Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

Die Brustdrüse ist hochdynamisch und durchläuft im Laufe des Lebens mehrere Umbaurunden. Unser Protokoll ermöglicht die Erfassung der zellulären Dynamik, die Gewebeumlagerungen in der gesunden und kranken Brustdrüse antreibt. Unser Brustbildgebungsfenster mit einem austauschbaren Deckel ermöglicht die intravitale Längsbildgebung der Brustdrüse über lange Zeiträume von bis zu mehreren Wochen.

Der austauschbare Deckel des Brustbildfensters sorgt jederzeit für optimale Bildgebungsbedingungen und ermöglicht eine Gewebemanipulation oder Medikamentenverabreichung zwischen den Bildgebungssitzungen. Unsere Methode liefert nicht nur Einblicke in die Biologie gesunder Brustdrüsen, sondern ermöglicht es uns auch, die Initiierung und Progression von Brusttumoren auf Einzelzellebene zu untersuchen. Beginnen Sie damit, den Deckel des Brustbildgebungsfensters auf eine sterile Oberfläche zu legen und Cyanacrylatkleber um den gesamten Rand des Deckelumfangs aufzutragen.

Legen Sie vorsichtig einen 10 Millimeter runden Glasdeckel auf den Deckel. Verwenden Sie einen sterilen Holzstäbchen, um den Glasdeckel zu positionieren, und drücken Sie ihn mit etwas Kraft nach unten, um eine luftdichte Abdichtung zwischen dem Glasdeckel und dem Rahmen des Deckels zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass das Glas die Löcher in den Armen des Deckels nicht verdeckt.

Desinfizieren Sie die Deckel und das Brustbildfenster, indem Sie sie mindestens 30 Minuten lang in 80% Ethanol in eine geschlossene Petrischale tauchen. Verwenden Sie eine in Aceton getränkte Baumwollspitze, um den überschüssigen Cyanacrylatkleber auf dem Glasdeckel zu entfernen. Um die Maus auf die Operation vorzubereiten, rasieren Sie den Bereich um die vierte Brustdrüse mit einer Rasierklinge.

Verwenden Sie die vierte Brustwarze als Orientierungspunkt und entfernen Sie die losen Haare mit Klebeband. Führen Sie einen Pfotenentnahmetest durch, um zu überprüfen, ob das Tier ausreichend betäubt ist. Heben Sie die Haut sanft mit einer feinen Graefe-Pinzette an und verwenden Sie eine kleine Federschere, um einen diagonalen Schnitt von 10 bis 15 Millimetern in der Haut auf dem vierten Brustfettpolster zu machen Verwenden Sie die vierte Brustwarze als Orientierungspunkt und achten Sie darauf, das Peritoneum oder die Brustdrüse nicht zu schneiden oder zu beschädigen.

Trennen Sie die Haut vom Brustfettpolster und den darunter liegenden Gewebeschichten mit stumpfer Dissektion von bis zu fünf bis acht Millimetern rund um die Inzisionslinie, um eine Tasche für den Fensterrahmen für die Brustbildgebung zu schaffen. Definieren Sie die Region von Interesse oder ROI basierend auf den makroskopischen Merkmalen des Brustgewebes, einschließlich der Lage des Lymphknotens oder einer Tumorläsion. Versuchen Sie, den ROI in Bezug auf den Schnitt zentral zu halten.

Nehmen Sie das Brustbildgebungsfenster mit einer sterilen Pinzette auf und testen Sie, ob der Schnitt groß genug ist, um das Fenster einzusetzen. Vergrößern Sie bei Bedarf den Schnitt leicht, bis das Brustbildfenster einpasst. Entfernen Sie das Fenster und verwenden Sie eine 5-0-Seidennaht, um eine Handtuchsaitennaht ein bis zwei Millimeter vom Rand des Einschnitts zu platzieren, beginnend mit dem kaudalen Ende und von außen bis innen der Haut.

Bewegen Sie sich etwa fünf Millimeter entlang des Einschnitts nach oben und führen Sie den Nahtfaden von innen nach außen durch die Haut. Wiederholen Sie diesen Vorgang entlang der Kante des Einschnitts und erzeugen Sie so eine kreisförmige Naht, die aus fünf bis sechs Schleifen besteht. Der endgültige Ausgang des Nahtfadens sollte sich etwa zwei bis fünf Millimeter vom ersten Eingang entfernt befinden.

Passen Sie das Brustbildfenster in den Schnitt an und verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die Haut vorsichtig in die Rille des Fensters zu legen. Achten Sie darauf, die Schlaufen der Naht draußen zu lassen. Ziehen Sie die Schlaufen der Handsaitennaht und ziehen Sie vorsichtig an beiden Enden der Naht, um sie in der Nut des Brustbildfensters festzuziehen.

Mit chirurgischen Knoten abbinden und den überschüssigen Faden abschneiden. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um Vaseline auf den inneren Rand des Fensters aufzutragen und das darunter liegende Gewebe zu vermeiden. Drücken Sie den Fensterrahmen mit steriler Pinzette vorsichtig nach unten und positionieren Sie den Deckel im Fensterrahmen.

Dadurch wird ein Luftvolumen zwischen dem Brustdrüsengewebe und dem Fensterdeckel der Brustbildgebung vermieden. Legen Sie die Spitzen der dünnen Pinzette durch die Löcher in den Armen des Deckels und ziehen Sie den Deckel fest, indem Sie ihn im Uhrzeigersinn drehen. Wenn nach dem Anziehen des Deckels etwas Luft übrig bleibt, führen Sie eine sterile Insulinnadel durch die Haut in den Hohlraum zwischen dem Brustgewebe und dem Deckel ein und ziehen Sie langsam den Kolben heraus, wodurch ein Vakuum zwischen dem Brustdrüsengewebe und dem Brustbildfensterdeckel entsteht.

Nun kann der Lymphknoten nach diesem Eingriff leicht beobachtet werden. Überprüfen Sie den Zustand des Brustbildfensterrahmens und des Deckels, einschließlich der Stabilität der Nähte oder möglicher Schäden am Deckel. Positionieren Sie die Maus so auf dem Inlay, dass das Brustbildfenster in das Loch des Imaging-Box-Inlays fällt.

Tragen Sie halbtransparentes und Papierklebeband über die Rückseite der Maus auf, um die Maus zu stabilisieren und die Gewebebewegung aufgrund der Atmung zu reduzieren. Bei Bildgebungssitzungen von mehr als drei Stunden legen Sie eine flexible Nadel subkutan in den Hals der Maus und befestigen Sie sie mit Papierklebeband. Befestigen Sie eine 10-Millimeter-Spritze mit einer Nährstoffmischung an einem flexiblen Silikonschlauch und drücken Sie die Nährstoffmischung bis zum Ende des Schlauches.

Verbinden Sie den Silikonschlauch mit der flexiblen Nadel und injizieren Sie alle 30 Minuten 50 Mikroliter der infundierten Lösung. Legen Sie den Deckel über die Bildbox, um sie zu schließen. Sichern Sie dann die Bildgebungsbox im Stadium des Mikroskops.

Stellen Sie sicher, dass die Maus im Bildverarbeitungsfeld stabil ist. Definieren Sie den Interessenbereich mit dem Epifluoreszenzmodus des Mikroskops und wenden Sie die Mikroskopeinstellungen an. Verwenden Sie die Spiralfunktion im Navigator-Modus der Bildgebungssoftware, um einen großen Übersichtskachelscan zu generieren und eine Referenzkarte des Gewebes zu erstellen.

Definieren Sie die Interessenregion innerhalb der Spiral-Übersicht und definieren Sie dann die oberen und unteren Z-Ebenen, um den Z-Stapel zu bestimmen. Drücken Sie Start, um die detaillierten dreidimensionalen oder vierdimensionalen Z-Stapel des Gewebes zu erhalten. Legen Sie die Spitzen der dünnen Pinzette durch die Brustbildfensterlöcher in den Armen des Deckels und lösen Sie den Deckel durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn.

Alternativ kann das Gewebe mit sterilen stumpfen Pinzetten manipuliert oder neu positioniert werden, um die Bildgebungsbedingungen für die spezifische Region von Interesse zu optimieren. Tragen Sie Vaseline auf den inneren Rand des Brustbildgebungsfensters auf und vermeiden Sie das darunter liegende Gewebe. Drücken Sie den Fensterrahmen mit steriler Pinzette vorsichtig nach unten und positionieren Sie den Deckel im Fensterrahmen.

Legen Sie schließlich die Spitzen der dünnen Pinzette durch die Löcher der Arme des Deckels und hellen Sie den Deckel auf, indem Sie ihn im Uhrzeigersinn drehen. Pubertale Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-Membran-Tomatenmembran-GFP-Mäuse wurden mit einer niedrigen Dosis Tamoxifen injiziert, was zu einer Cre-vermittelten Rekombination des Rosa26-Membran-Tomaten-Membran-GFP-Allels führte. Die Mäuse wurden an den Tagen eins, drei und fünf abgebildet, um die dynamischen Veränderungen in der sich entwickelnden Brustdrüse zu verfolgen.

Die repräsentativen Bilder zeigen das 3D-Rendering eines länglichen und verzweigten Brustkanals über mehrere Tage, das durch ein Brustbildfenster abgebildet wird. Einzelne Z-Ebenen-Bilder der Verzweigungsspitze und des länglichen Astes werden hier gezeigt. Einzelne Zellen im Stroma werden durch weiße Sternchen hervorgehoben.

Die repräsentativen Bilder zeigen den Leistenlymphknoten der Maus, der durch ein Brustbildgebungsfenster abgebildet ist. Die zweite harmonische Generation ist grün dargestellt. 3D-gerenderte Bilder einer mammären duktalen Struktur einer erwachsenen weiblichen E-Cadherin-Membran-CFP-Maus über mehrere aufeinanderfolgende Tage werden hier gezeigt.

Das Kollagen-I-Muster wurde verwendet, um den gleichen ROI zurückzuverfolgen, und das E-Cadherin-Membran-CFP-Signal wurde verwendet, um die duktalen Zellen zu markieren. Kikume grün-rote Mäuse wurden am Tag Null vor und nach der Exposition gegenüber violettem Licht aufgenommen. Die Bildgebungssitzungen wurden an den Tagen zwei, sechs und 10 nach der Konvertierung wiederholt.

Der gleiche Bereich der Brustdrüse wurde 10 Tage lang durch ein Brustbildfenster abgebildet. Kleinere Regionen wurden am Tag Null photokonvertiert und zeigten eine ähnliche Verdünnungsrate des roten Kikume-Signals im Laufe der Zeit, was auf eine gleiche Umschlagsrate im gesamten Epithel hinweist. Zoombilder der angegebenen Regionen zeigen sechs und 10 Tage nach der Fotokonvertierung eine proliferative Heterogenität auf zellulärer Ebene.

Die Quantifizierung des Rot-Grün-Verhältnisses verschiedener Zellen 10 Tage nach der Photokonversion ergab sehr variable Verdünnungsraten einiger Zellen innerhalb derselben duktalen Mikroumgebung. Ein entscheidender Schritt dieses Verfahrens ist das Öffnen des Deckels zwischen den Bildgebungssitzungen. Diese einzigartige Eigenschaft des Fensters verbessert die Bildgebungsbedingungen und ermöglicht eine Längsabbildung des Gewebes.

Das Brustbildgebungsfenster mit einem austauschbaren Deckel wird neue Fragen zu in vivo, schnell wirkenden Medikamententests und Screenings im Bereich der Tumorinitiierung und -progression in der Mammadrüse der Maus erleichtern.