Name: Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung des mitochondrialen Energiestoffwechsels in 3D-Tumorsphäroiden mittels Seahorse-Extrazellulärer-Flussanalyse. Diese Methode liefert präzise metabolische Daten für die Krebsforschung.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Wichtigste Ergebnisse und Ergebnisse Dieses Dokument enthält ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Sphäroide unter Verwendung einer Reihe von Krebszelllinien mit dem XFe96 XF Analyzer. Es wird ein Verfahren zur schnellen Kultivierung von A549, HepG2/C3A, MCF7 und SK-OV-3 zellulären Sphäroiden unter Verwendung von zellabweisenden Technologien zur erzwungenen Aggregation entwickelt und beschrieben. Dieses Protokoll befasst sich mit vielen Über...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
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<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

Fortschritte bei In-vitro-Modellen in der biologischen Forschung haben in den letzten 20 Jahren rasante Fortschritte gemacht. Solche Modelle umfassen nun Organ-on-a-Chip-Modalitäten, Organoide und 3D-Mikrogewebe-Sphäroide, die alle zu einem gemeinsamen Schwerpunkt geworden sind, um die Translation zwischen In-vitro- und In-vivo-Studien zu verbessern. Die Verwendung fortschrittlicher In-vitro-Modelle, insbesondere von Sphäroiden, umfasst mehrere Forschungsbereiche, darunter Tissue Engineering, Stammzellforschung, Krebs und Krankheitsbiologie 1,2,3,4,5,6,7 und Sicherheitstests, einschließlich genetischer Toxikologie 8,9,10, Nanomaterial-Toxikologie 11, 12,13,14 und Arzneimittelsicherheits- und Wirksamkeitsprüfung 8,15,16,17,18,19.
Die normale Zellmorphologie ist entscheidend für den biologischen Phänotyp und die biologische Aktivität. Die Kultivierung von Zellen zu 3D-Mikrogewebe-Sphäroiden ermöglicht es Zellen, eine Morphologie, phänotypische Funktion und Architektur anzunehmen, die eher der in vivo beobachteten ähnelt, aber mit klassischen Monolayer-Zellkulturtechniken schwer einzufangen ist. Sowohl in vivo als auch in vitro wird die zelluläre Funktion direkt von der zellulären Mikroumgebung beeinflusst, die nicht auf die zelluläre Kommunikation und Programmierung beschränkt ist (z. B. Zell-Zell-Verbindungsbildungen, Möglichkeiten zur Bildung von Zellnischen); Zellexposition gegenüber Hormonen und Wachstumsfaktoren in der unmittelbaren Umgebung (z. B. zelluläre Zytokin-Exposition als Teil einer Entzündungsreaktion); Zusammensetzung physikalischer und chemischer Matrizen (z. B. ob Zellen in einer steifen Gewebekulturplastik oder einer elastischen Gewebeumgebung gezüchtet werden); und vor allem, wie der Zellstoffwechsel durch die Ernährung und den Zugang zu Sauerstoff sowie die Verarbeitung von Stoffwechselabfallprodukten wie Milchsäure beeinflusst wird.
Die metabolische Flussanalyse ist eine leistungsstarke Möglichkeit, den Zellstoffwechsel innerhalb definierter In-vitro-Systeme zu untersuchen. Insbesondere ermöglicht die XF-Technologie die Analyse von Live-Echtzeit-Veränderungen in der zellulären Bioenergetik intakter Zellen und Gewebe. Angesichts der Tatsache, dass viele intrazelluläre Stoffwechselereignisse in der Größenordnung von Sekunden bis Minuten auftreten, sind funktionelle Ansätze in Echtzeit von größter Bedeutung, um Echtzeitänderungen des zellulären Stoffwechselflusses in intakten Zellen und Geweben in vitro zu verstehen.
Dieses Papier enthält Protokolle für die Kultivierung von Krebs-abgeleiteten Zelllinien A549 (Lungen-Adenokarzinom), HepG2 / C3A (hepatozelluläres Karzinom), MCF-7 (Brust-Adenokarzinom) und SK-OV-3 (ovarielles Adenokarzinom) als In-vitro-3D-Sphäroidmodelle unter Verwendung von erzwungenen Aggregationsansätzen (Abbildung 1). Es beschreibt auch (i) detailliert, wie der mitochondriale Energiestoffwechsel einzelner 3D-Sphäroide mit dem Agilent XFe96 XF-Analysator untersucht werden kann, (ii) zeigt Möglichkeiten zur Optimierung von XF-Assays mit einzelnen 3D-Sphäroiden auf und (iii) diskutiert wichtige Überlegungen und Einschränkungen der Untersuchung des 3D-Sphäroidstoffwechsels mit diesem Ansatz. Am wichtigsten ist, dass dieses Papier beschreibt, wie Datensätze gesammelt werden, die die Berechnung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ermöglichen, um die oxidative Phosphorylierung und damit die mitochondriale Funktion in zellulären Sphäroiden zu bestimmen. Obwohl nicht für dieses Protokoll analysiert, ist die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) ein weiterer Parameter, der neben OCR-Daten in XF-Experimenten gemessen wird. ECAR wird jedoch oft schlecht oder falsch aus XF-Datensätzen interpretiert. Wir kommentieren die Grenzen der Berechnung von ECAR nach grundlegenden Ansätzen des Technologieherstellers.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#86012804</td><td>Lungenkarzinom-Zelllinie</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7,4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>XF-Testmedium mit 1 mM HEPES, ohne Phenolrot, Natriumbicarbonat, Glukose, L-Glutamin und Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XFe96 Extrazellulärer Flussanalysator</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>Instrument zur Messung der Geschwindigkeit der sphäroiden Sauerstoffaufnahme in einzelnen Sphäroiden</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>Mitochondrialer Respiratorischer Komplex III-Inhibitor</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>Mitochondrialer Protnophor-Entkoppler</td></tr><tr><td>Schwarzwandige Mikroplatte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td>Für fluoreszenzbasierte Assays</td></tr><tr><td>CELLSTAR zellabweisende Oberfläche 96 U Well Mikrotiterplatten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>Mikrotiterplatten zur Erzeugung von Sphäroiden</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Assay zur Bestimmung der Zellviabilität in 3D-Mikrogewebe-Sphäroiden</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysin</td><td>R& D Systems, eine Biotechne-Marke</td><td>3439-100-01</td><td>Molekularer Zellklebstoff zur Beschichtung von XFe96 Sphäroid-Mikrotiterplatten zur Erleichterung der Anhaftung von Sphäroiden</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Merck Life Sciences</td><td>G8270</td><td>Ergänzung für Zellkulturwachstum und XF-Assay-Medium</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td>Nährmedium für HepG2/C3A-Sphäroide</td></tr><tr><td>EVOS XL Core Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Phasenkontrast-Bildgebungsmikroskop</td></tr><tr><td>EZ-PCR Mykoplasmen-Testkit</td><td>Biologische Industrie</td><td>20-700-20</td><td>Mykoplasmen-Screening in Zellkulturen</td></tr><tr><td>Fidschi ist nur Bild J</td><td></td><td></td><td>Analyse von zusammengestellten Bildern</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;#CRL-10741</td><td>Leberkarzinom-Zelllinie, ein klonales Derivat der HepG2-Ausgangszelllinie</td></tr><tr><td>Lactate-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Assay zur Messung von Laktat im Sphäorid-Kulturmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM Lösung)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>G7513</td><td>Supplement für Zellkulturwachstum und XF-Assay-Medium</td></tr><tr><td>M50 Stereomikroskop</td><td>Leica Mikroskope</td><td>LEICAM50</td><td>Stereo-Dissektions-Mikrskop; zur Handhabung von Sphäoriden</td></tr><tr><td>MCF-7 ECACC</td><td></td><td>#86012803</td><td>Brust-Adenokarzinom-Zelllinie</td></tr><tr><td>Oligomycin aus Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>ATP-Synthase-Inhibitor</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antibiotika, die dem Zellkulturmedium zugesetzt</td></tr> wurden <tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Initrogen</td><td>P7589</td><td>Analyse von dsDNA in Spehroiden</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>Kulturmedium für A549, MCF7 und SK-OV-3 Sphäroide</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Build 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>Jedes Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak enthält: 6 Seahorse XFe96 Sphäroid-Mikrotiterplatten (102978-100), 6 XFe96 Sensorkartuschen und 1 Flasche Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)</td></tr><tr><td>Serologische Pipette: 5, 10 und 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107; 607107; 760107</td><td>Verbrauchsmaterialien für die Zellkultur</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#HTB-77</td><td>Ovarial-Adenokarzinom-Zelllinie</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM Lösung)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Zellkulturwachstum und XF-Assay-Medium</td></tr><tr><td>T75 cm2 Zellkulturkolben</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Mit Gewebekulturen behandelte Flaschen zur Aufbewahrung von Zellkulturen</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Reagenz für die Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Wellencontroller-Software</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Spitze mit breiter Blende</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>Pipettenspitzen mit breiter Öffnung für die Handhabung von Sphäroiden</td></tr></tbody></table>

erforschung des mitochondrialen energiestoffwechsels einzelner 3d-mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer flussanalyse

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Dreidimensionale (3D) zelluläre Aggregate, sogenannte Sphäroide, sind in den letzten Jahren an die Spitze der In-vitro-Zellkultur gerückt. Im Gegensatz zur Kultivierung von Zellen als zweidimensionale, einzellige Monoschichten (2D-Kultur) fördert, reguliert und unterstützt die sphäroide Zellkultur die physiologische Zellarchitektur und -merkmale, die in vivo existieren, einschließlich der Expression extrazellulärer Matrixproteine, Zellsignalisierung, Genexpression, Proteinproduktion, Differenzierung und Proliferation. Die Bedeutung der 3D-Kultur wurde in vielen Forschungsbereichen anerkannt, darunter Onkologie, Diabetes, Stammzellbiologie und Tissue Engineering. In den letzten zehn Jahren wurden verbesserte Methoden entwickelt, um Sphäroide herzustellen und ihre Stoffwechselfunktion und ihr Schicksal zu beurteilen.
Extrazelluläre Flussanalysatoren (XF) wurden verwendet, um die mitochondriale Funktion in 3D-Mikrogeweben wie Sphäroiden zu untersuchen, wobei entweder eine XF24-Insel-Capture-Platte oder eine XFe96-Sphäroid-Mikroplatte verwendet wurden. Unterschiedliche Protokolle und die Optimierung des mitochondrialen Energiestoffwechsels in Sphäroiden unter Verwendung der XF-Technologie wurden jedoch nicht im Detail beschrieben. Dieses Dokument enthält detaillierte Protokolle zur Untersuchung des mitochondrialen Energiestoffwechsels in einzelnen 3D-Sphäroiden unter Verwendung von Sphäroid-Mikrotiterplatten mit dem XFe96 XF-Analysator. Unter Verwendung verschiedener Krebszelllinien kann die XF-Technologie nachweislich zwischen der Zellatmung in 3D-Sphäroiden nicht nur unterschiedlicher Größe, sondern auch unterschiedlicher Volumina, Zellnummern, DNA-Gehalt und -Typ unterscheiden.
Die optimalen mitochondrialen Effektorverbindungskonzentrationen von Oligomycin, BAM15, Rotenon und Antimycin A werden verwendet, um spezifische Parameter des mitochondrialen Energiestoffwechsels in 3D-Sphäroiden zu untersuchen. Dieses Papier diskutiert auch Methoden zur Normalisierung von Daten, die von Sphäroiden erhalten wurden, und befasst sich mit vielen Überlegungen, die bei der Erforschung des Sphäroidstoffwechsels mit der XF-Technologie berücksichtigt werden sollten. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, die Forschung in fortschrittlichen In-vitro-Sphäroidmodellen voranzutreiben.

Um wohlgeformte, kompakte Sphäroide zu erhalten, wurde jede Zelllinie einzeln für die Aussaatdichte und die Kultivierungsdauer optimiert (Abbildung 3). A549-, HepG2/C3A- und SK-OV-3-Zelllinien bildeten zunächst lose Aggregate, die erst nach 7 Tagen in Kultur zu runden Sphäroiden mit klar definierten Umfängen übergingen. Umgekehrt könnten MCF-7-Zellen innerhalb von 3 Tagen Sphäroide bilden. Es gab eine klare Korrelation zwischen der anfänglichen Zellaussaatdichte und dem Sphäroidvolumen nach ...

Diese Protokolle werden den Benutzern helfen, den mitochondrialen Energiestoffwechsel in 3D-Krebszelllinien-abgeleiteten Sphäroiden mithilfe der extrazellulären Flussanalyse von Seepferdchen zu untersuchen.

Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, den mitochondrialen Energiestoffwechsel und nahtlose Sphäroide zu untersuchen, um Vergleiche zwischen verschiedenen Zelllinien, Zellzahlen und Phänotypen sowie medikamentöse Behandlungen in einer Reihe von Feldwirkstoffen und Krebsforschung zu ermöglichen. Unsere Arbeit präsentiert ein detailliertes Protokoll zur Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels unter Verwendung von 3D-Sphäroiden, die das überlegene physiologische Modell im Vergleich zu Zellmonoschichtexperimenten bieten. Biologische Beobachtungen könnten von glasigen Sphäroiden auf In-vivo-Tumore extrapolieren und Wege identifizieren, die auf den Sphäroidtumorstoffwechsel abzielen können.Zum Beispiel Kohlenhydrat-Nutzen während des Sphäroidwachstums. Alle Daten seahorse extracellular flux 96 Instrument ist sehr empfindlich. Die Positionierung von In-vitro-Sphäroiden innerhalb der Assay-Platte ist von größter Bedeutung, um genaue Daten auf der Ebene des Einzelsphäroids zu erhalten.Überprüfen Sie die Sphäroidlebensfähigkeit mit einem inversen Lichtmikroskop mit Phasenkontrast bei 4-facher Vergrößerung, um eine intakte Sphäroidstruktur, Morphologie und allgemeine Gleichmäßigkeit zwischen den Proben zu gewährleisten. Um die Sensorpatrone mit Feuchtigkeit zu versorgen, aliquotieren Sie etwa 20 Milliliter des Kalibrats in ein konisches Rohr. Legen Sie das konische Rohr mit dem Kalibrant über Nacht in einen kohlendioxidfreien 37 Grad Celsius-Inkubator.Nehmen Sie den Inhalt des Assay-Kits heraus. Legen Sie die Sensorkassette kopfüber neben die Gebrauchsplatte. Pipetten Sie 200 Mikroliter steriles doppelt destilliertes Wasser mit einer Mehrkanal-P300-Pipette in jede Vertiefung der Gebrauchsplatte.Legen Sie die Sensorkassette auf die Utility-Platte. Überprüfen Sie, ob der Wasserstand in jedem Brunnen hoch genug ist, um die Sensorsonden einzutauchen. Die montierte Sensorkartusche in einen kohlendioxidfreien 37-Grad-Inkubator geben und über Nacht stehen lassen.Um die Sphäroid-Assay-Mikrotiterplatte zu beschichten, fügen Sie 30 Mikroliter sterile 0,1 Milligramm pro Milliliter Poly-D-Lysin-Lösung pro Vertiefung der Sphäroid-Mikrotiterplatte unter Verwendung einer septischen Technik hinzu. Saugen Sie die Lösung aus jeder Vertiefung der Sphäroid-Mikrotiterplatte ab, invertieren Sie die Platte und klopfen Sie sie fest auf Seidenpapier, um die Restlösung zu entfernen. Waschen Sie jede Vertiefung der Platte mit 200 Mikrolitern sterilem doppelt destilliertem Wasser.Kehren Sie nach der letzten Wäsche die Mikrotiterplatte um und klopfen Sie sie fest auf Seidenpapier, um Restwasser zu entfernen. Lassen Sie die Platte 30 Minuten an der Luft trocknen, bevor sie später verwendet wird. Bereiten Sie das XF RPMI-Medium wie im Manuskript beschrieben vor.Vorwärmen Sie den ergänzten XF RPMI Assay eine Stunde vor dem Assay auf 37 Grad Celsius vor. Und wärmen Sie die beschichtete Sphäroid-Assay-Mikroplatte in einem kohlendioxidfreien 37-Grad-Inkubator vor. Nehmen Sie das konische Rohr mit dem Kalibrant und der Sensorpatrone aus dem Luftinkubator.Entfernen Sie die Sensorkassette von der Gebrauchsplatte und legen Sie sie kopfüber auf die Arbeitsfläche. Saugen Sie mit einer P300-Mehrkanalpipette das Wasser von der Utility-Platte ab und entsorgen Sie es. Fügen Sie 200 Mikroliter des vorgewärmten Calibrants zu jeder Vertiefung der Gebrauchsplatte hinzu.Legen Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte, um sicherzustellen, dass die Sensoren gut in das Kaliber eingetaucht sind. Überführen Sie die zusammengebaute Sensorkartusche in den kohlendioxidfreien 37-Grad-Inkubator, bis sie bereit ist, die Anschlussinjektionslösungen zu laden. Nehmen Sie die Sphäroidkulturplatte aus dem Inkubator und beobachten Sie die Sphäroide unter dem Mikroskop, um ihre Integrität vor dem Sphäroidtransfer sicherzustellen.Laden Sie 180 Mikroliter vorgewärmtes Assay-Medium in jede Vertiefung der Sphäroidplatte, einschließlich aller Hintergrundkorrekturvertiefungen. Eine sieben Zentimeter große Petrischale teilweise mit drei Millilitern des Assay-Mediums füllen. Übertragen Sie die Sphäroide von der 96-Well-Kulturplatte in eine Petrischale mit einer Mehrkanalpipette, die mit breiten Pipettenspitzen beladen ist, und das Volumen ist auf 10 bis 50 Mikroliter eingestellt.Stellen Sie das Volumen eines Einkanalpipettors mit einer breiten Pipettenspitze auf 20 Mikroliter ein und saugen Sie vorsichtig einen einzelnen Sphäroid ab. Platzieren Sie die Spitze direkt in der Mitte jeder Vertiefung dieser Sphäroid-Assay-Mikroplatte und lassen Sie die Kapillarwirkung zu, um das Sphäroid aus der Pipettenspitze zurückzuziehen. Bestätigen Sie die Entwicklung unter dem Mikroskop, indem Sie den Inhalt des Pipettierers in die Petrischale zurückpipettieren.Sobald alle diese Sphäroide auf die Sphäroid-Assay-Mikroplatte übertragen wurden, übertragen Sie die Platte für mindestens eine Stunde in einen Nicht-Kohlendioxid-Inkubator von 37 Grad Celsius. Bereiten Sie die Arbeitsstoffkonzentrationen jeder Verbindung wie im Manuskript beschrieben unter Verwendung eines vollständig ergänzten vorgewärmten XF RPMI-Assay-Mediums vor. Dosierte 20 Mikroliter der Arbeitslösung jeder Verbindung in alle entsprechenden Ports mit einer kalibrierten P100-Mehrkanalpipette.Bereiten Sie den Analysator für das Laden der Sensorpatrone vor. Um wohlgeformte kompakte Sphäroide zu erhalten, wurde jede Zelllinie einzeln für die Aussaatdichte und die Kultivierungsdauer optimiert. Bei optimierten Seeding-Strategien betrug das Sphäroidvolumen für SK-OV-3 etwa 5,46 x 10 bis zu den sieben Mikrometern und für A549 1,45 x 10 bis acht Mikrometer gewürfelt.Alle Sphäroidtypen hatten eine lineare Korrelation zwischen der anfänglichen Aussaatdichte und dem Sphäroidvolumen. Die perfekte Sphäroidsymmetrie hatte eine Zirkularität von 1,0 und eine Abweichung von 1,0 deutete auf einen Verlust der Zirkularität hin. Für alle Sphäroidtypen stieg die Sauerstoffverbrauchsrate mit der Sphäroidgröße an und korrelierte linear mit dem Sphäroidvolumen mit dem höchsten in MCF-7-Sphäroiden und dem niedrigsten in SK-OV-3-Sphäroiden.MCF-7-Sphäroide reagierten während des gesamten Experiments nicht auf die Fahrzeugsteuerung. Die Sauerstoffverbrauchsrate in MCF-7-Sphäroiden wurde mit Oligomycin nach fünf Messzyklen nach der ersten Injektion von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter gesenkt. Als Reaktion auf BAM15 wurde der Sauerstoffverbrauch vor der zweiten Injektion erhöht.Während die Kombination von Rotenon plus Antimycin A es senkte. Ein Protokoll zur genauen Untersuchung der basalen mitochondrialen Atmung. ADP-Phosphorylierungsatmung, Leckatmung, Kopplungseffizienz, maximale Atmungskapazität und freie Atmungskapazität wurden unter Verwendung von krebsabgeleiteten 3D-Sphäroiden entwickelt.Alle respiratorischen Verbindungen ergaben die erwarteten kinetischen Sauerstoffverbrauchsraten für die ausgewählten Verbindungen, die eine durchschnittliche stetige basale Atmungsrate von 20 bis 30 Picomol Sauerstoff pro Minute und Bohrloch zeigten. Lage der Sphäroide innerhalb der Mikrotiterplatte und Messzyklusnummer nach der Injektion der Verbindung, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenzen zwischen den Zugabe von Verbindungen stabil sind. Bei der Erforschung der mitochondrialen Atmungskapazität mit Entkopplern ist nicht nur die Konzentration entscheidend, sondern auch ihre Fähigkeit, die Atmung in Gegenwart von Oligomycin zu entkoppeln, das typischerweise vor dem Entkoppler in Experimenten zur Untersuchung des mitochondrialen Energiestoffwechsels hinzugefügt wird.

exploring-mitochondrial-energy-metabolism-single-3d-microtissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse

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