Name: Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Lernen Sie eine stereotaktische Mikroinjektionstechnik für den kaudalen Hirnstamm und das obere zervikale Rückenmark bei Mäusen über die Cisterna magna. Diese Methode ermöglicht präzise Zielinjektionen unter visueller Kontrolle.

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Der Autor erklärt, dass das Protokoll den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee am Beth Israel Deaconess Medical Center folgt.
1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten und stereotaktischem Rahmen
HINWEIS: Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Sterilität wird mit der sterilen Spitzentechnik aufrechterhalten.
<ol><li>Installieren Sie den stereotaktischen Arm mit einer Mikropipette oder Spritze, die mit einem Injektionsmittel Ihrer Wahl (Adeno-assoziiertes Virus (AAV) oder herkömmlicher Tracer) auf dem stereotaktischen Rahmen gefüllt ist, und bereiten Sie den Mausadapter vor (Abbildung 2A).</li>
	<li>Bereiten Sie autoklavierte chirurgische Instrumente (Materialtabelle) vor und legen Sie sie auf eine sterile Oberfläche.</li>
</ol>2. Anästhesieinduktion und Mausvorbereitung
<ol><li>Schalten Sie O2 bei 0,5 l/min ein und stellen Sie den Isofluran-Verdampfer auf 4,0 ein, wobei Sie sicherstellen, dass derO2-Durchfluss zur Induktionsbox erfolgt. ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass die Isofluran-Induktionsbox in einer Haube platziert ist und dass das Isofluran von der Operationsstelle weggefegt wird.</li>
	<li>Legen Sie die Maus (10 Wochen altes Männchen C57BL/6J) in die Induktionskammer.</li>
	<li>Sobald sich die Atmung verlangsamt hat, öffnen Sie die Induktionskammer und heben Sie die Maus leicht an. Verwenden Sie Haarschneidemaschinen, um Haare von Kopf bis Schultern zu entfernen.</li>
</ol>3. Positionierung der Maus im stereotaktischen Rahmen
<ol><li>Bewegen Sie die Maus zum stereotaktischen Rahmen und legen Sie die Nase in einen flexiblen Nasenkonus. Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass derO2-Fluss jetzt auf den Nasenkegel gerichtet ist.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus nur mit Ohrstangen im stereotaktischen Rahmen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ohrstangen gleichmäßig sind und der Kopf eben ist.</li>
	<li>Anteroflex den Kopf der Maus in einen 90°-Winkel, indem Sie die Nase manuell führen. Um diese Position zu sichern, platzieren Sie eine Kunststoffbarriere zwischen den Ohrstangensäulen des Mausadapters parallel zu den Säulen. Der flache Teil des Schädels dient als Referenz, ähnlich dem flachen Schädelansatz in der konventionellen stereotaktischen Chirurgie. HINWEIS: Beugen Sie den Kopf nicht zu stark (d.h. über einen Winkel von 90° zwischen der Ebene des vorderen Schädelknochens und der Ebene der Tischoberfläche), da dies den Luftstrom durch die oberen Atemwege behindert. Wenn der Luftstrom behindert wird, positionieren Sie die Maus neu, wobei Sie sicherstellen, dass der Körper unter dem Rumpf gestützt wird und eine Plastikkarte auf 90° zwischen der Ebene des vorderen Schädelknochens und der Ebene der Tischoberfläche eingestellt ist, wie in Abbildung 2A,C dargestellt.</li>
	<li>Legen Sie das Heizkissen unter die Maus und stellen Sie dann sicher, dass der Hals und der Rest des Körpers auf der gleichen Höhe (d. h. bei ca. 180 ° oder parallel zum Tisch) positioniert sind. Die Werkzeugkiste, die die Federschere hält, kann verwendet werden, um den Körper in diese Position zu heben. HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, da sich der kaudale Hirnstamm und die obere Halsschnur je nach Position bewegen, im Gegensatz zu mehr rostralen Teilen des ZNS, die vom Schädel an Ort und Stelle gehalten werden.</li>
	<li>Injizieren Sie eine Einzeldosis von 4 mg/kg Meloxicam Slow-Release (SR) subkutan (s.c.) bei einem Volumen von 2 μL/g Körpergewicht und geben Sie Gleitmittel auf die Augen.</li>
	<li>Reinigen Sie die chirurgische Inzisionsstelle zuerst mit einem 70% igen Alkohol-Prep-Pad, dann mit einem Betadin-Prep-Pad und dann wieder mit einem Alkohol-Prep-Pad und lassen Sie es trocknen.</li>
	<li>Legen Sie ein Tuch unter den Körper.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Hände und ziehen Sie sterile Handschuhe an.</li>
	<li>Legen Sie einen Vorhang an die Operationsstelle.</li>
</ol>4. Operation zum Zugang zur Zisterne Magna
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Maus angemessen betäubt ist, indem Sie die Zehen kneifen oder den Hornhautreflex überprüfen.</li>
	<li>Reduzierung des Isoflurans auf ein Erhaltungsniveau (2,0).</li>
	<li>Machen Sie einen 1-1,2 cm großen Schnitt mit chirurgischer Klinge # 10 vom Rand des Hinterhauptbeins in Richtung der Schultern in einer sanften Bewegung.</li>
	<li>Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie Raphe des Trapezmuskels. Dies entblößt die gepaarten Longus capitis-Muskeln. HINWEIS: Bei Mäusen ist der Musculus trapezius ein sehr dünner, fast transparenter Muskel. Achten Sie darauf, in der Mittellinie zu bleiben und schneiden Sie nicht in die darunter liegenden Muskeln, da dies zu unnötigen Blutungen führt.</li>
	<li>Platzieren Sie beide Retraktorhaken zwischen den gepaarten Longus capitis-Muskeln, von denen einer nach links und der andere nach rechts ausgerichtet ist. Das Gewicht der Hämostate sorgt für Spannung an den Retraktorhaken, die durch erneutes Einstellen der Position der Hämostate modifiziert werden kann.</li>
	<li>Positionieren Sie das Operationsmikroskop an Ort und Stelle, um das Operationsfeld besser sichtbar zu machen.</li>
	<li>Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die linke und rechte Säuche des gepaarten Musculus longus capitis zu trennen, beginnend mit dem Hinterkopf, wo die Mittellinie gut sichtbar ist. Führen Sie die stumpfe Pinzette über den Knochen des Hinterkopfes in der Mittellinie bis zu der Stelle, an der sie auf die zisternale Dura mater trifft, und fahren Sie dann weiter über die Dura mater zum Atlas. HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die paarigen Longus capitis-Muskeln zu durchschneiden, da nichts sie in der Mittellinie zusammenhält. Dies führt zu unnötigen Blutungen.</li>
	<li>Positionieren Sie die Retraktoren neu und passen Sie die Spannung an, indem Sie die Hämostate neu positionieren, wodurch sich der Blick auf die Zisterne Magna öffnet.</li>
	<li>Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die Muskeln weiter in der Mittellinie zu trennen, um ein gutes Sichtfenster des Hirnstamms und des Kleinhirns zu erhalten.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.7-4.9 nach Bedarf, bis das Kleinhirn und der Hirnstamm unter der Dura sichtbar sind.</li>
	<li>Reinigen Sie mit stumpfen Laminektomiezangen die Dura der kleinen Bindegewebsstränge, indem Sie die Pinzette von der Mittellinie in eine laterale Richtung bewegen, bis eine klare Sicht auf den Hirnstamm besteht, und um mehr seitlichen Raum zu schaffen, wie es für das Ziel benötigt wird.</li>
</ol>5. Öffnen der Zisternalmembran
<ol><li>Verwenden Sie die abgewinkelte Dumont-Pinzette (#4/45), um die Dura zu greifen, die sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt. Greifen Sie die Dura in der Nähe des Hinterhauptbeins und verwenden Sie die Federschere, um eine kleine Öffnung (~ 0,5 bis 1, 5 mm) in der Dura zu machen. HINWEIS: An diesem rostralen Standort ist der Raum zwischen dem Hirnstamm und der darüber liegenden Dura am breitesten und bietet ausreichend Platz für eine sichere Manipulation der Dura.</li>
	<li>Verwenden Sie die Federschere, um die Dura anzuheben und die Dura weiter zu öffnen. Die Größe des Fensters hängt vom Ziel ab. HINWEIS: Ein größeres Fenster wird benötigt, wenn mehrere Längsinjektionen oder bilaterale Injektionen durchgeführt werden. Ein kleines Fenster reicht aus, wenn einzelne einseitige oder mittlere Injektionen durchgeführt werden.</li>
	<li>Sobald die Dura geöffnet ist, drainieren Sie überschüssige Zerebrospinalflüssigkeit mit einer sterilen Cue-Spitze.</li>
</ol>6. Identifizierung von Landmarken und Nullpunkt
<ol><li>Betrachten Sie die dorsale Oberfläche des Hirnstamms mit detaillierten Orientierungspunkten durch die offene Dura. Der Obex, der Punkt, an dem sich der zentrale Kanal in den IV-Ventrikel öffnet, ist der standardmäßige anterior-posteriore und mediolaterale Nullpunkt.</li>
</ol>7. Zielkoordinaten
HINWEIS: Für verschiedene Ziele haben wir eine Liste von Standardkoordinaten mit vorderen posterioren (AP) und mediolateralen (ML) Koordinaten relativ zu Nullpunkt-Bregma und Cisterna magna-Koordinaten mit AP- und ML-Koordinaten relativ zu Nullpunkt-Obex aufgenommen, um den Übergang zwischen den Methoden zu erleichtern (Tabelle 1). Dorsoventrale (DV) Koordinaten sind relativ zur Oberfläche des Gehirns oder Kleinhirns (Standardansatz) oder zur Oberfläche des Hirnstamms oder der oberen Halsschnur (Cisterna magna-Ansatz) am Punkt des AP- und ML-Eintritts. Die Planung sollte vor der Operation erfolgen.
<ol><li>Verwenden Sie die drei Koordinatensätze, um das Ziel zu bestimmen: AP, ML und DV. Aufgrund der Kopfposition variiert die relative Ausrichtung der Hirnstammstrukturen je nach Standort.<ol>
<li>Für den Zielabstand >0,4 mm vom kaudalen zum Obex (Abbildung 1B, grün) gehen Sie wie folgt vor.<ol>
<li>AP: Verwenden Sie einen beliebigen stereotaktischen Standardreferenzatlas (z. B. Paxinos und Franklin Atlas2) oder Gewebereihen, die in der Querebene geschnitten wurden, um den AP-Abstand zwischen Obex und dem Ziel zu schätzen.</li>
			<li>ML: Verwenden Sie einen beliebigen stereotaktischen Referenzatlas oder eine Gewebereihe, die in der Querebene geschnitten ist, um den ML-Abstand zwischen Obex und dem Ziel zu schätzen.</li>
			<li>DV: Schätzen Sie Koordinaten relativ zur Oberfläche des Gehirns oder Kleinhirns am AP- und ML-Zielpunkt. Verwenden Sie einen beliebigen stereotaktischen Standardreferenzatlas oder eine Gewebereihe, die in der Querebene geschnitten ist, um den Abstand zwischen der Hirnstammoberfläche an den gewünschten AP- und ML-Koordinaten und dem Ziel zu schätzen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für den Zielabstand <0,4 mm vom kaudalen zum Obex (Abbildung 1B, orange) gehen Sie wie folgt vor.<ol>
<li>AP: Passen Sie die Koordinaten an, um die Anteroflexion des Hirnstamms zu berücksichtigen. Für ventrale und rostrale Koordinaten ist der AP-Hirnstamm-Eintrittspunkt relativ zur Ziel-AP-Koordinate in der Standardebene kaudaler.</li>
			<li>ML: Leiten Sie Zielkoordinaten aus einem standardmäßigen stereotaktischen Referenzatlas oder einer Gewebereihe ab, die in der Querebene geschnitten wurde. Die Koordinaten sind relativ zur visualisierten Mittellinie auf der Ziel-AP-Ebene.</li>
			<li>DV: Schätzen Sie Koordinaten relativ zur Oberfläche des Hirnstamms am AP- und ML-Zielpunkt. Passen Sie DV an, um die Anteroflexion des Hirnstamms zu berücksichtigen. Für ventrale und rostrale Koordinaten sind die DV-Koordinaten größer als der Abstand von der dorsalen Oberfläche des Hirnstamms in der Standardebene.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Injektion des Ziels
<ol><li>Senken Sie die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm auf das Ziel ab und injizieren Sie die Lösung wie bei stereotaktischen Standardansätzen. Nach der Injektion 1-5 Minuten an Ort und Stelle lassen, um eine Nadelspur bei der Verwendung von Volumina zwischen 3-50 nL zu vermeiden. Heben Sie dann die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm an.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 8.1. für mehrere Ziele.</li>
</ol>9. Schließung des Operationsfeldes
<ol><li>Entfernen Sie die Haken vorsichtig aus dem Operationsfeld. Die gepaarten Musculus longus capitis fallen in eine neutrale Position zurück und bedecken die Cisterna magna vollständig. Schließen Sie den Trapezmuskel und die Dura mater in der Mittellinie nicht, da sie zu zerbrechlich sind, um Nähte zu halten.</li>
	<li>Schließen Sie die Haut mit drei Nylon- oder Polypropylennähten (5-0 oder 6-0).</li>
</ol>10. Nachsorge
<ol><li>Schalten Sie Isofluran aus und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Frame. Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen und beobachten Sie, bis sie wach ist und sich bewegt.</li>
	<li>Überwachen Sie den Gesundheitszustand, das Gewicht und die Nähte an den postoperativen Tagen 1-3. Entfernen Sie die Nähte am 10. Tag, wenn sie nicht bereits entfernt wurden.</li>
</ol>

<ol><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+Stereotaxic+Surgery%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Rodent Stereotaxic Surgery.</a> JoVE Science Education Database. , Neuroscience (2021).</li>
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<li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li>
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<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004(2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die stereotaktische Standardchirurgie stützt sich häufig auf Schädel-Landmarken, um die Koordinaten der Zielstellen im ZNS1 zu berechnen. Die Zielstandorte werden dann über Gratlöcher erreicht, die durch den Schädelgebohrt werden 1. Diese Methode ist nicht ideal für den kaudalen Hirnstamm, da sich die Zielstellen in der anteroposterioren und dorsoventralen Ebene2 entfernt von den Schädellandmarken befinden und da die Anatomie des Schädels un...

Die stereotaktische Standardchirurgie zur gezielten Gehirnstelle beiMäusen 1 beinhaltet häufig die Fixierung des Schädels mit einem Satz Ohrstangen und einem Mundbalken. Die Koordinaten werden dann auf der Grundlage der Referenzatlanten2,3 und der Schädellandmarken geschätzt, nämlich Bregma (der Punkt, an dem die Nähte der Frontal- und Parietalknochen zusammenkommen) oder Lambda (der Punkt, an dem die Nähte der Parietal- und Hinterhauptsknochen zusammenkommen; Abbildung 1A,B). Durch ein Gratloch in den Schädel oberhalb des geschätzten Ziels kann dann die Zielregion erreicht werden, entweder für die Lieferung von Mikroinjektionen oder Instrumenten mit Kanülen oder optischen Fasern. Aufgrund von Variationen in der Anatomie dieser Nähte und Fehlern in der Lokalisation von Bregma oder Lambda 4,5 variiert die Position der Nullpunkte in Bezug auf das Gehirn von Tier zu Tier. Während kleine Fehler beim Targeting, die sich aus dieser Variabilität ergeben, für große oder nahe gelegene Ziele kein Problem darstellen, sind ihre Auswirkungen für kleinere Interessengebiete, die von den Nullpunkten in den anteroposterioren oder dorsoventralen Ebenen entfernt sind, und / oder bei der Untersuchung von Tieren unterschiedlicher Größe aufgrund von Alter, Belastung und / oder Geschlecht größer. Es gibt mehrere zusätzliche Herausforderungen, die für die Medulla oblongata und die obere Halsschnur einzigartig sind. Erstens sind kleine Änderungen der anteroposterioren Koordinaten aufgrund der Position und Form des Kleinhirns mit signifikanten Änderungen der dorsoventralen Koordinaten relativ zur Dura verbunden (Abbildung 1Bi)2,6,7. Zweitens ist die obere Halsschnur nicht im Schädelenthalten 2. Drittens macht die schräge Position des Hinterhauptbeins und der darüber liegenden Schicht der Nackenmuskulatur2 den stereotaktischen Standardansatz für Strukturen, die sich in der Nähe des Übergangs zwischen Hirnstamm und Rückenmark befinden, noch schwieriger (Abbildung 1Bi). Schließlich sind viele Ziele, die im kaudalen Hirnstamm und in der Halsschnur von Interesse sind, klein2, was präzise und reproduzierbare Injektionen erfordert 8,9.
Ein alternativer Ansatz durch die Cisterna magna umgeht diese Probleme. Die Cisterna magna ist ein großer Raum, der sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt (Abbildung 1A, d.h. der zweite Wirbelknochen)10. Es ist mit Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt und mit Dura mater10 bedeckt. Dieser Raum zwischen dem Hinterhauptbein und dem Atlas öffnet sich, wenn der Kopf anteroflexiert wird. Es kann erreicht werden, indem man zwischen den darüber liegenden paarigen Bäuchen des Musculus longus capitis navigiert und die dorsale Oberfläche des kaudalen Hirnstamms freilegt. Interessante Regionen können dann basierend auf den Landmarken dieser Regionen selbst ins Visier genommen werden, wenn sie sich in der Nähe der dorsalen Oberfläche befinden. oder durch die Verwendung des Obex, des Punktes, an dem sich der zentrale Kanal in den IV-Ventrikel öffnet, als Nullpunkt für Koordinaten, um tiefere Strukturen zu erreichen. Dieser Ansatz wurde erfolgreich bei einer Vielzahl von Arten eingesetzt, darunter die Ratte11, Katze12, Maus8,9 und der nichtmenschliche Primat13, um auf die ventrale Atmungsgruppe, die medulläre mediale retikuläre Formation, den Kern des Einzeltraktes, die Arealpostrema oder den hypoglossalen Kern abzuzielen. Dieser Ansatz wird jedoch nicht häufig verwendet, da er Kenntnisse der Anatomie, ein spezialisiertes Toolkit und fortgeschrittenere chirurgische Fähigkeiten im Vergleich zum stereotaktischen Standardansatz erfordert.
Hier beschreiben wir einen schrittweisen chirurgischen Ansatz, um den Hirnstamm und das obere Halsband über die Zisterne magna zu erreichen, Orientierungspunkte zu visualisieren, den Nullpunkt zu setzen (Abbildung 2) und die Zielkoordinaten für die stereotaktische Abgabe von Mikroinjektionen in die diskreten Hirnstamm- und Rückenmarksregionen von Interesse zu schätzen und zu optimieren (Abbildung 3). Anschließend besprechen wir die Vor- und Nachteile dieses Ansatzes.

<table><tbody><tr><td>Alkoholkissen</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU: MDS090735Z</td><td>Hautpräparat zur Vorbeugung von Wundinfektionen</td></tr><tr><td>Abgewinkelte Pinzette, Dumont #5/45</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>nur zum Greifen von Dura</td></tr><tr><td>Betadine Pad</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU:PVP-PAD</td><td>Hautpräparat zur Vorbeugung von Wundinfektionen</td></tr><tr><td>Choleratoxin Untereinheit-b, Alexa Fluor 488/594 Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>488: C34775, 594: C22842</td><td>Fluoreszierender Tracer</td></tr><tr><td>Clippers</td><td>Wahl</td><td>Modell MC3, 28915-10</td><td>zum Rasieren von Fell an der Operationsstelle</td></tr><tr><td>Elektrodenhalter mit Eckklemme</td><td>Kopf</td><td>1770</td><td>zum Halten von Glaspipetten</td></tr><tr><td>Durchflussmesser</td><td>Gilmont Instrumente</td><td>Modell # 65 MM</td><td>zur Regulierung des Flusses von Isofluran und Sauerstoff zur Maus in der Operationsebene</td></tr><tr><td>Fluoreszierende Mikrosphären, Polystyrol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F13080</td><td>Fluoreszierender Tracer</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Stoelting</td><td>53800M</td><td>Thermoregulation</td></tr><tr><td>Induktionskammer mit Anschlusskit</td><td>Midmark Inc</td><td>93805107 92800131</td><td>Kammer für Erstanästhesie</td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>Exelint International</td><td>26028</td><td>zur Verabreichung von Kochsalzlösung und Analgetikum</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU:RXISO-250</td><td>Inhalationsanästhetikum</td></tr><tr><td>Isoflurane Matrix VIP 3000 Vaporizer</td><td>Midmark Inc</td><td>91305430</td><td>Gerät zur Abgabe von Inhalationsanästhetika</td></tr><tr><td>Laminektomiezange, Dumont #</td>2 <td>FST</td><td>11223-20</td><td>nur zur Reinigung von dura</td></tr><tr><td>Medical Luft, komprimiert</td><td>Linde</td><td>UN 1002</td><td>Wird mit Stimulator & PicoPump zur Bereitstellung von Luft für die Präzisionsinjektion von Lösungen</td></tr><tr><td>Meloxicam SR</td><td>Zoo Pharm LLC</td><td>Los # MSR2-211201</td><td>Analgetikum</td></tr><tr><td>Mikrohämatokrit Borosilikatglas vorkalibriertes Kapillarrohr</td><td>Globe Scientific Inc</td><td>51628</td><td>für die Transfektion von Material auf die angegebenen Koordinaten</td></tr><tr><td>Mausadapter</td><td>Stoelting</td><td>0051625</td><td>&nbsp; Anpassung des stereotaktischen Rahmens für die Mauschirurgie</td></tr><tr><td>Nadelhalter, Student Halsted-Mosquito Hämostatika</td><td>FST</td><td>91308-12</td><td>zum Nähen</td></tr><tr><td>Sauerstoffregulator</td><td>Lebenserhaltungsprodukte</td><td>S/N 909328, Los 092109</td><td>Regulierung des Sauerstoffgehalts aus dem Sauerstofftank</td></tr><tr><td>Sauerstofftank, komprimiert</td><td>Linde</td><td>USP UN 1072</td><td>zusammen mit Isofluran-Anästhesie zur Verfügung gestellt</td></tr><tr><td>Plastikkarte</td><td>nicht anwendbar</td><td>nicht anwendbar</td><td>jede feste Plastikkarte, die so zugeschnitten ist, dass sie in den stereotaktischen Rahmen passt (z. B. Personalausweis)</td></tr><tr><td>Pneumatische PicoPump (oder ähnlich)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYS-PV820</td><td>Für die Injektion von Präzisionslösungen</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung, steril</td><td>Mountainside Medical Equipment</td><td>H04888-10</td><td>zum Ersatz von Körperflüssigkeiten, die während der Operation verloren gehen</td></tr><tr><td>Skalpellgriff, #3</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td>bis Skalpellschere</td></tr><tr><td>halten, Wagner</td><td>FST</td><td>14070-12</td><td>zum Schneiden von Polypropylen-Nahtmaterial</td></tr><tr><td>Federschere, Vannas 2,5 mm mit dazugehöriger Box</td><td>FST</td><td>15002-08</td><td>Schere nur zum Öffnen der Dura, Box zum Anheben des Körpers</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Mikromanipulator</td><td>Kopf</td><td>1760-61</td><td>am Elektrodenhalter befestigt, um die Position anhand von Koordinaten einzustellen</td></tr><tr><td>Stereotaktische U-Rahmenbaugruppe und intrazelluläre Basisplatte</td><td>Kopf</td><td>1730-B, 1711</td><td>Rahmen für die Chirurgie</td></tr><tr><td>Sterile Applikatoren mit Baumwollspitze</td><td>Puritan</td><td>25-806 10WC</td><td>zur Aufnahme von Blut aus dem Operationsfeld</td></tr><tr><td>Sterile nicht gefensterte Abdecktücher</td><td>Henry Schein</td><td>9004686</td><td>für sterile chirurgische</td></tr><tr><td>Bereiche Sterile Augensalbe</td><td>Puralube</td><td>P1490</td><td>Okular Gleitmittel</td></tr><tr><td>Stimulator & Schläuche</td><td>Gras Medizinische Instrumente</td><td>S44</td><td>zur Bereitstellung von kontrollierter Vorluft für die Präzisionsinjektion</td></tr><tr><td>von Lösungen Chirurgische Klinge #10</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU: 10SS</td><td>für Hautschnitte</td></tr><tr><td>Chirurgische Zange, extra fein Graefe</td><td>FST</td><td>11153-10</td><td>zum Halten der Haut</td></tr><tr><td>Chirurgische Handschuhe</td><td>Med-Vet International</td><td>MSG2280Z</td><td>für aszeptische Chirurgie</td></tr><tr><td>Operationsmikroskop</td><td>Leica</td><td>Modell M320/ F12</td><td>für die 5-fache-40-fache Vergrößerung der Operationsstelle</td></tr><tr><td>Naht 5-0 Polypropylen</td><td>Oasis</td><td>MV-8661</td><td>zum Verschließen der Haut</td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>3M</td><td>3M ID 70200749250</td><td>bietet sterile</td></tr><tr><td>Barriere Universalklemme und Stativpfosten</td><td>Kopf</td><td>1725</td><td>befestigt an stereotaktischem U-Rahmen und intrazellulärer Basisplatte</td></tr><tr><td>Wundhaken mit Hartman Hämostatika</td><td>FST</td><td>18200-09, 13003-10</td><td>zur Trennung der Muskeln und zur Bereitstellung eines chirurgischen Fensters</td></tr></tbody></table>

stereotaktischer chirurgischer ansatz zur mikroinjektion des kaudalen hirnstamms und des oberen zervikalen rückenmarks über die cisterna magna bei mäusen

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaktische Chirurgie, um Gehirnstellen bei Mäusen anzuvisieren, wird häufig von Schädel-Landmarken geleitet. Der Zugang erfolgt dann über Gratlöcher, die durch den Schädel gebohrt werden. Dieser Standardansatz kann für Ziele im kaudalen Hirnstamm und im oberen Gebärmutterhalsstrang aufgrund spezifischer anatomischer Herausforderungen eine Herausforderung darstellen, da diese Stellen von Schädellandmarken entfernt sind, was zu Ungenauigkeiten führt. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz über die Cisterna magna, der verwendet wurde, um diskrete Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und in der oberen Halsschnur anzusprechen. Die Cisterna magna erstreckt sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas (d.h. dem zweiten Wirbelknochen), ist mit Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt und wird von Dura mater bedeckt. Dieser Ansatz bietet einen reproduzierbaren Zugang zu ausgewählten Strukturen des zentralen Nervensystems (ZNS), die aufgrund anatomischer Barrieren sonst schwer zu erreichen sind. Darüber hinaus ermöglicht es die direkte Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken in unmittelbarer Nähe zu den Zielstellen, wodurch die Genauigkeit bei der Abgabe kleiner Injektionsvolumina an begrenzte Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und in der oberen Halsschnur erhöht wird. Schließlich bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, das Kleinhirn zu vermeiden, was für motorische und sensomotorische Studien wichtig sein kann.

Der Cisterna-Magna-Ansatz ermöglicht es, kaudale Hirnstamm- und obere Halsschnurstrukturen anzusprechen, die sonst über stereotaktische Standardansätze schwer zu erreichen sind oder zu inkonsistentem Targeting neigen. Die Operation, um die Cisterna magna zu erreichen, erfordert Schnitte der Haut, eine dünne Schicht des Trapezmuskels und die Öffnung der Dura mater und wird daher von Mäusen gut vertragen. Es ist besonders effizient und weniger invasiv, wenn es auf mehrere (längs verteilte oder bilaterale) Standort...

Die stereotaktische Chirurgie zur Ausrichtung auf Gehirnstellen bei Mäusen beinhaltet häufig den Zugang durch die Schädelknochen und wird von Schädel-Landmarken geleitet. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz, um den kaudalen Hirnstamm und das obere zervikale Rückenmark über die Cisterna magna anzusprechen, der auf der direkten Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken beruht.

Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Richtlinien für einen reproduzierbaren Zugangsweg zu Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und im oberen Halsstrang. Diese Technik erhöht die Präzision bei der Abgabe kleiner Injektionsvolumina an begrenzte Bereiche von Interesse im kaudalen Hirnstamm und im oberen Gebärmutterhalsstrang. Diese Technik wurde und kann auf andere Tiermodelle angewendet werden.Dr. Veronique VanderHorst, außerordentliche Professorin für Neurologie und leitende Prüfärztin des VanderHorst-Labors, wird dieses Verfahren demonstrieren. Stellen Sie sicher, dass der Sauerstofffluss zum Nasenkegel geleitet wird. Bewegen Sie die Maus zum stereotaktischen Rahmen und legen Sie die Nase in einen flexiblen Nasenkonus.Platzieren Sie die Maus nur mit Ohrstangen im stereotaktischen Rahmen. Legen Sie Gleitmittel auf die Augen. Anteroflex den Kopf der Maus in einen Winkel von 90 Grad, indem Sie die Nase manuell führen.Um diese Position zu sichern, platzieren Sie eine Kunststoffbarriere zwischen den Ohrstangensäulen des Mausadapters parallel zu den Säulen, wobei der flache Teil des Schädels als Referenz dient. Legen Sie das Heizkissen unter die Maus und stellen Sie sicher, dass der Hals und der Rest des Körpers parallel zum Tisch positioniert sind, indem Sie den Körper mit einer kleinen Box anheben. Legen Sie ein Tuch unter den Körper.Injizieren Sie eine Einzeldosis von vier Milligramm pro Kilogramm Meloxicam langsam subkutan bei einem Volumen von zwei Mikrolitern pro Gramm Körpergewicht. Reinigen Sie die chirurgische Inzisionsstelle zuerst mit einem 70% Alkohol-Prep-Pad, dann mit einem Betain-Prep-Pad und dann wieder mit einem Alkohol-Prep-Pad und lassen Sie es trocknen. Desinfizieren Sie die Hände und ziehen Sie sterile Handschuhe an, dann legen Sie ein Tuch an die Operationsstelle.Stellen Sie sicher, dass die Maus angemessen betäubt wird, indem Sie die Zehen kneifen oder den Hornhautreflex überprüfen. Reduzieren Sie Isofluran, um die Werte bei 2,0 zu halten. Machen Sie einen ein bis 1,2 Zentimeter großen Schnitt mit einer chirurgischen 10-Klinge vom Rand des Hinterhauptbeins bis zu den Schultern in einer sanften Bewegung.Machen Sie vorsichtig einen Schnitt in der Mittellinie Raphe des Trapezmuskels und legen Sie die paarigen Longus capitis-Muskeln frei. Platzieren Sie beide Retraktorhaken zwischen den gepaarten Longus capitis-Muskeln, von denen einer nach links und der andere nach rechts ausgerichtet ist. Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die linke und rechte Säuche des gepaarten Musculus longus capitis zu trennen, beginnend mit dem Hinterkopf, wo die Mittellinie gut sichtbar ist.Führen Sie die stumpfe Pinzette über den Knochen des Hinterkopfes in der Mittellinie bis zu der Stelle, an der sie auf die zisternale Dura mater trifft, und fahren Sie dann weiter über die Dura mater zum Atlas. Positionieren Sie die Retraktoren neu und passen Sie die Spannung an, indem Sie die Hämostaten neu positionieren. Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die Muskeln weiter in der Mittellinie zu trennen, um eine gute Sicht auf den Hirnstamm und das Kleinhirn zu erhalten.Wiederholen Sie den obigen Vorgang nach Bedarf, bis das Kleinhirn und der Hirnstamm unterhalb der Dura erscheinen. Reinigen Sie mit stumpfen Laminektomiezangen die Dura der kleinen Bindegewebsstränge, indem Sie die Pinzette von der Mittellinie in eine laterale Richtung bewegen, bis eine klare Sicht auf den Hirnstamm besteht, wodurch mehr seitlicher Raum entsteht. Betrachten Sie die dorsale Oberfläche des Hirnstamms mit detaillierten Orientierungspunkten durch die offene Dura.Verwenden Sie die abgewinkelte Pinzette, um die Dura zu greifen, die sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt, und verwenden Sie dann die Federschere, um eine kleine Öffnung von etwa 0,5 bis 1,5 Millimetern in der Dura zu machen. Sobald die Dura geöffnet ist, drainieren Sie überschüssige Zerebrospinalflüssigkeit mit einem sterilen Q-Tip. Der Obex, der Punkt, an dem sich der zentrale Kanal in den vierten Ventrikel öffnet, ist der standardmäßige anterior-posteriore und mediolaterale Nullpunkt.Positionieren Sie die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm zum Ziel. Senken Sie den Arm des Rückens auf die dorsale Oberfläche, die sich aus dem dorsoventralen Nullpunkt bildet. Dann senken Sie die Pipette auf den Hirnstamm und injizieren Sie die Lösung.Lassen Sie die Nadel nach der Injektion für ein bis fünf Minuten an Ort und Stelle, um eine Nadelspur zu vermeiden, wenn Sie Volumina zwischen drei und 50 Nanolitern verwenden. Heben Sie dann die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm an und wiederholen Sie dies für mehrere Ziele. Entfernen Sie die Haken vorsichtig aus dem Operationsfeld.Die gepaarten Musculi longus capitis fallen in eine neutrale Position zurück, die die Cisterna magna vollständig bedeckt. Schließen Sie den Trapezmuskel und die Dura mater in der Mittellinie nicht, da sie zu zerbrechlich sind, um Nähte zu halten. Schließen Sie die Haut mit 3 Nylon- oder Polypropylennähten.Der Cisterna-Magna-Ansatz ermöglicht es, auf die Strukturen des kaudalen Hirnstamms und der oberen Halsschnur abzuzielen, die sonst über stereotaktische Standardansätze schwer zu erreichen sind oder zu inkonsistentem Targeting neigen. Bei Mäusen wurden Strukturen wie der Nucleus hypoglossus, die ventrale Atmungsgruppe und die angrenzende retikuläre Bildung im kaudalen Hirnstamm routinemäßig mit dem Cisterna magna-Ansatz anvisiert, wie hier für den Hypoglossuskern und die ventromediale Medulla dargestellt. Um die Genauigkeit des Cisterna magna-Ansatzes gegenüber dem Standardansatz zu bestimmen, wurde der Abstand zwischen den beabsichtigten und tatsächlichen Zielstellen in der anteroposterioren, mediolateralen und dorsoventralen Ebene für ventrale und dorsale Regionen gemessen.Die Ergebnisse zeigen signifikant geringere Fehler in der anteroposterioren, mediolateralen und dorsoventralen Ebene im Vergleich zum Standardansatz, was die verbesserte Genauigkeit des Cisterna magna-Ansatzes für diese Ziele unterstreicht. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig sicherzustellen, dass die Anteroflexion des Kopfes und die Erhöhung des Körpers wie beschrieben durchgeführt werden. Als nächstes ist es wichtig, wichtige Orientierungspunkte zu erkennen, bevor Sie den Muskel oder die Dura mater manipulieren.Wenn diese Landmarken nicht erkannt werden oder wenn sie verloren gehen, wird es schwierig sein, orientiert zu bleiben und das Verfahren wie beabsichtigt auszuführen. Diese Technik trug dazu bei, konzeptionelle Fragen im Zusammenhang mit der funktionellen anatomischen Organisation innerhalb des kaudalen Hirnstamms und der oberen Halsschnur zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Joshi, K., et al. Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt den stereotaktischen Ansatz der Cisterna magna für die gezielte Verabreichung an den Hirnstamm und das obere Rückenmark. Durch den Zugang zur mit Liquor gefüllten Cisterna magna ermöglicht dieser Ansatz präzise Injektionen in Bereiche, die mit stereotaktischen Standardmethoden...

Stereotaktischer Cisterna magna-Ansatz für die therapeutische Verabreichung in einem Mausmodell

Quelle: Porlan, E., et al. Stabile und effiziente genetische Modifikation von Zellen in der adulten Maus V-SVZ zur Analyse von autonomen und nicht-autonomen Effekten neuraler Stammzellen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine stabile genetische Modifikation von neuralen Stammzellen (NSCs) in der ventrikulär-subventrikulären Zone (V-SVZ) durch stereotaktische Injektion eines virustragenden therapeutischen Gens in ein Mausmodell. Das Virus dringt in NSCs ein, durchläuft eine reverse...

Stereotaktische Injektion von Viren für eine stabile genetische Veränderung in einem Mausmodell

Quelle: Zamboni, M., et al., Induktion der Modifikation von leptomeningealen Zellen durch intrazisternale Injektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verabreichung eines Induktor-Medikaments in die Cisterna magna einer anästhesierten Maus. Die Injektion induziert selektiv die Expression von Fluoreszenzmarkern in Oberflächenzellen des Gehirns, die über die Zerebrospinalflüssigkeit zugänglich sind, was durch Fluoreszenzbildgebung bestätigt wurde.

Gezielte Verabreichung von Medikamenten in einem Mausmodell über Cisterna Magna Injektion

Quelle: Xavier, A. L. R., et al. Kanülenimplantation in die Cisterna Magna von Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Implantation einer Kanüle in die Cisterna magna einer anästhesierten Maus. Bei der Technik wird eine auf der Nadel befestigte Kanüle durch die Dura in die umgekehrte dreieckige Cisterna magna geführt und für die gezielte Abgabe in das Liquor cerebrospinalis gesichert.

Kanülenimplantation in die Cisterna Magna im Mausmodell

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren, um vom Menschen stammende Tumorzellen in die Cisterna magna des Gehirns einer Maus zu bringen. Das orthotope Mausmodell kann verwendet werden, um die metastasierende Ausbreitung von Krebs auf die kranialen Hirnhäute zu untersuchen.

Chirurgische Cisterna magna Injektion: eine Methode zur direkten Verabreichung von Tumorzellen in das zentrale Nervensystem des Mausmodells

Quelle: Fricano-Kugler, C. J., et al. Design, Verpackung und Verabreichung von CRISPR-Retro- und Lentiviren mit hohem Titer durch stereotaktische Injektion. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die stereotaktische Virusinjektion zur präzisen neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen. Das Protokoll gewährleistet eine genaue Virusabgabe an den Gyrus dentatus und ermöglicht die Fluoreszenzmarkierung und den CRISPR-vermittelten Gen-Knockout, um neuronale Schaltkreise, Genfunktionen und...

Stereotaktische Virusinjektion zur gezielten neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen

Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Durchführung der Cisterna Magna Kanülierung (CMc), minimalinvasiv, Tracer, Substrate und Signalmoleküle in den Liquor cerebrospinalis (CSF) zu liefern. In Kombination mit verschiedenen Bildgebungsverfahren ermöglicht CMc Glymphatic System sowie CSF Dynamik Bewertung und Gehirn-weite Lieferung verschiedener Verbindungen.

Kanüle Implantation in die Cisterna Magna von Nagetieren

Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung neuronaler Dynamik und Mikroschaltkreise in sich frei verhaltenden Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von Gehirnoperationen, um eine gute In-vivo-Kalziumbildgebung mit einem Miniskop zu erreichen.

Stereotaktische virale Injektion und Gradientenindex-Linsenimplantation für Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine praktische Strategie, um den Verifizierungsschritt stereotaktischer Injektionskoordinaten zu beschleunigen, bevor die Virusverfolgung mit Farbstoffen und Gefrierschnitten durchgeführt wird.

Vorläufige Validierung von stereotaktischen Injektionskoordinaten mittels Kryosektion

Das Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Injektion von Tumorzellen über den perkutanen Punktionsweg in die Cisterna magna, das bei Mäusen eine robuste leptomeningeale Metastasierung induziert und so das Trauma und die extrakranielle Tumorlast reduziert.

Minimalinvasives Cisterna magna-Injektionsmodell für Studien zur leptomeningealen Metastasierung bei Mäusen

Lernen Sie eine stereotaktische Mikroinjektionstechnik für den kaudalen Hirnstamm und das obere zervikale Rückenmark bei Mäusen über die Cisterna magna. Diese Methode ermöglicht präzise Zielinjektionen unter visueller Kontrolle.

Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen (Video) | JoVE Journal

Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen

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