Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen
13. Mai 2022
Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.
Es gibt mehrere Methoden, um die ROS-Produktion oder den oxidativen Stress in Zellen zu messen. Unter diesen ist die 2'7'Dichlorfluorescein-Diacetatsonde eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur direkten Messung des Redoxzustands. Diese Sonde ist lipophil und nicht fluoreszierend. Die Diffusion dieser Sonde über die Zellmembran ermöglicht der intrazellulären Esterase eine Spaltung an den beiden Esterbindungen, wodurch ein relativ polares und zellmembranundurchlässiges Produkt entsteht. Diese nicht-fluoreszierenden Moleküle reichern sich intrazellulär an, und die anschließende Oxidation durch ROS ergibt das hochfluoreszierende Produkt Dichlorfluorescein. Die Oxidation der Sonde ist das Produkt der Wirkung mehrerer Arten von ROS. Die durch Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden kann. In diesem Artikel haben wir eine Dichlorfluorescein-Diacetatsonde verwendet, um ROS durch Durchflusszytometrie zu messen und zu quantifizieren. Übertragen Sie 6-Well-Platten aus dem Inkubator in eine Laminar-Flow-Haube. Aspirieren Sie den Überstand. Und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie 2 ml niedriges Serum-DMEM pro Vertiefung hinzu. Und inkubieren Sie die 6-Well-Platte für zwei Stunden im Inkubator. Behandeln Sie die Zellen sechs Stunden lang mit dem Antioxidans. Behandeln Sie die Zellen 30 Minuten lang mit dem ROS-Induktor, A oder B. Aspirieren Sie den Überstand. Und waschen Sie die Zelle dreimal mit PBS, um alle Reize zu entfernen. Schalten Sie das Licht der Laminar-Flow-Haube aus und arbeiten Sie in der Dunkelheit. Fügen Sie 1 ml Dichlorfluorescein-Diacetatsonde in DMEM ohne Phenolrot hinzu. Fügen Sie 1 ml DMEM ohne Phenolrot zu den Kontroll-Autofluoreszenz-Kontrollzellen hinzu. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte für 30 Minuten im Inkubator. Überführen Sie die Platten auf Eis ins Labor. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 2 ml kaltem PBS pro Well. Fügen Sie jedem Bohrloch 0,5 ml kalt ablösenden Puffer hinzu. Ernten Sie die Zellen, indem Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren. Sammeln Sie sie in einem beschrifteten 1,5-ml-Röhrchen. Und zentrifugieren Sie sie bei 600 x g für fünf Minuten bei 4 ° C.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und dissoziieren Sie das Pellet vorsichtig mit Klopfen. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu jedem markierten Röhrchen zu waschen. Wenn es notwendig ist, verwenden Sie Wirbel in der niedrigsten Intensität für die vollständige Dissoziation des Pellets. Zentrifugieren Sie sie bei 600 x g für fünf Minuten bei 4 C.Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Insgesamt drei Wäschen. Resuspendieren Sie Zellpellets in 200 l FACS-Puffer. Dissoziieren Sie das Pellet in jedem Rohr vorsichtig vollständig, indem Sie einen Wirbel verwenden. Und auf beschriftete 5 ml für Durchflusszytometerröhren übertragen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis sie auf dem Durchflusszytometer analysiert werden. Erstellen Sie mit der Durchflusszytometrie-Software ein neues Experiment. Klicken Sie auf das Exemplar und es wird eine Liste der Röhrchen geöffnet. Doppelklicken Sie auf sie und benennen Sie sie um. Legen Sie die Autofluoreszenz-Kontrollröhre auf den Aspiratorarm und bewegen Sie die Basis vorsichtig nur nach links. Klicken Sie auf Daten erfassen und dann auf Daten aufzeichnen, und wählen Sie die gewünschte Stoppbedingung aus. Zeichnen Sie ein Tor um die Zellen von Interesse, ohne tote Zellen und Ablagerungen. Entfernen Sie die Röhre. Klicken Sie auf Nächste Röhre und führen Sie die Basalkontrollprobe aus. Klicken Sie auf Daten erfassen und dann unter Daten aufzeichnen.Öffnen Sie die Software. Fügen Sie die Beispiele mithilfe der Aktionsschaltfläche "Beispiele hinzufügen" hinzu. Klicken Sie auf Beispiel hinzufügen.Wählen Sie den Ordner Experimentelles Datum aus, und klicken Sie auf Auswählen.Doppelklicken Sie auf die erste Probe in Ihrem Arbeitsbereich, in diesem Fall auf die Autofluoreszenzsteuerung. Zeichnen Sie ein Polygon-Tor, um die Zelle von Interesse zu isolieren, ohne tote Zellen und Ablagerungen. Ändern Sie das Diagramm in ein Histogramm. Doppelklicken Sie innerhalb des M
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Bestimmung der zellulären Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung der 2′,7′-Dichlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA)-Sonde in Müller-Gliazellen (MGCs) vor. Die Methode ist so konzipiert, dass sie zugänglich und reproduzierbar ist und die Quantifizierung von ROS mittels Durchflusszytometrie ermöglicht.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Oxidativer Stress
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine entscheidende Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen.
- Die Messung von ROS ist entscheidend, um oxidativen Stress in Zellen zu verstehen.
- Die DCFH-DA-Sonde ist eine weit verbreitete Methode zum Nachweis von ROS.
- Das Protokoll legt den Schwerpunkt auf Reproduzierbarkeit und einfache Handhabung.
Zweck der Studie
- Eine klare Anleitung zur Detektion von ROS in Müller-Gliazellen bereitstellen.
- Die Quantifizierung von oxidativem Stress in neuronalen Zellen ermöglichen.
- Die Erforschung der Rolle von ROS in der Gliafunktion und Neurobiologie erleichtern.
Verwendete Methoden
- Die Zellkultur von Müller-Gliazellen wurde durchgeführt, um das biologische Modell zu erstellen.
- Die Zellen wurden mit Antioxidantien und ROS-Induktoren behandelt, um die ROS-Spiegel zu bewerten.
- Die DCFH-DA-Sonde wurde zur ROS-Detektion verwendet und mittels Durchflusszytometrie quantifiziert.
- Kritische Schritte umfassten das Waschen der Zellen mit PBS und die Kontrolle der Lichtexposition während der Assays.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll maß effektiv die zellulären ROS-Spiegel in Müller-Gliazellen.
- Die Durchflusszytometrie ermöglichte eine quantitative Analyse der ROS-Akkumulation.
- Die Ergebnisse bestätigten die Durchführbarkeit der Verwendung der DCFH-DA-Sonde unter den angegebenen Bedingungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine zuverlässige Methode zur Beurteilung von oxidativem Stress in Gliazellen bereit.
- Das Protokoll vereinfacht die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und erhöht so die Zugänglichkeit für Forschende.
- Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf das Verständnis des oxidativen Stresses in der Neurobiologie sowie auf potenzielle therapeutische Zielstrukturen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Die quantitative Messung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Müller-Gliazellen mithilfe von DCFH-DA und Durchflusszytometrie ermöglicht eine robuste Beurteilung von Mechanismen des oxidativen Stresses, die für neurodegenerative Erkrankungen und Netzhautkrankheitsmodelle relevant sind. Diese Methode unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien sowie die mechanistische Risikominimierung bei der Modulation antioxidativer Signalwege. Zuverlässige ROS-Quantifizierung liefert entscheidende Informationen für Portfolioentscheidungen bezüglich Wirkstoffkandidaten, die auf die Aufrechterhaltung des Redoxgleichgewichts in krankheitsrelevanten Systemen abzielen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Aktivierung antioxidativer Signalwege und der Redoxmodulation in Gliazellmodellen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an oxidativem Stress und zellulären Abwehrmechanismen beteiligt sind.
- Bietet eine mechanistische Entlastung von Risiken für kandidatenbasierte Interventionen, die den ROS-Spiegel beeinflussen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung validierter zellulärer Systeme für die Wirkstoff-Screening-Untersuchung gegen Endpunkte oxidativen Stresses.
- Liefert standardisierte, quantitative Nachweise reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die für die Reproduzierbarkeit von Assays und den Vergleich zwischen Studien geeignet sind.
- Ermöglicht die zuverlässige Bewertung von antioxidativen oder prooxidativen Wirkungen von Verbindungen in einem skalierbaren Format.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung mit krankheitsrelevanten Modellen für retinale Pathologien, die oxidativen Stress beinhalten, wie beispielsweise die diabetische Retinopathie.
- Unterstützt die translationale Kontinuität, indem die in vitro-Modulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit präklinischen Biomarkerstrategien verknüpft wird.
- Ermöglicht risikoadjustierte Weiterentwicklung von Antioxidans-Kandidaten basierend auf quantitativen zellulären Ergebnissen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Workflow zur Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ist in der frühen Entdeckungsphase bis hin zur Identifizierung von Leitverbindungen angesiedelt und unterstützt sowohl das Testen von Hypothesen als auch die Integration in nachgeschaltete Screening-Verfahren.
- Entdeckungsbiochemie Liefert quantitative Belege für die Aktivierung redoxabhängiger Signalwege und die zelluläre Antwort auf oxidativen Stress.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, auf Durchflusszytometrie basierende ROS-Messungen zur Substanztriage.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich von ROS-Spiegeln zwischen experimentellen Bedingungen unter Verwendung der geometrischen mittleren Fluoreszenzintensität.
- Translationale Forschung Verbindet die in vitro-Modulation oxidativer Stressreaktionen mit krankheitsrelevanten Endpunkten in Netzhautmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine standardisierte ROS-Assay-Plattform, die an verschiedene Zelltypen und redoxmodulierende Substanzen anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der entdeckungsorientierten Erforschung redoxsensitiver Zielstrukturen und verringert mechanistische Unschärfen.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) für Arbeitsabläufe in verteilten Teams.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über die Weiterentwicklung oder Einstellung von Wirkstoffen, die antioxidative Signalwege modulieren, und steigert die Kapitaleffizienz.
- Portfolioauswirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten, die auf Mechanismen des oxidativen Stresses abzielen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Bedienung der Durchflusszytometrie und der Datenanalyse.
- Benötigt Zugang zu Durchflusszytometrie-Geräten und kompatibler Analyse-Software.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Gating-Strategie und der Quantifizierung der Fluoreszenz voraus.
- Kann auf andere Zellmodelle übertragen werden, sofern die Protokolle für die Probenbeladung und Kontrollen optimiert werden.
- Hängt von einer sorgfältigen Probenvorbereitung ab, um die Variabilität des Assays und lichtinduzierte Artefakte zu minimieren.
