Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Im frühen Drosophila-Embryo durchlaufen viele Organellen eine großflächige Bewegung. Unser Protokoll beschreibt, wie diese Bewegung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die für die Zellkultur entwickelt wurden, überwacht werden kann. Im Vergleich zu fluoreszierenden Proteinen sind kommerziell erhältliche fluoreszierende Sonden heller und decken einen breiteren Bereich des Spektrums ab.

Sie ermöglichen eine Multiplex-Colabeling und können in jedem genetischen Hintergrund verwendet werden. Es braucht Übung und Versuch und Irrtum, um zu wissen, wie lange es dauert, Embryonen auszutrocknen, so dass sie entweder während der Injektion platzen oder austrocknen und aufhören, sich zu entwickeln. Beginnen Sie zunächst mit der Vorbereitung der Injektionsnadeln, indem Sie die Kapillare in einen Kapillarhalter auf den Nadelzieher legen und mit Flügelmuttern befestigen.

Richten Sie die Mitte der Kapillare mit dem Heizelement aus. Wählen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers die entsprechenden Einstellungen am Nadelzieher. Führen Sie mit einem Seziermikroskop den Qualitätskontrolltest durch.

Drücken Sie die Nadeln horizontal in den Kitt, wobei die Nadelspitzen in der Luft hängen. Decken Sie die Nadeln mit dem Deckel ab und lagern Sie sie bis zum Gebrauch. Ziehen Sie mit Nadelladespitzen, die an einer Mikropipette befestigt sind, einen Mikroliter der Injektionslösung in die Spitze, ohne Luftblasen einzufangen.

Halten Sie die Nadel mit Handschuhen in einer Hand, wobei die Spitze nach vorne zeigt, und stecken Sie die Ladespitze hinein. Geben Sie die Flüssigkeit in der Nähe der Nadelspitze ab, entfernen Sie die Pipette und halten Sie die Nadel vertikal, bis die Flüssigkeit zur Spitze fließt. Decken Sie den Behälter mit Aluminiumfolie ab, ohne die Nadelspitzen zu beschädigen, um das Ausbleichen der Farbstoffe zu verhindern.

Legen Sie mit einer Transferpipette oder einem Mikropipetter einen kleinen Tropfen Heptankleber in die Mitte eines rechteckigen Deckglases und lassen Sie ihn verdampfen. Um das Chorion mechanisch zu entfernen, bedecken Sie die entsprechend gealterte Embryoplatte mit einer dünnen Schicht Halogenkohlenwasserstofföl 27, um die Eierschale transparent zu machen. Betrachten Sie die Platte unter einem Dissektionsmikroskop mit Transillumination, um das Embryonenstadium zu bestätigen, und wählen Sie die Embryonen in Spaltungsstadien aus.

Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette einen Embryo des gewünschten Stadiums auf, indem Sie die dorsalen Anhängsel greifen und auf den vorbereiteten Glasobjektträger übertragen, der mit doppelseitigem Klebeband bedeckt ist. Legen Sie den Embryo auf das Band und minimieren Sie den Öltransfer. Rollen Sie den Embryo vorsichtig über die Oberfläche des Bandes, indem Sie mit der Seite der Spitze der Pinzette stupsen, ohne ihn direkt zu stoßen.

Rollen Sie den Embryo weiter, bis das Chorion am Band haftet und reißt. Nachdem das Chorion gerissen ist, rollen Sie den Embryo weiter, um ihn vom Chorion zu trennen, das am Band klebt. Rollen Sie den Embryo zurück auf das Chorion, das weniger haftend ist als das Band.

Reiben Sie den Embryo vorsichtig mit der Pinzette, bis er zur Übertragung an der Pinzette befestigt ist. Übertragen Sie dann den Embryo auf das Deckglas und bringen Sie ihn in Kontakt mit dem Kleber, um den Embryo an Ort und Stelle zu halten und ihn von der Pinzette zu trennen. Passen Sie die Ausrichtung des Embryos auf dem Deckblatt an.

Lassen Sie die Embryonen fünf bis 12 Minuten austrocknen, indem Sie den Deckzettel mit den Embryonen in die Austrocknungskammer legen und verschließen. Nehmen Sie den Deckzettel aus der Kammer ab und geben Sie einen Tropfen Halogenkohlenwasserstofföl 700 ab, der die Embryonen bedeckt, um eine weitere Austrocknung zu verhindern. Untersuchen Sie sie unter dem Sezierbereich und fahren Sie mit der Mikroinjektion fort, wenn die Embryonen richtig ausgetrocknet wurden.

Legen Sie das 4X-Objektiv in den Lichtweg und stellen Sie mit dem Fokusknopf am Mikroskop die Embryonen in den Fokus. Bewegen Sie die Embryonen horizontal in die Mitte des Sichtfeldes mit den Stufensteuerungen. Halten Sie die Embryonen am Rand des Sichtfeldes und schwenken Sie sie weg, um die Nadel zu senken.

Bleiben Sie bei der gleichen Fokusebene, senken Sie die Nadelspitze ab und stellen Sie sicher, dass sie zusammen mit den Embryonen im Sichtfeld sichtbar ist. Überprüfen Sie, ob die Nadel funktioniert, indem Sie einen Teil der Injektionslösung in Halogenkohlenwasserstofföl 700 dosieren. Bei Erfolg erscheint eine Blase aus Lösung im Öl in der Nähe der Nadelspitze.

Bewegen Sie den Embryo mit den Stufenkontrollen in Richtung der Nadelspitze, bis die Spitze den Embryo sanft durchsticht und in ihn eintritt. Beginnen Sie gleichzeitig mit dem Fluss der Injektionslösung, bis an der Stelle der Nadelspitze ein vorübergehender klarer Punkt erscheint, der auf einen erfolgreichen Lösungstransfer in den Embryo hinweist. Befestigen Sie den Deckglas mit dem Objektträgerhalter auf dem Konfokalmikroskop.

Seien Sie vorsichtig, da der Deckschlitten zerbrechlich ist. Untersuchen Sie die Embryonen mit der Epifluoreszenzfunktion am konfokalen Mikroskop mit einem 40X-Objektiv und stellen Sie sicher, dass das Fluor 4 im Embryo sichtbar ist, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie für Live-Imaging während der Synzytialphasen die Bildgröße von 512 x 512 Pixeln, den Zeilendurchschnitt von drei und eine Bildrate von 0,1 Bildern pro Sekunde ein.

Nachdem der Farbstoff BODIPY 493 503 injiziert worden war, wurde er an der Stelle lokalisiert, an der die Nadelspitze eingeführt wurde, und dann neben der Injektionsstelle diffundiert. Nach 24 Minuten ist der Farbstoff über den Mittelpunkt des Embryos hinaus diffundiert. Die Organellenmotilität wurde überwacht, indem dem Embryo BODIPY 493 503 und LysoTracker Red injiziert wurden.

Die Teilchenbild-Velocimetrie-Analyse ergab, dass der embryonale Inhalt in der zentralen Region des Embryos konvergierte, wo das Zytoplasma in das Innere des Embryos fließt. Die Beschriftung des ER mit ER-Tracker Green bietet eine lebendige Auflösung der Kernhülle und ermöglicht die Visualisierung wichtiger Zellzyklusstufen. Der Embryo wurde im Blastodermstadium mit MitoView 633 injiziert und vier Stunden später aufgenommen.

Das Bild zeigt eine neuroektodermale Zelle eines Embryos in Keimbandverlängerung. Einem zellularisierenden Embryo wurde eine Mischung aus BODIPY 493 503 und SiR Tubulin injiziert, was zeigt, dass sich die Lipidtröpfchen bidirektional entlang von Mikrotubuli bewegen. Der Embryo muss teilweise ausgetrocknet sein, damit Flüssigkeit injiziert werden kann.

Zu wenig Austrocknung führt dazu, dass der Embryo bei der Injektion ausläuft, zu viel Austrocknung tötet den Embryo. Videos von sich bewegenden Organellen können durch verschiedene Bildanalysetechniken charakterisiert werden. Die Partikelverfolgung zeigt das Verhalten einzelner Organellen, die Velocimetrie der Partikelbildgebung zeigt den Massenfluss.