Gebrauchsfertige qPCR zum Nachweis von DNA aus Trypanosoma cruzi oder anderen pathogenen Organismen

Das Gelierungsprotokoll erzeugt gebrauchsfertige qPCR-Reaktionen, die die Zeit und die Schritte zum Starten eines Laufs verringern. Dieses Protokoll ermöglicht es, qPCR-Reaktionen für Qualität und große Mengen gleichzeitig zu erzeugen und zu kontrollieren, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Bedienerfehlern bei Rezeptberechnungen oder Aliquotierung in Bohrlöchern verringert wird. Diese Methode kann auf jede qPCR angewendet werden, die bereits vollständig im herkömmlichen gefrorenen Format optimiert ist.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da zwei der wichtigsten Qualitätskontrollschritte visuell sind. Um die Melezitoselösung herzustellen, wiegen Sie vier Gramm Melezitose in einem 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen, fügen Sie sechs Milliliter nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit maximaler Geschwindigkeit, bis das Pulver gelöst ist. Machen Sie das endgültige Volumen auf 10 Milliliter mit nukleasefreiem Wasser, dann etikettieren und lagern Sie die Lösung bei zwei bis acht Grad Celsius für bis zu sechs Monate.

Um die Trehalose-Lösung herzustellen, wiegen Sie vier Gramm Trehalose in einem 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen, fügen Sie sechs Milliliter nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit maximaler Geschwindigkeit, bis das Pulver gelöst ist. Dann das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 Milliliter auffüllen und die Lösung durch einen 0,2 μm Filter filtrieren. Beschriften und lagern Sie die Lösung bei zwei bis acht Grad Celsius für bis zu sechs Monate.

Um die Glykogenlösung vorzubereiten, wiegen Sie zwei Gramm Glykogen in einem 15-Milliliter-Röhrchen, fügen Sie sechs Milliliter nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie, bis das Pulver gelöst ist. Halten Sie die Lösung acht bis 12 Stunden bei zwei bis acht Grad Celsius, da die Solubilisierung von Glykogen viele Blasen erzeugt. Am nächsten Tag wird die Lösung aus der Inkubation entfernt, das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 Milliliter aufgefüllt und die markierte Lösung bei zwei bis acht Grad Celsius für bis zu sechs Monate gelagert.

Um die Lysinlösung vorzubereiten, wiegen Sie 7,5 Milligramm Lysin in einem 15-Milliliter-Röhrchen, fügen Sie sechs Milliliter nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie, bis das Pulver gelöst ist. Füllen Sie das Volumen auf 10 Milliliter mit nukleasefreiem Wasser. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Filter und lagern Sie sie bis zu sechs Monate bei zwei bis acht Grad Celsius.

Um die Geliermischung herzustellen, mischen Sie die entsprechenden Mengen an Stammlösungen in einem 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Mischen Sie die Reagenzien, indem Sie das Röhrchen 10 Mal umdrehen und lagern Sie die markierte Lösung bei zwei bis acht Grad Celsius für bis zu drei Monate. Um die qPCR-Mastermischung für die Gelierung vorzubereiten, tauen Sie die Reagenzien in einem Kühlcontainer auf.

Mischen Sie dann geeignete Volumina der Reagenzien in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, um genügend Master-Mix für einen Achtröhrchenstreifen oder eine 96-Well-Platte vorzubereiten. Als nächstes pipettieren Sie 18,5 Mikroliter des Geliermasters auf jede Reaktionsmulde und legen die Röhrchen oder Platten in den wärmeleitenden Träger im Vakuumofen. Wenn Sie 96 Well-Platten verwenden, legen Sie einen Bentonit-Tonbeutel für jeweils zwei 96 Well-Platten in den Ofen, um Wasser aufzunehmen.

Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Röhrchen oder Platten auf ordnungsgemäße Gelierung der Reagenzien, indem Sie sicherstellen, dass das Volumen sichtbar auf etwa fünf Mikroliter reduziert wird und sich die Flüssigkeiten beim Klopfen der Röhrchen oder Platten mit den Fingern nicht bewegen. Verschließen und lagern Sie die Röhrchen oder Platten vor Gebrauch acht bis 12 Stunden bei zwei bis acht Grad Celsius. Um die gelierte qPCR zu verwenden, entfernen Sie den Schlauchstreifen oder die Platte aus dem Kühlschrank und öffnen Sie ihn in einer Workstation zur Probenmanipulation.

Fügen Sie jedem Reaktionsgefäß 15 Mikroliter nukleasefreies Wasser und fünf Mikroliter DNA-Probe hinzu. Versiegeln Sie die Röhrchen oder Platten, führen Sie das gewünschte Experiment durch und führen Sie regelmäßige Datenanalysen durch. Im vorliegenden Protokoll wird die Temperatur in der Kammer konstant bei 30 Grad Celsius gehalten, während der Druck zwischen 910 und 930 Millibar und nahezu Vakuum variiert.

Nach dem Vakuumzyklus nimmt die Mastermischung im Inneren der Röhre an Volumen ab, wird am Boden geliert und spritzt nicht an die Wände, wenn die Rohre angezapft werden. Wenn die Gelierung unvollständig ist, spritzt die Flüssigkeit an die Rohrwände, wenn die Röhrchen angezapft werden. Der Nachweis von Trypanosoma cruzi-DNA unter Verwendung veröffentlichter Oligonukleotidsequenzen wird hier gezeigt.

Der Nachweis derselben Probe, wenn die Gelierung nicht korrekt durchgeführt wurde, führte zu einem Verlust der Empfindlichkeit. Der kritischste Schritt ist die Berechnung des Reagenzienvolumens vor der Gelierung. Der Bediener muss daran denken, kein Wasser hinzuzufügen, da es während des Prozesses entfernt wird.

Wenn die Protokollschritte genau befolgt werden, haben Bediener mit grundlegenden Labor- und Molekularbiologiekenntnissen keine Schwierigkeiten, den Gelierprozess durchzuführen.