Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays
10. Februar 2022
Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.
Dieses Wort beschreibt die Atmungsanalyse bei der Verarbeitung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus. Dieses Protokoll reduziert die Reinigungszeit erheblich und ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proben. Mitochondrien von Tieren eines beliebigen Geschlechts mit vereintem Hintergrund können mit diesem Protokoll verstümmelt werden, was die Untersuchung der Atmung unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen ermöglicht.
Diese Methode eignet sich für alle Forschungsbereiche, in denen die Funktion der Mitochondrien relevant ist, einschließlich Alterung, Drogentests, Krebs oder Entwicklung. Es kann sogar an andere Gewebe und Organismen angepasst werden. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien kalt sind, indem Sie während des Vorgangs alles auf das Eis legen, um die Mitochondrien vor Schäden zu schützen.
Legen Sie drei 50-Milliliter-Bechergläser pro Probe auf Eis und fügen Sie 10 Milliliter PBS in Becherglas eins, 10 Milliliter 10 Millimolar EDTA PBS in Becherglas zwei und vier Milliliter IB1 in Becherglas drei hinzu. Besprühen Sie das rechte Hinterteil einer eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell abfällt, und kleben Sie das Glied an das Kork-Sezierbrett und kleben Sie dann das linke vordere Glied ab. Machen Sie einen Schnitt mit einem sterilen Einwegskalpell durch die Haut vom Knie bis zu den Zehen.
Greifen Sie die Haut mit einer gezähnten Pinzette auf Knöchelhöhe und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere um den Knöchel. Erleichtern Sie die Haut von der darunter liegenden Muskulatur mit einer feinen Pinzette in der einen Hand, während Sie sie mit einer Zahnzange in der anderen Hand hochziehen. Sezieren Sie alle Skelettmuskeln vom Knöchel bis zum Knie und entfernen Sie das gesamte Bindegewebe über dem vorderen Musculus tibialis mit einer feinen Pinzette und Schere.
Finden Sie die vier distalen Sehnen des Musculus extensor digitorum longus und schneiden Sie sie in der Nähe ihrer Insertionen in den Zehen. Suchen Sie die vordere distale Sehne von Tibialis und schneiden Sie sie in der Nähe ihres Einführens unterhalb des Knöchels ab. Ziehen Sie die Sehnen Tibialis anterior und Extensor digitorum longus über den Knöchel, um die losen Enden zu befreien.
Greifen Sie die losen Enden der Sehnen und entspannen Sie die Muskeln vom Rest der Muskulatur in den Knochen, indem Sie sie hochziehen. Schneiden Sie die proximalen Sehnen dieser Muskeln so nah wie möglich an der Kniescheibe ab. Drehen Sie die Maus auf den Kopf, um mit der Extraktion von Gastrocnemius und Soleus fortzufahren.
Greifen Sie die Tasche zwischen dem Bizeps, Femoris und dem Gastrocnemius und trennen Sie diese Muskeln mit einer feinen Schere, um die proximale Gastrocnemius-Sehne zu visualisieren. Greifen und schneiden Sie die distale Achillessehne vorsichtig mit einer feinen Schere ab. Schneiden Sie die proximale Gastrocnemius-Sehne ab und befreien Sie sie mit dem darunter liegenden Soleus.
Sezieren Sie vorsichtig die verbleibenden Muskeln und fixieren Sie die Maus in der Ausgangsposition erneut, um den Quadrizepsmuskel zu sezieren. Entsorgen Sie das Fettgewebe und führen Sie dann eine feine Pinzette zwischen den Quadrizeps und den Femur ein, um den Muskel vom Knochen zu trennen. Greifen Sie die distalen Quadrizeps-Muskelsehnen und schneiden Sie die Sehne so nah wie möglich an die Kniescheibe.
Ziehen Sie den Quadrizeps nach oben und befreien Sie ihn mit einer feinen Schere am proximalen Einführen. Wiederholen Sie dasselbe für das linke Hinterbein. Spülen Sie alle Muskeln in Becherglas eins, dann zwei, gefolgt von Becher drei.
Zum Schluss hacken Sie alle Muskeln in Becherglas drei mit einer scharfen Schere auf Eis. Legen Sie die Aufhängung auf ein C-Rohr, schließen Sie es fest und befestigen Sie es kopfüber an der Hülse des Homogenisators. Teilen Sie das Homogenat in zwei 2 Milliliter vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie für 10 Minuten.
Dann den Überstand für weitere 10 Minuten in neue vorgekühlte Röhrchen und Zentrifuge überführen. Kombinieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern IB2 Übertragen Sie den Überstand auf ein neues vorgekühltes 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und kennzeichnen Sie es als Überstand Nummer zwei oder SN2. Suspendiert das letzte mitochondriale Pellet in 200 Mikrolitern Respensionspuffer.
Stellen Sie schnell 10 Mikroliter für die Proteinquantifizierung zur Verfügung und fügen Sie sofort 10 Mikroliter 10% FFA BSA zur verbleibenden mitochondrialen Suspension hinzu, um Schäden zu vermeiden. Die konzentrierte mitochondriale Suspension bei 10.500 mal G zentrifugieren für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Suspendieren Sie das mitochondriale Pellet in 100 Mikrolitern 1X Kopplungsassaymedium mit BSA, 1X Elektronenfluss-Assay-Medium mit BSA oder 1X Beta-Oxidationsmedium mit BSA, abhängig vom durchzuführenden Protokoll.
Verdünnen Sie diese konzentrierte mitochondriale Probe mit dem entsprechenden Assay-Medium auf 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter. Samen Sie 50 Mikroliter der Suspension pro Vertiefung in einer vorgekühlten 24-Well-Mikroplatte auf Eis. Fügen Sie in den Hintergrundkorrekturwellen nur das entsprechende Assay-Medium hinzu.
Lagern Sie die verbleibende mitochondriale Suspension bei minus 80 Grad Celsius, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen. Drehen Sie die Mikroplatte in der vorgekühlten präparativen Zentrifuge für 20 Minuten. In der Zwischenzeit den verbleibenden Assay auf 37 Grad Celsius erwärmen.
Lassen Sie die Mikroplatte nach der Zentrifugation fünf Minuten lang auf der Bank, um sich auszugleichen. Fügen Sie 450 Mikroliter des warmen Assay-Mediums pro Vertiefung langsam und vorsichtig hinzu, um eine Ablösung der Mitochondrien zu vermeiden. Legen Sie die Mikroplatte sofort in das Sauerstoffverbrauchsmessgerät ohne Deckel und starten Sie das Messprogramm.
Stellen Sie sicher, dass der erste Schritt eine 10-minütige Inkubation ist, damit sich die Mikroplatte erwärmen kann. Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie die Kartusche und die Mikroplatte, schalten Sie das Gerät aus und starten Sie die Analyse. Allgemeine Proteinprofile aus den verschiedenen Fraktionen, die durch serielle Zentrifugationen erhalten wurden, zeigten unterschiedliche Proteinpopulationen in den isolierten Fraktionen.
Das Vorhandensein des gesamten mitochondrialen Inhalts wird durch die starken Signale für Marker der äußeren und inneren mitochondrialen Membran und der nukleoidassoziierten Proteine deutlich. Fraktion N steht für Kerne und ungestörtes Material. Die meisten endoplasmatischen Retikulum-, Plasmamembran- oder Zytoplasmamarker in den SN1- oder SN2-Fraktionen unterstreichen die hohe Reinheit, die während der Isolierung erhalten wird.
Ein Anstieg des Sauerstoffverbrauchs wurde nach ADP-Zugabe in den Kopplungs- und Beta-Oxidationsassays beobachtet. Nach der Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon-Zugabe erreichte der Sauerstoffverbrauch seinen höchsten Niveau. Ein niedriges Atemkontrollverhältnis gewährleistet die Integrität der isolierten Mitochondrien.
Der Elektronenflussassay untersuchte die Aktivität der Elektronentransportkettenkomplexe einzeln oder in Kombination durch die Injektion spezifischer Substrate und Inhibitoren. Isolierende Mitochondrien sind extrem empfindlich. Daher müssen alle Schritte nach der Gewebeminderung sorgfältig und sorgfältig durchgeführt werden, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.
Experimentelle Assays können durch eine deterministische sematische Analyse wichtiger Mitochondrienmoleküle oder durch die Untersuchung der Montage respirometrischer Komplexe unter Verwendung der blauen nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese ergänzt werden.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein optimiertes Protokoll zur Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur von Mäusen dar, gefolgt von der Analyse der Atmung mittels Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR). Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Proben und ist anwendbar für die Untersuchung des mitochondrialen Stoffwechsels unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- mitochondriale Stoffwechselaktivität
- Analyse der Atmung
- umweltbedingte und genetische Eingriffe
Hintergrund
- Bedeutung der Mitochondrien bei der zellulären Energieregulation
- Relevanz der mitochondrialen Funktion bei Alterung, Arzneimittelprüfung, Krebs und Entwicklung
- Notwendigkeit effizienter Protokolle in der Mitochondrienforschung
Verwendete Methoden
- Mikroplattenbasierte respiratorische Assays
- Maus-Skelettmuskel als biologisches System
- Isolierungsprotokoll mit minimierter Reinigungszeit
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von mitochondrialen Fraktionen mit hoher Reinheit
- Erhöhter Sauerstoffverbrauch nach Zugabe von ADP festgestellt
- Deutliche Proteinprofile in den isolierten mitochondrialen Fraktionen, die die Methode validieren
Schlussfolgerungen
- Diese Studie beschreibt ein effizientes Protokoll zur Isolierung von Mitochondrien und Analyse der Atmung.
- Bedeutende Auswirkungen für Forschungsbereiche, die sich auf mitochondriale Funktion und Stoffwechsel konzentrieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die direkte Beurteilung der mitochondrialen Bioenergetik in physiologisch relevantem Skelettmuskelgewebe und behebt damit eine wesentliche Einschränkung von Zellkulturmodellen, die möglicherweise keine in-vivo-Bedingungen widerspiegeln. Durch die Bereitstellung einer skalierbaren Methode zur Isolierung hochreiner Mitochondrien aus Mausgewebe unterstützt es die mechanistische Risikominderung bei der Zielvalidierung sowie präklinischen Studien zu Stoffwechselerkrankungen, dem Altern und der Arzneimittelwirkung. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit, indem er die mitochondriale Funktion mit der gewebespezifischen Physiologie verknüpft und somit Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in frühen Entdeckungsphasen unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Untersuchung mitochondrialer Zielstrukturen im nativen Gewebekontext und klärt damit die Aktivität von Signalwegen und die Bindung an Zielstrukturen auf.
- Operativer Wert: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch quantitative Sauerstoffverbrauchsmessungen, die die gewebespezifische mitochondriale Physiologie widerspiegeln.
- Prädiktiver Wert: Erhöht die Zuverlässigkeit von Studien zur Modulation von Zielstrukturen, indem Artefakte, die mit der Anpassung an Zellkulturbedingungen verbunden sind, reduziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare, quantitative OCR-Messungen, die für die Standardisierung von Assays unter verschiedenen experimentellen Bedingungen geeignet sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die parallele Verarbeitung mehrerer Proben und erhöht somit den Durchsatz für die Untersuchung von Substanzen und den Vergleich von Genotypen.
- Assay-Eignung: Liefert isolierte Mitochondrien, die mit Kopplungs-, Elektronentransport- und Beta-Oxidations-Assay-Medien kompatibel sind und eine flexible Versuchsplanung ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der mitochondrialen Antwort auf Alterung, Geschlecht, genetische Modifikationen und pharmakologische Interventionen in einem krankheitsrelevanten System.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Analyse der mitochondrialen Funktion über verschiedene experimentelle Variablen hinweg mithilfe eines konsistenten Isolierungsworkflows.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckte Befunde mit der präklinischen Validierung, indem die gewebespezifische mitochondriale Integrität erhalten bleibt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Hypothesenprüfung bis zur Leitstruktur-Optimierung ein und liefert funktionelle mitochondriale Daten, die Entscheidungen über die Weiterentwicklung von Verbindungen unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die mechanistische Entrisikoung durch die Validierung von mitochondrialen Zielstrukturen in physiologisch relevantem Skelettmuskelgewebe.
- Screening: Ermöglicht die Assay-Entwicklung mit standardisierten, hochreinen mitochondrialen Präparationen, die für Mehrbrunnen-Respirometrie-Formate geeignet sind.
- Analytik: Liefert quantitative OCR-Messungen und Atemkontrollquotienten, die einen objektiven Vergleich von mitochondrialen Zuständen unter verschiedenen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet frühe Studien zur Zielstrukturmodulation mit präklinischen Ergebnissen durch Erhaltung der mitochondrialen Funktion im nativen Gewebe.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Isolationsplattform, die in verschiedenen therapeutischen Bereichen wie Stoffwechsel, Neurodegeneration und Onkologie anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert zielkonfidente Daten, indem es die mechanistische Uneindeutigkeit in Studien zur mitochondrialen Funktion verringert.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Gewebeverarbeitung und gleichzeitige Handhabung mehrerer Proben.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem es go/no-go-Entscheidungen in einem frühen Stadium auf Grundlage gewebe-spezifischer mitochondrialer Reaktionen ermöglicht.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen, die auf mitochondriale Signalwege bei Stoffwechselerkrankungen und dem Altern abzielen.
Umsetzungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Gewebe-Dissektion, Mitochondrien-Isolierung und Handhabung von Respirometrie-Assays.
- Setzt den Zugang zu Homogenisierungsgeräten, Zentrifugen und Instrumenten zur Messung des Sauerstoffverbrauchs voraus.
- Erfordert die Aufrechterhaltung einer Kühlkette während der gesamten Isolierung, um Integrität und Funktion der Mitochondrien zu bewahren.
- Erfordert eine Standardisierung der Protokolle für die Muskel-Dissektion und -Zerkleinerung über verschiedene Operateure und Labore hinweg.
- Eingeschränkt durch den Bedarf an frischem Gewebe, was die Probenspeicherung und die Flexibilität bei der Chargenverarbeitung begrenzt.
