato-Kometen-Tracking zur Messung der Mikrotubulus-Polymerisationsdynamik.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch nachgewiesene Blastozystenbildung und normale Mitose nach der Behandlung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert Photostatine als wiederverwendbare, schaltbare Plattform zur Validierung zytoskelettaler Zielstrukturen in dreidimensionalen physiologischen Systemen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuversicht bei der Target-Validierung durch reversibele, räumlich-zeitliche Mikrotubuli-Störung.
- Operativer Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch strikte Handhabung der Lichtbedingungen und definierte Laserparameter.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung von unspezifischen zytoskelettalen Effekten beim phänotypischen Screening.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung zytoskelettaler Targets unter Verwendung nicht-toxischer, reversibler Modulation in embryo-basierten Modellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Live-Cell-Konfokalmikroskopie und im Umgang mit photoschaltbaren Verbindungen.
- Benötigt Lasersysteme, die Wellenlängen von 405 nm (Aktivierung), 514 nm (Deaktivierung) und 561 nm (Abbildung) bereitstellen können.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei den Belichtungsprotokollen voraus, um eine vorzeitige Aktivierung von PST-1P zu verhindern.
- Erfordert Anpassungen bei der Markierung mit EB3-dTomato oder vergleichbaren Reportern für Mikrotubuli-Plus-Enden.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie die Vermeidung von grünem Licht und fluoreszierenden Markierungen, die Photostatine deaktivieren könnten.
