Mit der 2-Photonen-Mikroskopie die Auswirkungen einer chronischen einseitigen Harnleiterobstruktion auf glomeruläre Prozesse quantifizieren

In den in dieser Studie vorgestellten Daten zeigen die dramatischen Auswirkungen einer einseitigen Harnleiterobstruktion auf Nierenfunktion, Entzündung und Fibrose. Es hilft uns, die pathophysiologischen Mechanismen der einseitigen Harnleiterobstruktion zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Zell-Zell-Interaktionen, subzelluläre Ereignisse zu untersuchen und Struktur und Funktion dynamisch innerhalb einer funktionierenden Niere zu assoziieren.

Die Demonstration des Harnleiterverfahrens wird von Dr. Silvia Campos-Bilderback durchgeführt, die Chirurgin in unserem Labor ist. Um zu beginnen, betäuben Sie die Ratte, machen Sie dann einen Schnitt entlang der Mittellinie und lokalisieren Sie die linke Niere, um sie von den umgebenden Peritonealorganen zu trennen. Nach der Lokalisierung des Nierenstiels, bestehend aus Nierenarterie, Nierenvene und Harnleiter, trennen Sie den Harnleiter, ohne die empfindliche Struktur zu beschädigen.

Verwenden Sie eine Pinzette, um eine 3-0-Naht um den Harnleiter zu schlingen und zu binden, und binden Sie dann einen Knoten ein paar Millimeter auf beiden Seiten des ersten Knotens, um eine vollständige Obstruktion zu gewährleisten. Sobald der Harnleiter gebunden ist, schließen Sie vorsichtig die aufeinanderfolgenden Muskelschichten und schließen Sie dann den Bauch vollständig. Verschließen Sie die Außenhaut mit chirurgischen Klammern.

Zur chirurgischen Vorbereitung legen Sie die anästhesierte Ratte mit einer venösen Zugangslinie auf die Seite, wobei die rasierte linke Flanke flach und gerade auf den Tisch zeigt. Stellen Sie sicher, dass sich die Vorderpfoten der Ratte berühren, ebenso wie die hinteren Pfoten. Sobald die Ratte positioniert ist, tasten Sie die linke Flanke direkt unter den Rippen ab, um nach der Niere zu tasten und die natürliche Position im Bauch zu bestimmen, dann zeichnen Sie eine Linie mit einem permanenten Marker entlang des rasierten Bereichs und halbieren Sie das Nierenzentrum in einer Nase-zu-Schwanz-Ausrichtung.

Verwenden Sie eine Zahnzange, um die Haut zu greifen und nach oben zu heben und die permanente Markerlinie mit einem Paar Hämostaten einzuklemmen, um das darunter liegende Gefäßsystem zu zerquetschen und Blutungen zu verhindern. Wiederholen Sie den Vorgang für die dünne äußere Muskelschicht, um Blutungen zu minimieren. Um den letzten Schnitt der dünnen inneren Bauchmuskelschicht zu machen, tasten Sie die Niere ab, um die Größe und Position abzuschätzen und die innere Muskelschicht mit einer Pinzette anzuheben, dann zerquetschen Sie eine Linie, die die Haut über der Niere mit den Hämostaten halbiert, die etwa 1/3 der geschätzten Größe der Niere ist.

Während Sie den Griff auf der Muskelschicht mit der Pinzette beibehalten, machen Sie den letzten Einschnitt. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette in jeder Hand, um das Nierenfett am unteren Pol der Niere mit einer Hand-über-Hand-Technik nach unten zu greifen und zu halten. Wenn Sie das Fett mit einer Hand fest im Griff haben, ziehen Sie das Fett und drücken Sie die Niere sehr sanft durch den Einschnitt.

Wenn die Niere nicht durchgeht, erweitern Sie leicht den Einschnitt. Um die weißen Blutkörperchen oder Leukozyten in den Kapillarschleifen zu identifizieren, verabreichen Sie Hoechst 33342 Kernfärbung bei 8 Mikrogramm pro Kilogramm Rattengewicht über eine verweilvenöse Zugangsleitung. Legen Sie die freiliegende Niere auf dem Mikroskop mit einer leichten Drehung gegen den Rand der Schale, so dass die Bauchseite der Niere den Deckschlitz berührt und die dorsale Seite vom Rand abgewandt ist.

Um die Bewegung weiter zu minimieren, packen Sie zwei sterile 2-mal-2-Mullbinden, die mit Kochsalzlösung gegen die dorsale Seite der Niere angefeuchtet sind, um den Kontakt der Bauchseite der Niere zum Rand zu verstärken. Wenn die Probe positioniert ist, schauen Sie durch das Mikroskopokular unter Epifluoreszenzbeleuchtung mit einem Dual-Pass-Rhodamin-FITC-Würfel. Wenn eine Bewegung in der Probenposition erkannt wird, nehmen Sie geringfügige Anpassungen vor, indem Sie die Gaze anpassen, um sicherzustellen, dass sie nicht unter die Niere drückt.

Rollen Sie die Ratte leicht um, so dass der Thorax weiter von der Schale entfernt ist. Scannen Sie die Oberfläche der Niere mit Epifluoreszenzbeleuchtung und markieren Sie die Glomeruli-Positionen mit der Software, die dem motorisierten Bühnenregler zugeordnet ist. Nehmen Sie für jeden Farbkanal unter 2-Photonen-Beleuchtung ein flaches 3D-Volumen des oberen Teils jedes markierten Glomerulus, das als Hintergrundbild dient.

Verwenden Sie in der Anzeigeoption der Bildgebungssoftware eine Pseudofarbpalette, um die schwachen Intensitäten der Hintergrundfluoreszenz der glomerulären Kapillarschleifen zu visualisieren. Verwenden Sie ein oberflächliches Blutgefäß als Brennpunkt, infundieren Sie langsam das fluoreszierende Texas Red RAP Serumalbumin oder TRRSA, während Sie den Anstieg und Abfall der Fluoreszenz aufgrund der systemischen Verteilung beobachten, bis eine Intensität im peritubulären Gefäßsystem und in den Kapillarschleifen knapp unter der Sättigung liegt. Nach 10 Minuten erfassen Sie 3D-Volumen für alle markierten und abgebildeten Glomeruli in Abständen von 1 Mikrometer.

Suchen Sie ein geeignetes Gefäß, entweder eine Kapillarschleife oder ein peritubuläres Gefäß, und drehen Sie das Bild dann mit der Funktion Drehen, da die Zeilenscanfunktion in der Bildakquisitionssoftware erfordert, dass das Gefäß senkrecht steht. Sobald das Schiff gedreht ist und flach liegt, wählen Sie die XT-Funktion im Menü Erfassung und richten Sie es so ein, dass es 4.000 Zeilen scannt. Platzieren Sie die Linie über das zu untersuchende Gefäß mit der Fokusebene am maximalen Durchmesser des Segments.

Klicken Sie anschließend mit der linken Maustaste auf das zusammengesetzte Farbbild und wählen Sie die Registerkarte Schnappschuss aufnehmen, um ein Referenzbild des Bereichs zu generieren, in dem der Zeilenscan aufgenommen wurde. Klicken Sie sofort auf die Schaltfläche Start, um den Zeilenscan des Schiffes zu erfassen. Importieren Sie später die Zeilenscans in die Bildverarbeitungssoftware, um die RBC-Durchflussrate zu bestimmen.

Öffnen Sie im Dropdown-Menü Messen das Dialogfeld Regionsstatistik anzeigen, und wählen Sie das Einzellinienzeichnungswerkzeug aus, um eine Linie zu zeichnen, die der Neigung der RBC-Schatten entspricht. Nachdem Sie die Breite und Höhe der Linie notiert haben, verwenden Sie eine Gleichung, um die Geschwindigkeit zu berechnen, und erhalten Sie dann durchschnittlich fünf Berechnungen, um die Geschwindigkeit für jeden Zeilenscan zu melden. Zentrieren Sie einen Glomerulus im Bildgebungsfeld und nehmen Sie einen 3D-Datensatz auf, der an der glomerulären Oberfläche beginnt und bei 30 bis 35 Mikrometern endet.

Verwenden Sie eine Schrittweite von 1 Mikrometer in Z-Richtung. Identifizieren Sie die WBCs, indem Sie den blauen Hoechst-Kanal mit dem Texas Red-Albuminkanal vergleichen, indem Sie nach dem Ausschluss von rotem Farbstoff in der Kapillarschleife und einem entsprechenden nuklearen Fleck suchen. Wenn die Leukozyten über drei optische Schnitte statisch erscheinen, definieren Sie die Zellen als haftend und melden Sie dann die Werte als Vorkommen pro 10 optische Schnitte von der Oberseite des Glomerulus, die in Abständen von 1 Mikrometer aufgenommen wurden.

Die Anzahl der glomerulären pro Feld bei Münchner Wistar Fromter oder MWF-Ratten war in der 5-wöchigen UUO-Gruppe höher als bei unbehandelten Ratten. Sprague-Dawley-Ratten oder SD-Ratten gingen nach fünf Wochen der einseitigen Harnleiterobstruktion von keiner Oberflächenglomeruli auf 2,02 pro Feld über. Dreidimensionale rekonstruierte Bilder wurden beobachtet, um die Nierenoberfläche zu betrachten.

Die 5-wöchige einseitige uretale Obstruktion bei den SD-Ratten führte nicht zu Bereichen, die normalen tubulären Epithelien ähnelten, wie sie bei der MWF beobachtet wurden, unbehandelt und teilweise bei 5-wöchigen UUO-MWF-Ratten. In der Untersuchung der renalen Gefäßdynamik war der renale Blutfluss in den 5-wöchigen UUO-MWF- und SD-Gruppen im Vergleich zu unbehandelten Ratten signifikant reduziert. Die RBC-Geschwindigkeit innerhalb der glomerulären Kapillarschleifen war bei den 5-wöchigen UUO-MWF- und SD-Ratten im Vergleich zu unbehandelten MWF-Ratten signifikant verringert.

Darüber hinaus hatten unbehandelte MWF-Ratten weniger Leukozyten pro 10 optische Schnitte von oben, während die Anzahl bei 5-wöchigen UUO-MWF- und 5-wöchigen UUO-SD-Ratten anstieg. Bei einseitiger uretaler Obstruktion wurde eine Zunahme der Albuminpermeabilität beobachtet. Eine Albuminakkumulation im Bowman-Raum war nach einseitiger Harnwegsobstruktion intensiv.

Die Endozytose des S1-Abschnitts ist eine große Menge an Albumin, wie sie unter physiologischen Bedingungen bei unbehandelten MWF-Ratten beobachtet wurde. Die gleiche Aufnahme konnte bei den MWF- oder SD-Ratten nach 5 Wochen einseitiger urettaler Obstruktion nicht beobachtet werden. Viele verschiedene Methoden wie die wiederholte Bildgebung zur Untersuchung eines Prozesses im Laufe der Zeit, die Fixierung eines bestimmten Bereichs für die Bildgebung und die anschließende Verwendung des fixierten Gewebes zur Durchführung einer höher aufgelösten Mikroskopie können in Verbindung mit dieser Technik durchgeführt werden.

Die Technik gilt als disruptive Technologie. Es ermöglicht den Ermittlern, viele neue Fragen zu beantworten. Dabei wurden neue Erkenntnisse gewonnen und Paradigmenwechseldaten gewonnen.