Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen
21. Januar 2022
Die stereotaktische Chirurgie zur Ausrichtung auf Gehirnstellen bei Mäusen beinhaltet häufig den Zugang durch die Schädelknochen und wird von Schädel-Landmarken geleitet. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz, um den kaudalen Hirnstamm und das obere zervikale Rückenmark über die Cisterna magna anzusprechen, der auf der direkten Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken beruht.
Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Richtlinien für einen reproduzierbaren Zugangsweg zu Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und im oberen Halsstrang. Diese Technik erhöht die Präzision bei der Abgabe kleiner Injektionsvolumina an begrenzte Bereiche von Interesse im kaudalen Hirnstamm und im oberen Gebärmutterhalsstrang. Diese Technik wurde und kann auf andere Tiermodelle angewendet werden.
Dr. Veronique VanderHorst, außerordentliche Professorin für Neurologie und leitende Prüfärztin des VanderHorst-Labors, wird dieses Verfahren demonstrieren. Stellen Sie sicher, dass der Sauerstofffluss zum Nasenkegel geleitet wird. Bewegen Sie die Maus zum stereotaktischen Rahmen und legen Sie die Nase in einen flexiblen Nasenkonus.
Platzieren Sie die Maus nur mit Ohrstangen im stereotaktischen Rahmen. Legen Sie Gleitmittel auf die Augen. Anteroflex den Kopf der Maus in einen Winkel von 90 Grad, indem Sie die Nase manuell führen.
Um diese Position zu sichern, platzieren Sie eine Kunststoffbarriere zwischen den Ohrstangensäulen des Mausadapters parallel zu den Säulen, wobei der flache Teil des Schädels als Referenz dient. Legen Sie das Heizkissen unter die Maus und stellen Sie sicher, dass der Hals und der Rest des Körpers parallel zum Tisch positioniert sind, indem Sie den Körper mit einer kleinen Box anheben. Legen Sie ein Tuch unter den Körper.
Injizieren Sie eine Einzeldosis von vier Milligramm pro Kilogramm Meloxicam langsam subkutan bei einem Volumen von zwei Mikrolitern pro Gramm Körpergewicht. Reinigen Sie die chirurgische Inzisionsstelle zuerst mit einem 70% Alkohol-Prep-Pad, dann mit einem Betain-Prep-Pad und dann wieder mit einem Alkohol-Prep-Pad und lassen Sie es trocknen. Desinfizieren Sie die Hände und ziehen Sie sterile Handschuhe an, dann legen Sie ein Tuch an die Operationsstelle.
Stellen Sie sicher, dass die Maus angemessen betäubt wird, indem Sie die Zehen kneifen oder den Hornhautreflex überprüfen. Reduzieren Sie Isofluran, um die Werte bei 2,0 zu halten. Machen Sie einen ein bis 1,2 Zentimeter großen Schnitt mit einer chirurgischen 10-Klinge vom Rand des Hinterhauptbeins bis zu den Schultern in einer sanften Bewegung.
Machen Sie vorsichtig einen Schnitt in der Mittellinie Raphe des Trapezmuskels und legen Sie die paarigen Longus capitis-Muskeln frei. Platzieren Sie beide Retraktorhaken zwischen den gepaarten Longus capitis-Muskeln, von denen einer nach links und der andere nach rechts ausgerichtet ist. Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die linke und rechte Säuche des gepaarten Musculus longus capitis zu trennen, beginnend mit dem Hinterkopf, wo die Mittellinie gut sichtbar ist.
Führen Sie die stumpfe Pinzette über den Knochen des Hinterkopfes in der Mittellinie bis zu der Stelle, an der sie auf die zisternale Dura mater trifft, und fahren Sie dann weiter über die Dura mater zum Atlas. Positionieren Sie die Retraktoren neu und passen Sie die Spannung an, indem Sie die Hämostaten neu positionieren. Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die Muskeln weiter in der Mittellinie zu trennen, um eine gute Sicht auf den Hirnstamm und das Kleinhirn zu erhalten.
Wiederholen Sie den obigen Vorgang nach Bedarf, bis das Kleinhirn und der Hirnstamm unterhalb der Dura erscheinen. Reinigen Sie mit stumpfen Laminektomiezangen die Dura der kleinen Bindegewebsstränge, indem Sie die Pinzette von der Mittellinie in eine laterale Richtung bewegen, bis eine klare Sicht auf den Hirnstamm besteht, wodurch mehr seitlicher Raum entsteht. Betrachten Sie die dorsale Oberfläche des Hirnstamms mit detaillierten Orientierungspunkten durch die offene Dura.
Verwenden Sie die abgewinkelte Pinzette, um die Dura zu greifen, die sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt, und verwenden Sie dann die Federschere, um eine kleine Öffnung von etwa 0,5 bis 1,5 Millimetern in der Dura zu machen. Sobald die Dura geöffnet ist, drainieren Sie überschüssige Zerebrospinalflüssigkeit mit einem sterilen Q-Tip. Der Obex, der Punkt, an dem sich der zentrale Kanal in den vierten Ventrikel öffnet, ist der standardmäßige anterior-posteriore und mediolaterale Nullpunkt.
Positionieren Sie die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm zum Ziel. Senken Sie den Arm des Rückens auf die dorsale Oberfläche, die sich aus dem dorsoventralen Nullpunkt bildet. Dann senken Sie die Pipette auf den Hirnstamm und injizieren Sie die Lösung.
Lassen Sie die Nadel nach der Injektion für ein bis fünf Minuten an Ort und Stelle, um eine Nadelspur zu vermeiden, wenn Sie Volumina zwischen drei und 50 Nanolitern verwenden. Heben Sie dann die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm an und wiederholen Sie dies für mehrere Ziele. Entfernen Sie die Haken vorsichtig aus dem Operationsfeld.
Die gepaarten Musculi longus capitis fallen in eine neutrale Position zurück, die die Cisterna magna vollständig bedeckt. Schließen Sie den Trapezmuskel und die Dura mater in der Mittellinie nicht, da sie zu zerbrechlich sind, um Nähte zu halten. Schließen Sie die Haut mit 3 Nylon- oder Polypropylennähten.
Der Cisterna-Magna-Ansatz ermöglicht es, auf die Strukturen des kaudalen Hirnstamms und der oberen Halsschnur abzuzielen, die sonst über stereotaktische Standardansätze schwer zu erreichen sind oder zu inkonsistentem Targeting neigen. Bei Mäusen wurden Strukturen wie der Nucleus hypoglossus, die ventrale Atmungsgruppe und die angrenzende retikuläre Bildung im kaudalen Hirnstamm routinemäßig mit dem Cisterna magna-Ansatz anvisiert, wie hier für den Hypoglossuskern und die ventromediale Medulla dargestellt. Um die Genauigkeit des Cisterna magna-Ansatzes gegenüber dem Standardansatz zu bestimmen, wurde der Abstand zwischen den beabsichtigten und tatsächlichen Zielstellen in der anteroposterioren, mediolateralen und dorsoventralen Ebene für ventrale und dorsale Regionen gemessen.
Die Ergebnisse zeigen signifikant geringere Fehler in der anteroposterioren, mediolateralen und dorsoventralen Ebene im Vergleich zum Standardansatz, was die verbesserte Genauigkeit des Cisterna magna-Ansatzes für diese Ziele unterstreicht. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig sicherzustellen, dass die Anteroflexion des Kopfes und die Erhöhung des Körpers wie beschrieben durchgeführt werden. Als nächstes ist es wichtig, wichtige Orientierungspunkte zu erkennen, bevor Sie den Muskel oder die Dura mater manipulieren.
Wenn diese Landmarken nicht erkannt werden oder wenn sie verloren gehen, wird es schwierig sein, orientiert zu bleiben und das Verfahren wie beabsichtigt auszuführen. Diese Technik trug dazu bei, konzeptionelle Fragen im Zusammenhang mit der funktionellen anatomischen Organisation innerhalb des kaudalen Hirnstamms und der oberen Halsschnur zu beantworten.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein stereotaktisches chirurgisches Verfahren zur Zugänglichmachung des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks bei Mäusen über den Zisterna-magna-Raum beschrieben. Diese alternative Methode verbessert die Präzision bei der gezielten Ansprache begrenzter Hirnregionen und ermöglicht Injektionen geringer Volumina direkt unter visueller Kontrolle anatomischer Landmarken.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stereotaktische Chirurgie
- Neurowissenschaften
- Forschung an Tiermodellen
Hintergrund
- Standardmethoden beinhalten den Zugang zum Gehirn über Schädelknochen und anatomische Landmarken.
- Der Ansatz über die Zisterna magna bietet eine direktere Route für die Zielregion.
- Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Tiermodellen angewendet werden.
- Sie ermöglicht das gezielte Ansteuern von Gebieten wie dem Nucleus hypoglossus und der ventralen Atemgruppe.
Zweck der Studie
- Eine Technik zur genaueren Zielsteuerung von Hirnstammstrukturen demonstrieren.
- Die Präzision von Injektionen in begrenzte Regionen erhöhen.
- Die Wirksamkeit dieser Methode im Vergleich zu Standardansätzen bewerten.
Verwendete Methoden
- Die Methode beruht auf einem visuell geführten stereotaktischen Ansatz mit präziser anatomischer Orientierung.
- Als biologisches Modell werden Mäuse verwendet, die sich besonders gut für neuroanatomische Untersuchungen eignen.
- Zu den Schritten gehören das Anlegen von Inzisionen, das Zurückziehen der Muskulatur und die Verwendung von Retraktoren zur Exposition.
- Kritische Schritte beinhalten die Erkennung wichtiger Orientierungspunkte und die korrekte Positionierung für die Injektion.
- Die Injektionen erfolgen mit variierenden Volumina zwischen drei und 50 Nanolitern in der Nähe spezifischer Zielbereiche.
Hauptergebnisse
- Die Zisterna-magna-Methode wies im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren signifikant geringere Zielgenauigkeitsfehler bei Hirnstrukturen auf.
- Eine präzise Zielgenauigkeit des Nervus-hypoglossus-Kerns und der ventralen Medulla wurde erreicht.
- Die Technik zeigte eine verbesserte Erfolgsrate beim Erreichen zuvor schwer zugänglicher Areale bei minimaler Invasivität.
- Anatomische Landmarken sind entscheidend, um die Orientierung beizubehalten und eine effektive Durchführung des Verfahrens sicherzustellen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie veranschaulicht eine neuartige Technik, die den Zugang und die gezielte Bearbeitung des kaudalen Hirnstamms verbessert.
- Die Präzision dieser Methode ebnet den Weg für differenziertere Neuromodulationsstudien.
- Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der anatomischen Organisation innerhalb des Hirnstamms bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die gezielte Behandlung von Strukturen im kaudalen Hirnstamm und im oberen zervikalen Rückenmark bleibt in der präklinischen Neurowissenschaft aufgrund anatomischer Unzugänglichkeit eine Herausforderung, was mechanistische Untersuchungen lebenswichtiger Funktionen wie Atmung und motorischer Kontrolle einschränkt. Der Zugang über die Zisterna magna bietet eine reproduzierbare, visuell gesteuerte Route, die die Injektionsgenauigkeit in begrenzten Regionen verbessert und eine zuverlässige Ansprechbarkeit des Zielgewebes in der frühen Entdeckungsphase unterstützt. Diese methodische Weiterentwicklung verringert die biologische Variabilität und erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Evaluierung neuromodulatorischer Zielstrukturen in krankheitsrelevanten Systemen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die präzise Überprüfung therapeutischer Hypothesen in kaudalen Hirnstammkernen, die an sensorimotorischen und autonomen Funktionen beteiligt sind.
- Operativer Wert: Verringert die Zielgenauigkeitsfehler im Vergleich zu methodenbasierten Verfahren anhand von Schädelmarkern und erhöht so die Reproduzierbarkeit über experimentelle Kohorten hinweg.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem das Vertrauen in die Wirksamkeit und Spezifität der Zielmodulation gesteigert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Herstellung validierter zentralnervöser Mikroinjektionsmodelle für die Wirkstoffprüfung in Hirnstamm-Schaltkreisen.
- Operativer Wert: Bietet standardisierten chirurgischen Zugang mit visueller Orientierung an anatomischen Landmarken und verbessert so die Konsistenz des Assays.
- Strategischer Wert: Ermöglicht zuverlässige Dosis-Wirkungs-Bewertungen in schwer zugänglichen Regionen und unterstützt damit die Identifizierung von Leitverbindungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem eine gezielte Abgabe an Hirnstammstrukturen ermöglicht wird, die bei Atemwegs- und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind.
- Operativer Wert: Stellt durch reproduzierbare Zielgenauigkeit die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher.
- Strategischer Wert: Verringert das Risiko bei der translationellen Weiterentwicklung, indem Nebenwirkungen und anatomische Variabilität minimiert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen eine hypothesengetriebene Zielsetzung von Hirnstammkreisläufen der Identifizierung von Leitverbindungen und präklinischen Wirksamkeitstests vorausgeht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem eine genaue Modulation der kaudalen Hirnstammkerne ermöglicht wird, um die Funktion von Signalwegen zu klären.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft von Assays durch stereotaktische Präzision und konsistente Applikation von Nanoliter-Volumina auf definierte Zielstrukturen.
- Analytik: Erzeugt quantitative räumliche Targeting-Daten (Metriken für anteroposteriore, mediolaterale und dorsoventrale Abweichungen), um die Genauigkeit der Applikation unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem eine zuverlässige Zielung von Hirnstammregionen ermöglicht wird, die in humanen Krankheitsmodellen relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare chirurgische Plattform, die in mehreren Projekten der Neuropharmakologie und Neuromodulation eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem anatomische Unsicherheiten bei Eingriffen am Hirnstamm verringert werden.
- Operationaler Wert: Steigert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Mikroinjektionsverfahren im zentralen Nervensystem über verschiedene Labore hinweg.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem fehlgeschlagene Experimente aufgrund falscher Applikation reduziert werden, und unterstützt eine bessere Ressourcenallokation.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von therapeutischen Ansätzen, die den Hirnstamm gezielt ansprechen, basierend auf zuverlässigeren präklinischen Daten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der stereotaktischen Chirurgie an Nagetieren und der Identifizierung neuroanatomischer Landmarken.
- Benötigt mikrochirurgische Instrumente wie stumpfe Pinzetten, Feder-Scheren und stereotaktische Manipulatoren.
- Setzt aseptische Techniken und postoperative Versorgungsprotokolle voraus, um das Wohlergehen der Tiere und die Integrität der Daten sicherzustellen.
- Kann je nach Modell Anpassungen bei der Fixierung des Kopfes und der Körperlage aufgrund anatomischer Variationen erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die Notwendigkeit einer präzisen Visualisierung der Dura und des Abflusses von Zerebrospinalflüssigkeit, um ein klares Operationsfeld aufrechtzuerhalten.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Positioning of the Mouse in the Stereotaxic Frame
2:04
Surgery to Access the Cisterna Magna
3:34
Opening of the Cisternal Membrane and Identification of Landmarks and Zero Point
4:11
Injection of the Target
4:45
Closure of the Surgical Field
5:10
Results: Stereotaxic Surgical Approach in Mice
6:14
Conclusion
