Analyse des Parkinson-Mausmodells, das durch Adeno-assoziierte virale Vektoren induziert wird, die menschliches α-Synuclein kodieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die meisten wesentlichen Aspekte der Parkinson-Krankheit in einem Tiermodell zu reproduzieren. Die stereotaktische Abgabe von adeno-assoziierten viralen Vektoren, die das menschliche Synuclein in der Substantia nigra kodieren. Die Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die den Tod eines dopaminergen Neurons im nigrostriatalen Weg und folglich das Fortschreiten des Kontrollverlusts der willkürlichen Bewegung beinhaltet.

Dieser neurodegenerative Prozess wird von der Ablagerung von Proteinaggregaten im Gehirn begleitet, die hauptsächlich durch Synuclein gebildet werden. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Synuclein-Aggregate toll-ähnliche Rezeptoren auf den Mikroglia stimulieren können, wodurch eine neuronale Entzündung in der Substantia nigra ausgelöst wird. Darüber hinaus deuten Hinweise darauf hin, dass Synuclein-Aggregate von Antigen-präsentierenden Zellen für T-Zellen erfasst und präsentiert werden können, was eine adaptive Immunantwort induziert, die spezifisch für Synuclein ist.

Die stereotaktische Abgabe von adenoassoziierten viralen Vektoren, die das menschliche Synuclein in der Substantia nigra kodieren, hat gezeigt, dass sie viele wesentliche Aspekte der Krankheit reproduziert, einschließlich Synucleinpathologie, Mikrogliaaktivierung, T-Zell-Aktivierung, Neurodegeneration und motorische Beeinträchtigung. Diese Studie stellt eine Analyse dar, wie ein viraler Vektor und die Zeit nach der viralen Vektorabgabe das Ausmaß der menschlichen Synucleinexpression, Neurodegeneration und Neuroinflammation im nigrostriatalen Signalweg sowie den Grad der motorischen Beeinträchtigung in einem Mausmodell der einseitigen stereotaktischen Abgabe von menschlichem Synuclein in substantia nigra beeinflussen. Um eine aseptische Umgebung aufrechtzuerhalten, tragen Sie während der gesamten Operation geeignete chirurgische Kleidung, einschließlich Schuhüberzieher, Operationsmaske, Hygienebarriere, Handschuhe und Operationskappe.

Sprühen Sie Ethanol auf die Maus und das gesamte chirurgische Material, um die aseptische Umgebung zu erhalten. Um eine Analgesie auszulösen, injizieren Sie Carprofen subkutan alle 12 Stunden, beginnend eine Stunde vor der Operation und bis drei Tage nach der Operation. Um die Maus zu betäuben, legen Sie das Tier in eine Induktionskammer.

Öffnen Sie den Isofluranfluss mit einer Rate von 0,5% und erhöhen Sie ihn dann langsam auf 5% über etwa fünf Minuten, bis die Maus ihren Aufrichtungsreflex verloren hat. Entfernen Sie das Tier aus der Induktionskammer. Bringen Sie das Tier sofort in einen nicht atmungsaktiven Kreislauf mit einem Nasenkegel in geeigneter Größe.

Halten Sie die Mausanästhesie mit Isofluran 1% während der gesamten Operationszeit aufrecht. Bestätigen Sie, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie ihre Schwänze und Pfoten kneifen. Wenn die Maus nicht reagiert, wenn sie den Schwanz und die Pfoten kneift, bedeutet dies, dass die Maus vollständig betäubt ist.

Rasieren Sie den Mauskopf mit einer Schere. Reinigen Sie die Maushaut mit einem Wattestäbchen mit Chlorhexidin 2% und entfernen Sie alle Haare. Fixieren Sie den Mauskopf im stereotaktischen Rahmen.

Legen Sie ein Hornhautschutzmittel in beide Mausaugen und verwenden Sie ein Wattestäbchen. Um Stressinduktion bei anderen Nagetieren zu verhindern, vermeiden Sie die Anwesenheit einer anderen Maus im Operationssaal. Reinigen Sie den Mauskopf mit drei Runden Chlorhexidin 2%, gefolgt von Ethanol 70% Belichten Sie den Schädel mit chirurgischem Material und machen Sie ein dünnes Loch mit einem Bohrer bei den Koordinaten anteroposterior 2,8 mm und mediolateral 1,4 mm in Bezug auf die mediale Linie.

Legen Sie die Nadel einer 10-Mikroliter-Spritze in das Loch und bewegen Sie die Nadel langsam im Gehirn, bis sie auf 7,2 mm dorsoventral ankommt, Respekt vor Dura. Lassen Sie die Nadel zwei Minuten lang in der endgültigen Position, damit sich das Gewebe ein wenig absetzen kann, und injizieren Sie dann einen Mikroliter viraler Vektoren in die rechte Substantia nigra, mit einer Rate von 0,2 Mikrolitern alle 30 Sekunden. Lassen Sie die Nadel nach der Abgabe viraler Vektoren fünf Minuten lang in der gleichen Position und ziehen Sie sie dann langsam zurück.

Schließen Sie die Wunde mit einer sterilen Seidennaht. Legen Sie die Maus in den Hauskäfig, vorgewärmt, indem Sie sie über eine elektrische warme Matratze legen. Beurteilen Sie 12 Wochen nach der stereotaktischen Operation die motorische Leistung mit einer vereinfachten Version des zuvor beschriebenen Strahltests.

Verwenden Sie dazu einen horizontalen Balken von 25 cm Länge und 3 cm Breite. Die Balkenoberfläche muss von einem metallischen Gitter mit Quadraten von einem Zentimeter bedeckt und einen Zentimeter über dem Balken erhöht sein. Machen Sie ein Video der Maus, während Sie den Gitteroberflächenstrahl von einem Ende zum gegenüberliegenden Ende des Balkens durchqueren, wo sich der Hauskäfig befindet.

Trainieren Sie die Maus zwei Tage lang, bevor die Motorleistung bestimmt wird. Trainieren Sie am ersten Tag die Maus, fünfmal ohne das Gitter durch den Strahl zu gehen. Trainieren Sie am zweiten Tag die Maus, fünfmal in Gegenwart eines Gitters durch den Balken zu gehen.

Bewerten Sie am dritten Tag die Motorleistung. Quantifizieren Sie dazu die Anzahl der Fehler, die von den linken Pfoten oder von den rechten Pfoten separat ausgeführt werden, indem Sie die Videos in einem Zeitlupenmodus ansehen. Um die Maus zu betäuben, injizieren Sie intraperitoneal eine Mischung aus Ketamin und Xylazin.

Sobald die Maus vollständig betäubt ist, öffnen Sie den Thorax mit chirurgischem Material und legen Sie das Herz frei. Führen Sie dann eine flache Spitzennadel in den linken Ventrikel des Herzens ein. Durch Koppeln der Nadel an ein Rohr werden 50 Milliliter Phosphatpufferkochsalzlösung mit einer Rate von 9,5 Millilitern pro Minute mit einer Peristaltikpumpe perfundiert.

Entfernen Sie das Gehirn mit einer Schere und einer Pinzette und fixieren Sie es dann durch Eintauchen in fünf Milliliter 4% Paraformaldehyd in Phosphatpufferkochsalzlösung. Danach legen Sie das fixierte Gehirn in 15 Milliliter 30% Saccharose für 48 Stunden. Dann legen Sie das Gehirn in vier Milliliter Kryoprotektionslösung und speichern Sie das Gehirn bei 80 Grad, oder verwenden Sie es sofort im nächsten Schritt.

Um striatale Scheiben zu erhalten, schneiden Sie das Gehirn in 40 Mikrometer dicke Abschnitte, beginnend bei 1,34 mm und endend bei 0, 26 mm. Ernten Sie jede Scheibe in einer Kryotube mit zwei Millilitern gemäß anteroposteriorer Reihenfolge. Um eine immunhistochemische und immunfluoreszierende Analyse im Striatum durchzuführen, wählen Sie fünf koronale Striatalabschnitte, die in gleichmäßigen Abständen entnommen werden und die gesamte rostrokaudale Ausdehnung des Kerns abdecken.

Um die korrekte Abgabe viraler Vektoren in den dopaminergen Neuronen des nigrostriatalen Weges zu validieren, wurden GFP-kodierende Vektoren in die Substantia nigra injiziert, und 12 Wochen später wurden die GFP-Fluoreszenz- und Tyrosinhydroxylase-Immunreaktivität in der Substantia nigra und im Striatum durch Immunfluoreszenz analysiert. Die GFP-assoziierte Fluoreszenz befand sich ausschließlich in der ipsilateralen Stelle, und eine signifikante Kolokalisation mit Tyrosin-Hydroxylase-Immunreaktivität wurde sowohl in Substantia nigra als auch in Striatum beobachtet, was auf die korrekte Abgabe viraler Vektoren in den dopaminergen Neuronen des nigrostriatalen Weges hinweist. Um die Dosis von Vektoren zu testen, die Synuclein kodieren, um eine signifikante Überexpression von menschlichem Synuclein zu induzieren, die die Neurodegeneration der nigralen dopaminergen Neuronen fördert, wurden verschiedene Dosen der Vektoren injiziert.

Und 12 Wochen später wurden die Immunreaktivität des menschlichen Synucleins und das Ausmaß der Tyrosinhydroxylase-Immunreaktivität im nigrostriatalen Signalweg getestet. Die Immunreaktivität des menschlichen Synucleins war offensichtlich, wobei alle Dosen in der Substantia nigra getestet wurden. Allerdings zeigten nur Mäuse, die 10 bis 10 virale Genome pro Maus erhielten, eine offensichtliche Immunreaktivität des menschlichen Synucleins im Striatum.

Mäuse, die 10 bis 10 virale Genome pro Maus von Vektoren erhielten, die menschliches Synuclein kodieren, zeigten einen signifikanten Verlust von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra. Obwohl Mäuse, die die gleiche Dosis von Vektoren erhielten, die GFP kodieren, einen geringen Grad an neuronalem Verlust aufwiesen, zeigten diese Mäuse einen signifikant niedrigeren Grad an Neurodegeneration im Vergleich zu den Mäusen, die Vektoren erhielten, die menschliches Synuclein kodierten. Mit Hilfe des Strahltests wurde eine signifikante Verringerung der motorischen Leistungsfähigkeit ausschließlich bei diesen Mäusen festgestellt, die 10 bis 10 virale Genome pro Maus von Vektoren erhielten, die für menschliches Synuclein kodieren, wenn man die Anzahl der Fehler der rechten und linken Pfote vergleicht oder wenn man die Gesamtzahl der Fehler von Mäusen vergleicht, die Vektoren erhalten, die menschliches Synuclein kodieren. mit den Mäusen, die den Kontrollvektor erhalten.

Um den Beginn der menschlichen Synucleinexpression zu definieren, wurden Mäuse mit 10 bis 10 viralen Genomen pro Maus behandelt, von Vektoren, die menschliches Synuclein kodieren, oder Scheinoperationen, und das Ausmaß der menschlichen Synucleinexpression wurde in der Substantia Nigra einmal pro Woche in den Wochen zwei bis fünf nach der stereotaktischen Operation analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die menschliche Synucleinexpression in der fünften Woche nach der stereotaktischen Operation offensichtlich wurde. Um den Höhepunkt der Mikroglia-Aktivierung zu bestimmen, wurde das Ausmaß der Zellen, die hohe Iba1-Spiegel exprimierten, im Striatum von Mäusen in den Wochen 2-15 nach der Operation quantifiziert.

Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Zunahme der mikroglialen Aktivierung der ipsilateralen Seite, verglichen mit der kontralateralen Seite von Mäusen, 15 Wochen nach der viralen Impfung. Die Anzahl der regulatorischen T-Zellen, die in die substantielle Nigra infiltriert wurden, wurde zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert, nach der stereotaktischen Operation durch Immunfluoreszenz, gefolgt von konfokaler Mikroskopiebeobachtung. Der Höhepunkt der regulatorischen T-Zell-Infiltration in die Substantia nigra wurde in Woche 11 nach der Operation beobachtet.

Das hier analysierte Mausmodell der Neurodegeneration stellt ein nützliches Modell dar, um die Anzahl der Schlüsselaspekte der Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit zu untersuchen. Beteiligungsmechanismen, die an der Synucleinpathologie, der Mikrogliaaktivierung, der Beteiligung des peripheren Immunsystems, der Neuroinflammation und den Mechanismen der Neurodegeneration beteiligt sind Eine angemessene Dosis eines adeno-assoziierten viralen Vektors, Subtyp fünf, der für menschliches Synuclein kodiert, um Neurodegeneration, Neuroinflammation, T-Zell-Infiltration und motorische Beeinträchtigung zu induzieren, beträgt 10 bis 10 virale Genome pro Maus. Diese Studie zeigt, dass fünf Wochen nach der stereotaktischen Operation ein wichtiger Zeitpunkt ist, in dem die menschliche Synucleinexpression bereits offensichtlich war, jedoch in Abwesenheit einer motorischen Beeinträchtigung in diesem Tiermodell.

Dabei stellt dieser Zeitpunkt einen interessanten zeitlichen Punkt dar, um mit der Verabreichung experimenteller Therapien zu beginnen, die darauf zugeschnitten sind, das Fortschreiten von Neuroinflammation und Neurodegeneration zu stoppen. Der am besten geeignete Zeitpunkt, um Neuroinflammation in diesem Tiermodell zu analysieren, ist in der 15. Woche nach einer stereotaktischen Operation. Während ein geeigneter Zeitpunkt, um die T-Zell-Infiltration in das zentrale Nervensystem zu analysieren.

scheint in Woche 11 nach der viralen Vektorimpfung zu sein.