Osmotische pumpbasierte Wirkstoffabgabe für die In-vivo-Remyelinisierungsforschung am zentralen Nervensystem

Die Demyelinisierung findet bei multiplen Erkrankungen des zentralen Nervensystems statt. Eine zuverlässige In-vivo-Arzneimittelabgabetechnik ist für remyelinisierende Arzneimitteltests erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt eine osmotische pumpbasierte Methode, die eine langfristige Arzneimittelabgabe direkt in das Gehirnparenchym ermöglicht und die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels verbessert, mit breiter Anwendung in der Remyelinisierungsforschung.

Osmotische Pumpe ist von großem Wert für die Erforschung der Myelinregeneration, insbesondere für Medikamente mit kurzer Halbwertszeit, schlechter Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke und verschiedenen peripheren Nebenwirkungen. Die osmotische Pumpe kann die Blut-Hirn-Schranke umgehen und Medikamente direkt an den Corpus callosum abgeben, was die Bioverfügbarkeit von Medikamenten effektiv verbessert, insbesondere bei einigen Medikamenten mit kurzer Halbwertszeit. Sichern Sie zunächst den Kopf einer betäubten Maus im stereotaktischen Gerät mit einer Zahnstange und Ohrstangen.

Bedecken Sie den Tierkörper mit Ausnahme der Operationsstelle. Machen Sie mit einem Skalpell einen einen Zentimeter langen mittleren sagittalen Schnitt der Haut von der Basis des Halses bis zwischen den Augen, um den Schädel freizulegen. Wischen Sie mit einem Wattestäbchen mit 30% Wasserstoffperoxid vorsichtig die Oberfläche des Schädels ab, um die Schädelstrukturen sichtbar zu machen.

Passen Sie die Höhe der Zahnstange und der Ohrstangen an, um den Lambdapunkt und den Bregmapunkt auf der gleichen Höhe zu platzieren. Platzieren Sie die Spitze einer 10-Mikroliter- und 33-Gauge-Spritzennadel vorsichtig am Bregma-Punkt und setzen Sie die X-, Y- und Z-Koordinaten auf Null zurück. Bringen Sie die Spritze an die Injektionsstelle.

Bohren Sie langsam ein kleines Gratloch durch den Schädel an der Injektionsstelle, ohne die Dura mit einer Ein-Mikroliter-26-Gauge und einer 0,45-Millimeter-Spritzennadel zu durchdringen. Führen Sie die Mikroliter-Spritzennadel langsam durch das Loch in das Hirngewebe ein, bis eine bestimmte Tiefe erreicht ist. Injizieren Sie 1,5 Mikroliter 1% Lysolecithin mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Mikrolitern pro Minute.

Warten Sie fünf Minuten, bevor Sie die Spritze herausziehen, und nähen Sie die Haut mit 5-0 chirurgischen Nähten. Legen Sie die Maus, die sich einer Operation unterzogen hat, alleine in einen Käfig und überwachen Sie die Maus täglich nach der Operation. Befestigen Sie drei Abstandshalter zur Tiefenanpassung mit Gewebekleber an der Nadel der Hirninfusionskanüle, um eine Injektionstiefe von 1,5 Millimetern zu erreichen, die sich in der Nähe des Kallosums befindet.

Füllen Sie die osmotische Pumpe, indem Sie die Spritzennadel mit einem Pumpenpaket an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigen, und saugen Sie das Arzneimittel ab. Halten Sie die Pumpe in einer aufrechten Position. Führen Sie die Spritze in die Öffnung an der Oberseite der Pumpe ein und injizieren Sie das Arzneimittel langsam, ohne eine Luftblase zu erzeugen.

Ziehen Sie die Spritze langsam heraus, während die Flüssigkeit aus der Öffnung fließt. Entfernen Sie mit einer Schere oder Zange den weißen Flansch vom Durchflussregler. Setzen Sie den Strömungsmoderator in die Pumpe ein.

Um festzustellen, ob sich Blasen in der osmotischen Pumpe befinden, wiegen Sie die osmotische Pumpe vor und nach dem Befüllen separat. Schneiden Sie den Katheter entsprechend der Größe des Tieres auf die erforderliche Länge zu. Befestigen Sie den Katheter an der Gehirninfusionskanüle.

Füllen Sie den Katheter mit der Spritze mit Medikamenten, ohne Luft einzuführen. Verbinden Sie den Katheter mit dem Strömungsmoderator, so dass er etwa vier Millimeter des freiliegenden Strömungsmoderators abdeckt. Tauchen Sie die gefüllten Pumpen mindestens vier bis sechs Stunden lang in sterile 0,9% Kochsalzlösung oder PBS bei 37 Grad Celsius.

Ziehen Sie es vor, nach der Implementierung über Nacht zu verlängern. Befestigen Sie die Mäuse wieder am stereotaktischen Gerät. Öffnen Sie den zuvor genähten chirurgischen Schnitt und erweitern Sie den Schnitt bis zu den Schulterblättern.

Trennen Sie die Haut vom subkutanen Bindegewebe am Schulterblatt, indem Sie eine hämostatische Zange oder Pinzette verwenden, um einen Hohlraum zu öffnen, und legen Sie die osmotische Pumpe in den Hohlraum. Wischen Sie mit einem Wattestäbchen vorsichtig das Stiftloch auf der Oberfläche des Schädels ab und legen Sie es frei, das bei der Erstellung des Demyelinisierungsmodells entstanden ist. Führen Sie die Gehirninfusionskanüle senkrecht durch das Loch ein und befestigen Sie sie mit Gewebekleber am Schädel.

Nehmen Sie die abnehmbare Lasche über der Gehirninfusionskanüle mit einer Schere ab. Nähen Sie den Schnitt oder befestigen Sie ihn mit Gewebekleber. Legen Sie das Tier nach der Operation allein in einen Käfig.

Nach der Durchführung der Implementierung zeigte die DAPI-Färbung, dass das Loch im Hirngewebe knapp über der weißen Substanz liegt, was auf eine erfolgreiche Implementierung der Gehirninfusionskanüle der osmotischen Pumpe hinweist. Das In-situ-Hybridisierungsexperiment wurde mit einer reifen Oligodendrozytenmarker-MAG-Sonde durchgeführt, die verwendet wurde, um neu differenzierte Oligodendrozyten zu markieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit UM206 mehr MAG-positive Zellen in der demyelinisierten Region ergab als die Kontrollgruppe.

Die Transmissionselektronenmikroskopie der demyelinisierten Region zeigte, dass die Anzahl der myelinisierten Axone in der UM206-Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht war, was darauf hindeutet, dass UM206 ein höheres Maß an Remyelinisierung induzierte. Achten Sie bei der Vorbereitung der osmotischen Pumpe darauf, keine Blase in das System einzuführen.