Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse für die Erstliniendiagnose der primären ziliären Dyskinesie
19. Januar 2022
Die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse ist ein relativ einfach durchzuführendes, schnelles, kostengünstiges und in erfahrenen Händen ein äußerst zuverlässiges Werkzeug für die Erstliniendiagnostik der primären ziliären Dyskinesie, das in jedem an der Diagnostik und Behandlung schwerer Lungenerkrankungen beteiligten Zentrum zur Verfügung stehen sollte.
Die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse ist ein zuverlässiges Werkzeug für die Erstliniendiagnostik der primären ziliären Dyskinesie. Diese Technik ist relativ einfach durchzuführen, schnell, kostengünstig und in erfahrenen Händen ein sehr zuverlässiges Werkzeug. Und es ist für Patienten aller Altersgruppen anwendbar.
Die Videomikroskopie zeigt auch eine sekundäre Ziliarfunktion. Wie zum Beispiel durch bakterielle oder virale Infektionen. Aber es wurde hauptsächlich verwendet, um primäre ziliäre Dyskinesie zu diagnostizieren.
Wissenschaftler nutzen diese Methode auch, um intrazelluläre Prozesse oder biologische Funktionen in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Bei diesem Verfahren wird mich Frau Tina Peromaa, unsere Laborantin, unterstützen.
Bevor Sie die respiratorischen Epithelzellen sammeln, bitten Sie den Patienten, sich gründlich die Nase zu putzen. Wenn der Patient bereit ist, halten Sie den Kopf des Patienten mit einer Hand fixiert und verwenden Sie eine Interdentalbürste von 0,6 Millimeter Größe in der anderen Hand, um das untere Nasenloch des Nasenlochs zu bürsten, um genügend Epithelzellstreifen zu sammeln. Lassen Sie die geernteten Zellstreifen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen fallen, das das mit Zellen genährte DMEM enthält.
Nach dem Schließen des Deckels des Mikrozentrifugenröhrchens halten Sie das Röhrchen gegen die Lichtquelle und schütteln Sie das Rohr, um geerntete Zellstreifen und Konglomerate zu entdecken. Stellen Sie später die Mikrozentrifugenröhrchen mit den Deckeln ordnungsgemäß verschlossen in eine Styroporbox. Bevor Sie die Box fest schließen, stellen Sie sicher, dass die Rohre in der Box befestigt sind.
Fügen Sie dann eine Kühlpackung in die Schachtel ein, während Sie vermeiden, dass die Probe einfriert. Nachdem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit den Proben aus der Styroporbox entfernt haben, legen Sie ein Röhrchen unter eine Haube der Mikroskopheizeinheit, um sich für die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse oder HSVMA auf 37 Grad Celsius zu erwärmen. Starten Sie als Nächstes die Kamera und die Software der Videoeinheit auf dem Computer.
Verwenden Sie eine Pipette, um eine kleine Probe zu entnehmen, und legen Sie zwei Tropfen der Probe in eine Küvette. Decken Sie die Küvette mit einem Deckel ab, bevor Sie sie unter das Mikroskop legen. Verwenden Sie eine Öltauchlinse mit einer 100-fachen Vergrößerung und geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf die Oberfläche der Optik.
Während Sie sich mit der Mikroskoplinse dem Boden der Schale nähern, suchen Sie nach den Zellclustern ohne rote Blutkörperchen und mit niedrigem Schleimgehalt. Nachdem Sie eine repräsentative Region of Interest oder ROI gefunden haben, konzentrieren Sie sich auf eine Gruppe der schlagenden Zilien mit den größten Zilienbewegungen und zeichnen Sie eine Videosequenz auf. Zeichnen Sie die Zellen mit schlagenden Zilien seitlich und von oben auf.
Die repräsentative Analyse zeigt normale Zilienbewegungen, die seitlich und von oben gesehen werden. Die Probe eines primären Ziliardyskinesie- oder PCD-Patienten mit einer Mutation im DNAH11-Gen zeigte das klassische steife, minimal bewegliche Muster des Ziliarschlags. Von der Seite und von oben betrachtet.
Bei einem anderen PCD-Patienten mit der gleichen Mutation wurde ein anderes hyperkinetisches, aber ineffizientes Muster der schlagenden Zilien beobachtet. Ein pathologisches Ziliarschlagmuster und eine ziliäre Schlagfrequenz wurden auch bei einem Patienten mit wiederkehrenden Infektionen der oberen Atemwege beobachtet. Wenn das Bürstenverfahren rigoros durchgeführt wird, konnte die HSVMA-Analyse nicht durchgeführt werden, da bewimperte Epithelzellen mit einer Beschichtung aus roten Blutkörperchen bedeckt waren.
Der wichtigste Schritt bei der Prozedur ist es, ausreichend Atemzellen aus den Bürsten zu gewinnen und dieses Material für die Videoanalyse gut konserviert zu halten. Das verbleibende Material kann zur Elektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um mögliche strukturelle Defekte in Zilien aufzuspüren oder Defekte und die Synthese von Ziliarproteinen aufzudecken.
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Übersicht
Die Analyse mittels Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie ist ein zuverlässiges und kostengünstiges Werkzeug zur Diagnose der primären ciliären Dyskinesie. Sie ist einfach durchzuführen und für alle Altersgruppen geeignet, was sie zu einem unverzichtbaren Verfahren für Zentren macht, die schwere Lungenerkrankungen behandeln.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Beatmungsmedizin
- Diagnostische Verfahren
Hintergrund
- Die primäre ciliäre Dyskinesie ist eine Erkrankung, die die Funktion der Flimmerhärchen beeinträchtigt.
- Mithilfe der Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie können sowohl primäre als auch sekundäre Funktionen der Flimmerhärchen aufgedeckt werden.
- Diese Methode eignet sich besonders zur Diagnose von Atemwegserkrankungen, die mit einer Dysfunktion der Flimmerhärchen zusammenhängen.
- Für Ärzte ist es wichtig, über zuverlässige diagnostische Werkzeuge verfügen zu können.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Wirksamkeit der Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie bei der Diagnose der primären ciliären Dyskinesie.
- Beurteilung der Anwendbarkeit dieser Technik über verschiedene Altersgruppen von Patienten hinweg.
- Herausstellung der Bedeutung dieses diagnostischen Werkzeugs in klinischen Settings.
Verwendete Methoden
- Analyse mittels Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie.
- Beurteilung der Flimmerhärchenbewegung und -funktion.
- Vergleich der Ergebnisse über verschiedene Patientenkollektive hinweg.
- Beurteilung der sekundären Flimmerhärchenfunktion in Bezug auf Infektionen.
Hauptergebnisse
- Die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie ist wirksam bei der Diagnose der primären ciliären Dyskinesie.
- Die Methode ist zuverlässig, wenn sie von erfahrenem Personal durchgeführt wird.
- Sie liefert Erkenntnisse über die sekundäre Zilienfunktion.
- Sie ist auf Patienten aller Altersgruppen anwendbar und erhöht dadurch ihre Nützlichkeit in der klinischen Praxis.
Schlussfolgerungen
- Die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie sollte ein Standarddiagnoseverfahren in der pneumologischen Medizin sein.
- Ihre einfache Handhabung und Zuverlässigkeit machen sie für die Erstdiagnostik geeignet.
- Durch eine weite Verfügbarkeit können die Behandlungsergebnisse für Patienten mit schweren Lungenerkrankungen verbessert werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Analyse mittels Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie (HSVMA) bietet eine schnelle und kostengünstige Methode für die Erstdiagnose der primären ciliären Dyskinesie (PCD), einer seltenen genetischen Erkrankung, die die mukoziliäre Clearance beeinträchtigt. Durch die direkte Visualisierung der Flimmerhärchen-Schlagmuster in lebenden Atemwegsepithelzellen ermöglicht die HSVMA eine frühzeitige Erkennung und verringert die Abhängigkeit von ressourcenintensiveren Verfahren wie der Transmissions-Elektronenmikroskopie. Diese Fähigkeit verbessert die diagnostische Kapazität in pneumologischen und Zentren für seltene Erkrankungen, fördert eine zeitnahe Intervention und reduziert langfristige pulmonale Komplikationen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Beurteilung der Zilienbeweglichkeit in Zellen von Patienten und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der Forschung zu Ziliopathien.
- Operativer Wert: Bietet einen reproduzierbaren Endpunkt zur Bewertung genetischer oder pharmakologischer Eingriffe in die Zilienfunktion.
- Prädiktiver Wert: Unterscheidet zwischen strukturellen und funktionellen Defekten und erhöht somit die Zuverlässigkeit mechanistischer Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Daten zur Flimmerhärchen-Schlagfrequenz und -wellenform für die Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Unterstützt die Entwicklung standardisierter Protokolle für die Live-Cell-Bildgebung in Modellen respiratorischer Erkrankungen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Analyse mit hohem Informationsgehalt bezüglich der Flimmerhärchen-Dynamik über mehrere Patientenproben oder genetische Varianten hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Kontinuität: Verknüpft in vitro-Befunde mit klinischen Phänotypen, indem HSVMA-Ergebnisse mit der Krankheitsschwere korreliert werden.
- Mechanistische Entwederung Identifiziert eine funktionelle Wiederherstellung in präklinischen Modellen durch die Normalisierung des Flimmerhärchen-Schlags.
- Biomarker-Ausrichtung: Bietet funktionelle Messgrößen, die strukturelle oder molekulare Biomarker bei PCD ergänzen.
Pipeline- und Workflow-Integration
HSVMA fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung ein und bietet einen funktionellen Assay für die Entwicklung von ziliären Therapeutika.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung bezüglich Gene, die an der Zilienbildung und -beweglichkeit beteiligt sind, wie beispielsweise DNAH11.
- Screening: Liefert quantitative, echtzeitfähige Messwerte, die für das Wirkstoff-Screening in Ziliopathie-Modellen geeignet sind.
- Analysen: Ermöglicht den statistischen Vergleich von Schlagparametern von Zilien unter verschiedenen Bedingungen und unterstützt datenbasierte Entscheidungen.
- Translationale Forschung: Verbindet zelluläre Phänotypen mit klinischen Ergebnissen und unterstützt so den Übergang von der präklinischen zur klinischen Phase.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Beurteilung der Zilienfunktion in verschiedenen Modellen respiratorischer Erkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem direkte Visualisierung der Flimmergeißel-Dynamik in nativen zellulären Kontexten ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Probenahme-, Konservierungs- und Abbildungsprotokolle sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen bei der Zielvalidierung, indem die funktionelle Relevanz genetischer Treffer bestätigt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Ciliopathie-Zielen basierend auf Nachweisen funktioneller Wiederherstellung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Zellgewinnung, Mikroskopiebedienung und Videoanalyse für eine genaue Interpretation.
- Benötigt Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Systeme mit Öl-Immersionsoptik und Umweltkontrolle.
- Setzt standardisierte Verfahren für die Probenhandhabung voraus, um Kontamination oder Zersetzung zu vermeiden.
- Kann bei der Übertragung auf verschiedene Modellsysteme eine Optimierung der Kulturbedingungen und Bildgebungsparameter erfordern.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit lebensfähiger, unkontaminierter epithelialer Proben; das Vorhandensein von roten Blutkörperchen oder Schleim kann die Analyse behindern.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Collection and Transport of Respiratory Epithelial Cells
2:20
High-Speed Video Microscopy Analysis (HSVMA)
3:43
Results: Analysis of Ciliary Motion in Healthy Individual and Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) Patients
4:49
Conclusion
