Name: Extraktion und Reinigung von FAHD1-Protein aus Schweineniere und Mausleber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Erfahren Sie die physiologische Extraktion und Reinigung von FAHD1-Protein aus Schweineniere und Mausleber. Diese Methode bewahrt die natürliche Faltung und katalytische Aktivität für Antikörperentwicklung.

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Die Autoren sind sehr dankbar für die technische Unterstützung durch Ayse Öztürk und Eva Albertini. Mäuse, die zur Erzeugung von Lebergewebe verwendet wurden, wurden unter der Aufsicht von Univ.-Doz gepflegt. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institut für Biomedizinische Alternsforschung an der Universität Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österreich).

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).</li>
<li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization%2C+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+%28FAHD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molcules%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009(2021).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).</li>
<li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins%3A+Between+meaning+and+different+methods%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Technologies+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li>
<li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li>
<li>Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
<li>Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).</li>
<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Kritische Schritte im Protokoll Die Einhaltung gemeinsamer Richtlinien für den Umgang mit Proteinen ist unerlässlich, wie z.B. die Arbeit auf Eis und bei moderaten pH- und Salzbedingungen. Die Verwendung von Proteasehemmern ist für die Methode von Vorteil, während die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren dringend empfohlen wird. Das Einfrieren und Auftauen der Probe kann immer zu einer Proteinausfällung (zumindest teilweise) führen, daher sollte jedes aufgetaute Aliquot des anfänglichen Proteinlysats ...

Das eukaryotische FAH-domänenhaltige Protein 1 (FAHD1) wirkt als bifunktionelle Oxalacetat (OAA)-Decarboxylase (ODx)1 und Acylpyruvathydrolase (ApH)2. Es ist in Mitochondrien 2 lokalisiert und gehört zur breiten FAH-Superfamilie der Enzyme 1,2,3,4,5,6. Während seine ApH-Aktivität nur von geringer Relevanz ist, ist die ODx-Aktivität von FAHD1 an der Regulation des TCA-Zyklusflusses 1,7,8,9 beteiligt. OAA wird nicht nur für die zentrale Citratsynthase-Reaktion im Tricarbonsäurezyklus benötigt, sondern wirkt auch als kompetitiver Inhibitor der Succinat-Dehydrogenase als Teil des Elektronentransportsystems und als kataplerotischer Metabolit. Die Herunterregulierung der FAHD1-Genexpression in menschlichen Nabelvenendothelzellen (HUVEC) führte zu einer signifikanten Verringerung der Zellproliferation10 und einer signifikanten Hemmung des mitochondrialen Membranpotentials, verbunden mit einem gleichzeitigen Wechsel zur Glykolyse. Das Arbeitsmodell bezieht sich auf den mitochondrialen Dysfunktions-assoziierten Seneszenz (MiDAS)11-ähnlichen Phänotyp 8, bei dem die mitochondrialen OAA-Spiegel durch die FAHD1-Aktivität 1,8,9 streng reguliert werden.
Rekombinantes Protein ist leichter durch Expression und Reinigung von Bakterien12 als von Gewebe zu erhalten. Ein in Bakterien exprimiertes Protein kann jedoch durch mögliches Fehlen posttranslationaler Modifikationen verzerrt sein oder einfach problematisch sein (d. H. Aufgrund von Plasmidverlust, bakteriellen Stressreaktionen, verzerrten / ungeformten Disulfidbindungen, keiner oder schlechter Sekretion, Proteinaggregation, proteolytischer Spaltung usw.). Für bestimmte Anwendungen muss Protein aus Zelllysat oder Gewebe gewonnen werden, um solche Modifikationen einzuschließen und/oder mögliche Artefakte auszuschließen. Gereinigtes Protein aus Gewebe unterstützt die Entwicklung hochwertiger Antikörper und/oder potenter und spezifischer pharmakologischer Inhibitoren für ausgewählte Enzyme, wie z.B. für FAHD113.
Dieses Manuskript stellt eine Reihe von Methoden zur Extraktion und Reinigung von FAHD1 aus Schweineniere und Mausleber vor. Die beschriebenen Methoden erfordern eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC), verwenden aber ansonsten gängige Laborgeräte. Alternative Methoden können an anderer Stellegefunden werden 14,15,16,17. Nach der Gesamtproteinextraktion umfasst das vorgeschlagene Protokoll eine Testphase, in der Teilprotokolle für die Ammoniumsulfatfällung und die Chromatographie des Ionenaustauschs diskutiert werden (Abbildung 1). Nach der Definition dieser Subprotokolle wird das interessierende Protein über eine sequentielle Strategie unter Verwendung von Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie mit FPLC extrahiert. Basierend auf diesen Richtlinien kann das endgültige Protokoll individuell für andere Proteine von Interesse angepasst werden.
<img alt="Arbeitsablauf bei der Gewebeverarbeitung: Zentrifugation, Fällung, Chromatographie; Western-Blot-Analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Die Gesamtstrategie dieses Protokolls. Von oben nach unten: Protein wird aus Geweben extrahiert. Gewebehomogenat wird hergestellt, zentrifugiert und filtriert. Für jedes Paar von überstehenden und aus Pellets gewonnenen Proben müssen Tests zur Ammoniumsulfatfällung und zur Ionenaustauschchromatographie (FPLC) durchgeführt werden, um optimale Bedingungen zu untersuchen. Nach der Festlegung dieser Subprotokolle kann das Protein durch ein sequentielles Verfahren der Ammoniumsulfatfällung, der Ionenaustauschchromatographie und der repetitiven Größenausschlusschromatographie (FPLC) bei unterschiedlichen pH- und Salzkonzentrationen extrahiert werden. Alle Schritte müssen von Western Blot kontrolliert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Filtereinheiten</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0,22 &micro; m, PES 33 mm, nicht steril</td></tr><tr><td>0,45 &micro; m Filtereinheiten</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0,45 &micro; m, PES 33 mm, nicht steril</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>Zentrifugalröhrchen</td></tr><tr><td>50 mL Falcon Röhrchen</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>Zentrifugalröhrchen</td></tr><tr><td>96-Well UV Microplate</td><td>Thermo-Fischer</td><td>8404</td><td>UV/VIS transparente 96 Well Platten mit flachem Boden</td></tr><tr><td>Acrylamid/Bis-Lösung (40%, Verhältnis 29:1)</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>40% Acrylamid/Bis-Acrylamid, 29:1 (3,3% Vernetzer) Lösung zum Vergießen von Polyacrylamid-Gelen</td></tr> <tr><td>&Auml; KTA FPLC-System</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td> <td>-</td> <td>unter Verwendung des FPLC-Systems von GE Healthcare; es existieren verschiedene kundenspezifische Versionen; in dieser Arbeit wurde das "&Auml; KTA pure" System</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC901024</td><td>Zentrifualfilter für die Proteinanreicherung; 10 kDa Molekularmassenfilter; 15 mL</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC801024</td><td>Zentrifidfilter für die Proteinanreicherung; 10 kDa Molekularmassenfilter; 4 mL</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfatpulver</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>Ammoniumsulfat für die Molekularbiologie, &GE; 99,0 %</td></tr> <tr><td>Ammoniumpersulfat-Reagenzqualität, 98 %</td> <td>MERCK</td><td>215589</td><td>Katalysator für die Polymerisation von Acrylamidgelen.</td></tr><tr><td>Coomassie Brillantblau R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>Coomassie Brillantblau R 250 (C.I. 42660) für die Elektrophorese Warenzeichen von Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g/l, H2O, 25 &deg; C)</td></tr><tr><td>Zellulosemembran für Dialyseschläuche</td><td>MERCK</td><td>D9277</td><td>Zellulosemembranen für den Austausch von Puffern über die Dialyse.</td></tr><tr><td>Eppendof Röhrchen 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>Mikrozentrifugalröhrchen; autoklaviert</td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>28989334</td><td>HiLoad Superdex 75 pg vorgepackte Säulen sind für die hochauflösende Größenausschlusschromatographie von rekombinanten Proteinen</td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membran</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>PVDF-Membranen sind Protein-Blotting-Membranen, die für Fluoreszenz- und Multiplex-Fluoreszenzanwendungen optimiert sind.</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Elektrophoretische Transferzelle</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>Verwenden Sie die Mini Trans-Blot Zelle zum schnellen Abtupfen von Mini-PROTEAN Fertigteilen und Handgegossenen Gelen.</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertikale Elektrophoresezelle für Mini-Fertiggele</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>vertikales 4-Gel-Elektrophoresesystem, bestehend aus Elektrodenbaugruppe, Begleitmodul, Tank, Deckel mit Stromkabeln, Mini-Zellen-Pufferdam.</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Mono Q-Säulen sind Säulen mit starkem Anionenaustauschchromatographie für die Proteinanalyse oder das hochauflösende Polieren von Proteinen in kleinem Maßstab.</td></tr><tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516901</td><td>Mono S Säulen sind starke Kationenaustausch-Chromatographiesäulen für die Proteinanalyse oder das hochauflösende Polieren von Proteinen in kleinem Maßstab.</td></tr><tr><td>PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter, 10 bis 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>Eine Mischung aus 10 blau-, orange- und grün gefärbten Proteinen (10 bis 180 kDa) zur Verwendung als Größenstandards in der Proteinelektrophorese (SDS-PAGE) und beim Western Blotting.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>Ein zweikomponentiger, hochpräziser, waschmittelverträglicher Proteinassay zur Bestimmung der Proteinkonzentration.</td></tr><tr><td>Sonifikator 250; Ultraschall-Zelldisruptor mit Konverter</td><td>Branson-Neue</td><td></td> <td>Modelle bei https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td></tr><tr><td>Schweine Anti-Kaninchen-Immunglobuline/HRP (affinitätsisoliert)</td><td>Agilent Dako</td><td>P0399</td><td>Der Antikörper, der für die Meerrettich-Peroxidase-Konjugation verwendet wird, reagiert mit Kaninchen-Immunglobulinen aller Klassen.</td></tr><tr><td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethan, TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED (N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylendiamin) ist ein Molekül, das eine schnelle Polymerisation von Polyacrylamid-Gelen ermöglicht.</td></tr><tr><td>Tube Roller</td><td></td> <td>-</td> <td>Eine allgemeine Rohrrotatorrolle; z.B. ein neues Modell bei https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td> <td>-</td> <td>Ein allgemeines Rohrrotatorrad; z.B. ein neues Modell bei https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td><td></td></tr> <tr><td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>Neue Modelle bei https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td></tr></tbody></table>

extraktion und reinigung von fahd1-protein aus schweineniere und mausleber

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Fumarylacetoacetathydrolase-Domänen-haltiges Protein 1 (FAHD1) ist das erste identifizierte Mitglied der FAH-Superfamilie in Eukaryoten und wirkt als Oxalacetat-Decarboxylase in Mitochondrien. Dieser Artikel stellt eine Reihe von Methoden zur Extraktion und Reinigung von FAHD1 aus Schweineniere und Mausleber vor. Abgedeckte Methoden sind die Ionenaustauschchromatographie mit schneller Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC), die präparative und analytische Gelfiltration mit FPLC und proteomische Ansätze. Nach der Gesamtproteinextraktion wurden die Ammoniumsulfatfällung und die Chromatographie des Ionenaustauschs untersucht, und FAHD1 wurde über eine sequentielle Strategie unter Verwendung der Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie extrahiert. Dieser repräsentative Ansatz kann an andere Proteine von Interesse angepasst werden (in signifikanten Mengen exprimiert) und für andere Gewebe modifiziert werden. Gereinigtes Protein aus Gewebe kann die Entwicklung hochwertiger Antikörper und/oder potenter und spezifischer pharmakologischer Inhibitoren unterstützen.

Das FAHD1-Protein wurde mit dem vorgestellten Protokoll aus Schweineniere und Mausleber extrahiert. Für Mausgewebe sind mehrere Organe erforderlich, um nach dem letzten Reinigungsschritt mehrere μg zu erhalten. Aus diesem Grund konzentriert sich dieser Artikel auf die Extraktion von FAHD1 aus Schweinenieren, was ein viel exemplarischeres Experiment ist. Die Extraktion von FAHD1 aus der Mausleber wird durchgeführt, um die Schwierigkeiten und möglichen Fallstricke dieses Protokolls darzustellen. Es wird allgemein empfohlen...

Dieses Protokoll beschreibt, wie das domänenhaltige Fumarylacetoacetat-Hydrolase-haltige Protein 1 (FAHD1) aus Schweineniere und Mausleber extrahiert werden kann. Die aufgeführten Methoden können an andere Proteine von Interesse angepasst und für andere Gewebe modifiziert werden.

Extraktion und Reinigung von FAHD1-Protein aus Schweineniere und Mausleber

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Die Reinigung von rekombinantem Protein aus Bakterien ist eine etablierte Methode. Bei der Verwendung dieser Techniken können jedoch mehrere Probleme auftreten. Methoden zu haben, um Protein aus Gewebe zu extrahieren, ist sicherlich ansprechend.Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass das Protein in seiner physiologischen Form extrahiert werden kann, einschließlich aller gegenseitigen Wirkungen, die sich auf seine Faltung und katalytische Aktivität auswirken können. Dieser Ansatz kann an andere Proteine von Interesse angepasst und für anderes Gewebe modifiziert werden. Gereinigtes Protein aus Gewebe kann die Entwicklung hochwertiger Antikörper und pharmakologischer Inhibitoren unterstützen.Bereiten Sie zunächst den Proteinlysepuffer vor, indem Sie 250 Milliliter PBS mit 50 Millimolar Natriumfluorid, einem millimolaren Phenylmethylsulfonylfluorid, zwei Mikrogramm pro Milliliter Aprotinin und einem millimolar aktivierten Orthovanadat mischen. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheit. Bereiten Sie Röhrchen mit zwei Millilitern Lysepuffer pro Gramm Gewebe vor und legen Sie sie auf Eis.Um die Gewebeprobe vorzubereiten, sezieren Sie das Gewebe von jeweils etwa 100 Milligramm auf einer vorgereinigten Glasplatte, die auf Eis in einer Styroporschaumbox platziert ist. Die Gewebestücke zur anschließenden Lyse in die vorbereiteten Röhrchen überführen. Um eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung herzustellen, erhitzen Sie 500 Milliliter doppelt destilliertes Wasser auf 70 Grad Celsius.Während des Rührens fügen Sie allmählich Ammoniumsulfatpulver hinzu, bis kein Ammoniumsulfat mehr gelöst ist. Kühlen Sie diese gesättigte Lösung auf Raumtemperatur ab und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Um das Schweinenierengewebe zu homogenisieren, beschallen Sie die Suspension vorzugsweise mit einer Ultraschallsonde, während Sie die Probe auf Eis halten.Verwenden Sie im Falle von Mauslebergewebe einen elektrischen Homogenisator und waschen Sie ihn regelmäßig in PBS, um Verstopfungen zu vermeiden, während die Proben auf Eis gehalten werden. Nehmen Sie 20 Mikroliter aus den Proben und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen des homogenisierten Gewebes richtig zerstört werden. Andernfalls wiederholen Sie die Homogenisierung.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in einer frischen Tube und legen Sie ihn auf Eis. Filtern Sie anschließend den Überstand mit 0,45 Mikrometer und 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheiten.Aliquot den Überstand in 10-Milliliter-Chargen und bei minus 20 Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder bei minus 80 Grad Celsius für längere Lagerung einfrieren. Bereiten Sie eine 50-Mikroliter-Probe für die SDS-PAGE- oder Western-Blot-Analyse vor, indem Sie 10 Mikroliter des Fünffachen des SDS-Probenpuffers zu 40 Mikrolitern des Überstands hinzufügen und dann 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius sieden. Bereiten Sie ein diskontinuierliches 12,5% Polyacrylamid SDS-PAGE Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.Um die SDS-PAGE-Analyse durchzuführen, laden Sie die Vertiefungen des Gels anschließend mit einer Proteinmarkerleiter, fünf Nanogramm humanem FAHD1-rekombinantem Protein als Positivkontrolle, 20 Mikrolitern der zu analysierenden Probe und den verbleibenden Vertiefungen mit 20 Mikrolitern vorbereitetem SDS-PAGE-Probenpuffer. Führen Sie die SDS-PAGE-Gele mit 125 Volt unter Verwendung des SDS-Laufpuffers aus. Nachdem SDS-PAGE abgeschlossen ist, führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch und untersuchen Sie die Membranen mit dem verfügbaren Antikörper, der gegen FAHD1 erhoben wird.Nach der Herstellung von überstehenden aliquoten, wie zuvor beschrieben, entweder nach dem Auftauen oder direkt nach der Proteinextraktion ohne Einfrieren der Probe verarbeiten. Filtern Sie die Probe mit einer 0,22 Mikrometer großen Filtereinheit, um mögliche Ausfällungen nach dem Auftauen auszuschließen. Bereiten Sie sechs 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis vor und übertragen Sie dann 250 Mikroliter Probe in jedes Röhrchen.Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von Ammoniumsulfat in den vorbereiteten Röhrchen vor und machen Sie das endgültige Volumen auf 1.000 Mikroliter mit Proteinlysepuffer aus. Inkubieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Röhrenrotator. Mit einer Tischzentrifuge bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und alle Überstände vorsichtig in separate Röhrchen überführen.Die resultierenden Pellets an der Luft trocknen und jedes von ihnen in 1.000 Mikroliter doppelt destilliertem Wasser resuspendieren. Mischen Sie für jedes Paar resuspendiertes Pellet und Überstand aus dem vorherigen Schritt 40 Mikroliter mit 10 Mikrolitern des Fünffachen des SDS-Probenpuffers und kochen Sie bei 95 Grad Celsius mit offenen Deckeln, bis der größte Teil der Flüssigkeit verdampft ist. Dann suspendiert das Pellet in einer Mischung aus 50% Dimethylsulfoxid in doppelt destilliertem Wasser.Führen Sie SDS-PAGE durch, indem Sie die Proben aus den resuspendierten Pellets und dem Überstand paarweise laden, gefolgt von einer Western Blot-Analyse. Lassen Sie die Gele jedoch drei Stunden lang mit 80 Volt laufen. Richten Sie das FPLC-System mit der anionischen oder kationischen Austauschsäule ein.Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina von 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von fünf Säulenvolumina doppelt destilliertem Wasser. Tragen Sie die Probe entweder durch Injektion oder mit einer Probenpumpe auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule mit einem Säulenvolumen des niedrigen Salzpuffers.Richten Sie eine lineare Gradientenelution von 100 % niedrigem Salzpuffer zu 100 % hohem Salzpuffer innerhalb von drei Säulenvolumina ein. Sammeln Sie kontinuierlich einen Milliliter Fraktionen. Nachdem der Gradient beendet ist, laufen Sie mit einem hohen Salzpuffer weiter, bis keine proteinassoziierten Peaks mehr im Chromatogramm über den Bereich eines Säulenvolumens nachgewiesen werden.Tragen Sie einen Milliliter 25% SDS auf, gelöst in 0,5 molaren Natriumhydroxid und doppelt destilliertem Wasser, um die Säule zu reinigen. Waschen Sie die Säule nacheinander mit drei Säulenvolumina aus doppelt destilliertem Wasser und drei Säulenvolumina aus 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser. Sammeln Sie die SDS-PAGE-Proben aller Spitzenfraktionen und des Durchflusses.Die gesammelten Fraktionen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Nachdem Sie sie über Western Blot untersucht haben, tauen und sammeln Sie die Fraktionen, die die Proteine von Interesse enthalten, und verwerfen Sie die anderen. Um den Reinigungsschritt durchzuführen, reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten auf zwei Milliliter.Filtern Sie die Lösung nacheinander mit 0,45 Mikrometer und 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheiten, um Mikrofällungen zu entfernen. Gleichen Sie die Größenausschlusschromatographiespalte mit einem Spaltenvolumen des laufenden Puffers aus, das ein millimolares Dithiothreitol enthält. Laden Sie die Probe auf die Säule und führen Sie die Chromatographieeinheit aus, bis alle Proteine wie zuvor beschrieben eluiert sind.Bereiten Sie 50-Mikroliter-Proben für die zuvor beschriebene SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse vor. Waschen Sie die Kolonne nacheinander mit einem Säulenvolumen doppelt destilliertem Wasser und einem Säulenvolumen von 20% Ethanol in doppelt destilliertem Wasser. Nach der Western Blot-Analyse werden alle FAHD1-haltigen Fraktionen gepoolt.Reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten auf zwei Milliliter. Western Blot Screening zeigt das Vorhandensein von Schweinen FAHD1 im Überstand mit einem Band bei 25 Kilodalton, während die markierte Positivkontrolle bei 34 Kilodalton läuft. Das Schwein FAHD1 aus Lysat wurde durch anionische Austauschchromatographie gereinigt und die Bindungsproteine durch Elution entfernt.Fraktionen, die Schweine FAHD1 enthielten, wurden durch Western Blot-Analyse identifiziert, gepoolt und konzentriert. Proteinproben wurden von der SEC gereinigt und durch westliche Blot-Analyse identifiziert. Die Ausbeute an Schweine-FAHD1-Protein betrug etwa ein Milligramm mit einem Reinheitsgrad von 80%.Die Western-Blot-Analyse wies das FAHD1-Protein der Maus im Durchfluss zusammen mit anderen Proteinen nach. Der Durchfluss wurde für die Größenausschlusschromatographie angewendet. Fraktionen, die FAHD1 enthielten, wurden gepoolt, konzentriert und auf die SDS-PAGE-Analyse angewendet.Die Ausbeute an Protein war jedoch nicht sehr hoch. Die spezifische enzymatische Aktivität des Schweins FAHD1 steigt mit dem Reinheitsgrad, wenn die relative Menge an FAHD1 pro Gesamtprotein erhöht wird. Höhere Konzentrationen von Ammoniumsulfat verursachen den Smile-Effekt, der bei niedrigerer Spannung aufgelöst werden kann.Weiteres Protein wurde im Lysat und Überstand in einer Konzentration von 15% gefunden. Bei höheren Konzentrationen können Proben jedoch ausfallen und können nicht nachgewiesen werden. Das hier vorgestellte Protokoll verlangt, dass das Protein lösbar ist.Optimale Bedingungen für Niederschlag und pH- oder Größenanpassung für die Chromatographie müssen getestet und definiert werden. Die Untersuchung der enzymatischen Funktion, die Untersuchung der Proteinstruktur und die Entwicklung von Antikörpern werden stark unterstützt, wenn Protein aus Gewebe extrahiert und nicht aus Bakterien extrahiert wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

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