Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse
16. Dezember 2021
In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.
Entzündliche Darmerkrankungen oder IBD stellen eine erhebliche gesundheitliche und finanzielle Belastung für den Einzelnen und die Gesellschaft dar. Dieses Colitis-Modell ist hilfreich, um die Mechanismen von IBD zu untersuchen und die Behandlungen für IBD zu bewerten. Dieses immundominante Cbir-Flagellin-T-Zell-spezifische adoptive Transferkolitis-Modell liefert Einblicke in die Art und Weise, wie das Antigen von Darmbakterien T-Zell-Reaktionen induziert, um Kolitis zu induzieren.
Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, machen Sie einen etwa einen Zentimeter langen linken Bauchschnitt und ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg. Machen Sie dann einen etwa drei Zentimeter langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe. Als nächstes entfernen Sie die Milz mit steriler Schere und Pinzette.
Legen Sie die Milz in eine Kulturschale mit fünf Millilitern vorgekühltem Waschpuffer. Schleifen Sie die Milz mit der rauen Oberfläche von zwei sterilen Glasobjektträgern. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie sie durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb führen.
Glasobjektträger und Kulturschale mit fünf Millilitern vorgekühltem Waschpuffer abspülen und in das Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern vorgewärmtem Tris-Ammoniumchlorid-Lysepuffer pro Milz. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
10 Milliliter vorgekühlten Waschpuffer in das Röhrchen geben. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension, verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit 10 Millilitern vorgekühltem Isolationspuffer. Um die Zellen zu zählen, mischen Sie jeweils 10 Mikroliter Zellsuspension und Trypanblau gründlich und laden Sie 10 Mikroliter auf einen Objektträger.
Führen Sie dann den Schieber in den automatisierten Zellzähler ein, um die lebensfähige Zellnummer zu erhalten. Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension und verwerfen Sie alle Überstände. Wirbeln Sie die Anti-Maus-CD4-Magnetpartikel, fügen Sie direkt 50 Mikroliter der Partikel pro 10 Millionen Zellen hinzu und mischen Sie sie gründlich mit Zellpellets.
Die Mischung 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Die Zellpartikelsuspension in ein steriles Sammelröhrchen überführen. 3,5 Milliliter vorgekühlten Isolationspuffer in das Rohr geben.
Legen Sie das Röhrchen acht Minuten bei Raumtemperatur auf den Zelltrennmagneten. Dann den Überstand vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Transferpipette absaugen. Entfernen Sie das Rohr vom Zelltrennmagneten.
Anschließend werden die Zellen mit 3,5 Millilitern vorgekühltem Isolationspuffer wieder eingependelt und das Rohr für vier Minuten bei Raumtemperatur auf den Magneten gelegt. Den Überstand vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Pipette absaugen. Schließlich resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter vorgekühlten FACS-Puffer.
Um die Zellen in die Empfängermäuse zu übertragen, resuspendieren Sie die Cbir1 TCR transgen-naiven CD4-positiven T-Zellen auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter in 1x PBS. Erwärmen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe und halten Sie die Mäuse mit einem Mausfessel zurück. Intravenös 200 Mikroliter der Zellsuspension in die Schwanzvene der Mäuse injizieren.
Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, machen Sie einen etwa einen Zentimeter großen ventralen Mittellinien-Hautschnitt. Ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg. Machen Sie dann einen drei Zentimeter langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe.
Als nächstes identifizieren Sie das Coecum und entfernen Sie den gesamten Dickdarm mit steriler Schere und Pinzette. Befeuchten Sie den Dickdarm mit vorgekühltem PBS in einer Kulturschale. Schneiden Sie den Dickdarm der Länge nach ein und spülen Sie ihn mit vorgekühltem PBS aus.
Schneiden Sie 1/3 des Dickdarms längs ab. Legen Sie den Dickdarmstreifen in ein Papiertuch mit der Lumenalseite nach oben. Führen Sie Swiss-Rolling mit einem Zahnstocher durch.
Legen Sie den Doppelpunkt Swiss in eine Kassette und legen Sie die Kassette für 24 Stunden in 10% gepuffertes Formalin. Dehydrieren und paraffinen Sie den Dickdarm mit einem automatisierten Prozessor ein. Schneiden Sie dann fünf Mikrometer schwere Gewebeschnitte auf einem Mikrotom.
Montieren Sie das Gewebe auf Objektträgern und führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung durch. Die Rag-Knockout-Mäuse begannen etwa drei Wochen nach dem Zelltransfer an Gewicht zu verlieren, und ihr Gewicht erreichte sechs Wochen nach dem Zelltransfer etwa 80 bis 85% ihres ursprünglichen Gewichts. Empfängermäuse zeigten sechs Wochen nach dem Zelltransfer eine kurze Dickdarmlänge.
Die Empfängermäuse zeigten vier Wochen nach dem Zelltransfer mehr Zellinfiltration in der Intestinallamina propria. Sie zeigten Kelchzellverlust und intestinale Epithelzellhyperplasie fünf Wochen nach dem Zelltransfer sowie Schleimhauterosion und entzündliche Zellinfiltration in der Submukosa des Dickdarms sechs Wochen nach dem Zelltransfer. Die histopathologischen Scores stiegen erheblich von vier auf sechs Wochen.
Gleichzeitig gab es keine Entzündung bei Rag-Knockout-Mäusen, die PBS allein erhielten. Mit diesem Verfahren konnten die Kolonzytokinspiegel mittels ELISA und qPCR bestimmt werden.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt ein adoptives Transfer-Kolitis-Modell für antigenspezifische T-Zellen der Darmmikrobiota. CD4 + T-Zellen aus CBir1-TCR-transgenen Mäusen werden in Rag1 -/- Mäuse übertragen, wodurch eine intestinale Entzündung ausgelöst wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Gastroenterologie
Hintergrund
- Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) stellt erhebliche gesundheitliche Herausforderungen dar.
- Dieses Modell hilft beim Verständnis der Mechanismen der IBD.
- Es bewertet potenzielle Behandlungen für die IBD.
- Es liefert Erkenntnisse über die T-Zell-Antworten auf Darmbakterien.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Modells zur Untersuchung von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED).
- Untersuchung der T-Zell-Antworten auf Antigene der Darmmikrobiota.
- Bewertung therapeutischer Interventionen bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED).
Verwendete Methoden
- Isolierung von CD4+-T-Zellen aus transgenen Mäusen.
- Adoptive Übertragung von T-Zellen in Empfängermäuse.
- Induktion einer intestinalen Entzündung.
- Chirurgische Verfahren zur Gewebeanalyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion einer Kolitis bei empfängenden Mäusen.
- Charakterisierung der T-Zell-Antworten auf Mikrobiota-Antigene.
- Erkenntnisse zur Rolle von Darmbakterien bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD).
- Potenzial zur Bewertung therapeutischer Strategien.
Schlussfolgerungen
- Das Modell bietet eine Plattform für die Forschung zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBD).
- Es vertieft das Verständnis der Immunantworten auf Darmantigene.
- Zukünftige Studien können dieses Modell zur Bewertung von Therapien nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses antigen-spezifische T-Zell-Transfermodell ermöglicht die mechanistische Untersuchung mikrobiotaabhängiger Immunantworten bei entzündlichen Darmerkrankungen und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen sowie die präklinische Risikominimierung. Durch die Rekapitulation menschlich relevanter T-Zell-Phänotypen und des histopathologischen Fortschreitens bietet es ein prädiktives System zur Bewertung immunmodulatorischer Therapeutika. Das Modell unterstützt frühe Entdeckungsarbeitsabläufe, die auf die Aufklärung von Signalwegen und die Bestätigung von Zielstrukturen bei der Pathogenese von IBD ausgerichtet sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von CBir1-Flagellin als therapeutisch relevantes Antigen der Darmmikrobiota bei der Pathogenese entzündlicher Darmerkrankungen (IBD).
- Operationaler Wert: Bietet ein definiertes, antigenspezifisches System, um T-Zell-vermittelte Mechanismen intestinaler Entzündung zu isolieren und zu validieren.
- Strategischer Wert: Stärkt das Vertrauen in therapeutische Zielstrukturen, indem spezifische mikrobielle Antigene in vivo mit pathogenen T-Zell-Antworten verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare histopathologische und zelluläre Endpunkte zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf kolonale Entzündungen.
- Operationaler Wert: Etabliert ein reproduzierbares Kolitis-Phänotyp mit messbarem Gewichtsverlust, Kolonverkürzung und immunologischer Infiltration zur Standardisierung von Assays.
- Strategischer Wert: Ermöglicht das Screening von Immunmodulatoren unter Verwendung klinisch relevanter Endpunkte wie Schleimhauterosion und Zytokinprofile.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Spiegelt wichtige histopathologische Merkmale der menschlichen entzündlichen Darmerkrankung (IBD) wider, einschließlich Verlust von Becherzellen, epithelialer Hyperplasie und submukosaler Entzündung.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Überwachung des Schweregrads der Erkrankung mittels Gewichtskontrolle, Colonlänge und histologischer Score-Erhebung zur Abstimmung von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Parametern.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem er eine chronische, T-Zellen-vermittelte Kolitis modelliert, die für die Pathophysiologie des Morbus Crohn relevant ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell integriert sich in Workflows von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase, indem es eine mechanistische Verbindung von der antigenspezifischen T-Zell-Aktivierung bis hin zur pathologischen Gewebeveränderung herstellt und dadurch Hypothesentests sowie die Optimierung von Wirkstoffkandidaten bei entzündlichen Darmerkrankungen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich Antigene des Darmmikrobioms und der T-Zell-Rezeptor-Spezifität bei der Entstehung von Darmentzündungen.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse wie Histopathologie-Scores und Zytokinspiegel zur Bewertung von Wirkstoffen.
- Analytik: Ermöglicht die Messung von kolorektalen Zytokinspiegeln mittels ELISA und qPCR, um die Immunaktivierung mit der therapeutischen Wirkung zu korrelieren.
- Translationale Forschung: Verbindet murine T-Zell-Phänotypen mit menschlich relevanten IBD-Mechanismen über antigenspezifische Immunpathologie.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform für die iterative Prüfung immunmodulatorischer Kandidaten, die auf antigentreibende T-Zell-Signalwege abzielen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Sicherheit bei der Target-Validierung durch antigenspezifische T-Zell-induzierte Kolitis.
- Operationaler Wert: Standardisierte Induktions- und Bewertungsprotokolle gewährleisten die Reproduzierbarkeit über Labore und Studien hinweg.
- Strategischer Wert: Verringert das biologische Risiko, indem Targets in einem physiologisch relevanten, antigengetriebenen Entzündungsmodell validiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Modulation des Targets mit histopathologischen und klinisch ähnlichen Ergebnissen verknüpft wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der T-Zell-Isolierung, magnetischen Sortierung und adoptiven Transfer-Techniken.
- Setzt den Zugang zu CBir1-TCR-transgenen Mäusen und Rag1-defizienten Empfängern für die Modelltreue voraus.
- Erfordert standardisierte histologische Bewertung und Gewebeprozessierung zur konsistenten Beurteilung von Entzündungen.
- Umfasst chirurgische und Perfusionsverfahren, die aseptische Technik und anatomische Präzision erfordern.
- Auf mechanistische Untersuchungen antigenspezifischer Antworten beschränkt; bildet allein weder die Komplexität des Mikrobioms noch eine Barrierestörung ab.
