Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse
December 16th, 2021
In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.
Entzündliche Darmerkrankungen oder IBD stellen eine erhebliche gesundheitliche und finanzielle Belastung für den Einzelnen und die Gesellschaft dar. Dieses Colitis-Modell ist hilfreich, um die Mechanismen von IBD zu untersuchen und die Behandlungen für IBD zu bewerten. Dieses immundominante Cbir-Flagellin-T-Zell-spezifische adoptive Transferkolitis-Modell liefert Einblicke in die Art und Weise, wie das Antigen von Darmbakterien T-Zell-Reaktionen induziert, um Kolitis zu induzieren.
Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, machen Sie einen etwa einen Zentimeter langen linken Bauchschnitt und ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg. Machen Sie dann einen etwa drei Zentimeter langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe. Als nächstes entfernen Sie die Milz mit steriler Schere und Pinzette.
Legen Sie die Milz in eine Kulturschale mit fünf Millilitern vorgekühltem Waschpuffer. Schleifen Sie die Milz mit der rauen Oberfläche von zwei sterilen Glasobjektträgern. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie sie durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb führen.
Glasobjektträger und Kulturschale mit fünf Millilitern vorgekühltem Waschpuffer abspülen und in das Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern vorgewärmtem Tris-Ammoniumchlorid-Lysepuffer pro Milz. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
10 Milliliter vorgekühlten Waschpuffer in das Röhrchen geben. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension, verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit 10 Millilitern vorgekühltem Isolationspuffer. Um die Zellen zu zählen, mischen Sie jeweils 10 Mikroliter Zellsuspension und Trypanblau gründlich und laden Sie 10 Mikroliter auf einen Objektträger.
Führen Sie dann den Schieber in den automatisierten Zellzähler ein, um die lebensfähige Zellnummer zu erhalten. Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension und verwerfen Sie alle Überstände. Wirbeln Sie die Anti-Maus-CD4-Magnetpartikel, fügen Sie direkt 50 Mikroliter der Partikel pro 10 Millionen Zellen hinzu und mischen Sie sie gründlich mit Zellpellets.
Die Mischung 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Die Zellpartikelsuspension in ein steriles Sammelröhrchen überführen. 3,5 Milliliter vorgekühlten Isolationspuffer in das Rohr geben.
Legen Sie das Röhrchen acht Minuten bei Raumtemperatur auf den Zelltrennmagneten. Dann den Überstand vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Transferpipette absaugen. Entfernen Sie das Rohr vom Zelltrennmagneten.
Anschließend werden die Zellen mit 3,5 Millilitern vorgekühltem Isolationspuffer wieder eingependelt und das Rohr für vier Minuten bei Raumtemperatur auf den Magneten gelegt. Den Überstand vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Pipette absaugen. Schließlich resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter vorgekühlten FACS-Puffer.
Um die Zellen in die Empfängermäuse zu übertragen, resuspendieren Sie die Cbir1 TCR transgen-naiven CD4-positiven T-Zellen auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter in 1x PBS. Erwärmen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe und halten Sie die Mäuse mit einem Mausfessel zurück. Intravenös 200 Mikroliter der Zellsuspension in die Schwanzvene der Mäuse injizieren.
Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, machen Sie einen etwa einen Zentimeter großen ventralen Mittellinien-Hautschnitt. Ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg. Machen Sie dann einen drei Zentimeter langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe.
Als nächstes identifizieren Sie das Coecum und entfernen Sie den gesamten Dickdarm mit steriler Schere und Pinzette. Befeuchten Sie den Dickdarm mit vorgekühltem PBS in einer Kulturschale. Schneiden Sie den Dickdarm der Länge nach ein und spülen Sie ihn mit vorgekühltem PBS aus.
Schneiden Sie 1/3 des Dickdarms längs ab. Legen Sie den Dickdarmstreifen in ein Papiertuch mit der Lumenalseite nach oben. Führen Sie Swiss-Rolling mit einem Zahnstocher durch.
Legen Sie den Doppelpunkt Swiss in eine Kassette und legen Sie die Kassette für 24 Stunden in 10% gepuffertes Formalin. Dehydrieren und paraffinen Sie den Dickdarm mit einem automatisierten Prozessor ein. Schneiden Sie dann fünf Mikrometer schwere Gewebeschnitte auf einem Mikrotom.
Montieren Sie das Gewebe auf Objektträgern und führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung durch. Die Rag-Knockout-Mäuse begannen etwa drei Wochen nach dem Zelltransfer an Gewicht zu verlieren, und ihr Gewicht erreichte sechs Wochen nach dem Zelltransfer etwa 80 bis 85% ihres ursprünglichen Gewichts. Empfängermäuse zeigten sechs Wochen nach dem Zelltransfer eine kurze Dickdarmlänge.
Die Empfängermäuse zeigten vier Wochen nach dem Zelltransfer mehr Zellinfiltration in der Intestinallamina propria. Sie zeigten Kelchzellverlust und intestinale Epithelzellhyperplasie fünf Wochen nach dem Zelltransfer sowie Schleimhauterosion und entzündliche Zellinfiltration in der Submukosa des Dickdarms sechs Wochen nach dem Zelltransfer. Die histopathologischen Scores stiegen erheblich von vier auf sechs Wochen.
Gleichzeitig gab es keine Entzündung bei Rag-Knockout-Mäusen, die PBS allein erhielten. Mit diesem Verfahren konnten die Kolonzytokinspiegel mittels ELISA und qPCR bestimmt werden.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt ein Kolitismodell für die adoptive Übertragung antigenspezifischer T-Zellen der Darmmikrobiota. CD4 + T-Zellen aus CBir1 TCR-transgenen Mäusen werden auf Rag1 -/- Mäuse übertragen und lösen eine Darmentzündung aus.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaft
- Immunologie
- Gastroenterologie
Hintergrund
- Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) stellen erhebliche gesundheitliche Herausforderungen dar.
- Dieses Modell hilft beim Verständnis der IBD-Mechanismen.
- Es bewertet potenzielle Behandlungen für IBD.
- Es liefert Einblicke in die T-Zell-Reaktionen auf Darmbakterien.
Ziel der Studie
- Ein Modell für die Untersuchung von IBD zu entwickeln.
- T-Zell-Reaktionen auf Darmmikrobiota-Antigene zu erforschen.
- Therapeutische Interventionen für IBD zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Isolierung von CD4 + T-Zellen aus transgenen Mäusen.
- Adoptive Übertragung von T-Zellen in Empfängermäuse.
- Induktion einer Darmentzündung.
- Chirurgische Eingriffe zur Gewebeanalyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion von Kolitis in Empfängermäusen.
- Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen auf Mikrobiota-Antigene.
- Einblicke in die Rolle von Darmbakterien bei IBD.
- Potenzial zur Bewertung therapeutischer Strategien.
Schlussfolgerungen
- Das Modell bietet eine Plattform für IBD-Forschung.
- Es verbessert das Verständnis der Immunreaktionen auf Darmantigene.
- Zukünftige Studien können dieses Modell zur Behandlungsbewertung nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This antigen-specific T-cell transfer model enables mechanistic interrogation of gut microbiota-driven immune responses in inflammatory bowel disease, supporting target validation and preclinical de-risking. By recapitulating human-relevant T-cell phenotypes and histopathological progression, it provides a predictive system for evaluating immunomodulatory therapeutics. The model supports early discovery workflows focused on pathway clarification and target confidence in IBD pathogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of CBir1 flagellin as a therapeutically relevant gut microbiota antigen in IBD pathogenesis.
- Operational Value: Provides a defined antigen-specific system to isolate and validate T-cell-mediated mechanisms of intestinal inflammation.
- Strategic Value: Supports target confidence by linking specific microbial antigens to pathogenic T-cell responses in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histopathological and cellular readouts for assessing compound effects on colonic inflammation.
- Operational Value: Establishes a reproducible colitis phenotype with measurable weight loss, colon shortening, and immune infiltration for assay standardization.
- Strategic Value: Enables screening of immunomodulators using clinically relevant endpoints such as mucosal erosion and cytokine profiles.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Mirrors key histopathological features of human IBD including goblet cell loss, epithelial hyperplasia, and submucosal inflammation.
- Operational Value: Supports longitudinal monitoring of disease severity via weight tracking, colon length, and histology scoring for pharmacokinetic/pharmacodynamic alignment.
- Strategic Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by modeling chronic T-cell-driven colitis relevant to Crohn’s disease pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The model integrates into discovery-to-preclinical workflows by providing a mechanistic bridge from antigen-specific T-cell activation to tissue-level pathology, enabling hypothesis testing and lead optimization in IBD.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gut microbiota antigens and T-cell receptor specificity in driving intestinal inflammation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs including histopathology scores and cytokine levels for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of colonic cytokine levels via ELISA and qPCR to correlate immune activation with therapeutic response.
- Translational Research: Connects murine T-cell phenotypes to human-relevant IBD mechanisms through antigen-specific immune pathology.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for iterative testing of immunomodulatory candidates targeting antigen-driven T-cell pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through antigen-specific T-cell induction of colitis.
- Operational Value: Standardized induction and assessment protocols ensure reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Reduces biological de-risking by validating targets in a physiologically relevant, antigen-driven inflammation model.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions by linking target modulation to histopathological and clinical-like outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in T-cell isolation, magnetic sorting, and adoptive transfer techniques.
- Dependent on access to CBir1 TCR transgenic mice and Rag1-deficient recipients for model fidelity.
- Necessitates standardized histology scoring and tissue processing for consistent inflammation assessment.
- Involves surgical and perfusion procedures requiring aseptic technique and anatomical precision.
- Limited to mechanistic studies of antigen-specific responses; does not model microbiome complexity or barrier dysfunction alone.
