Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes von Ratten zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen
29. August 2022
Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (Ad-MSCs) können eine potenzielle Quelle für MSCs sein, die sich in insulinproduzierende Zellen (IPCs) differenzieren. In diesem Protokoll stellen wir detaillierte Schritte zur Isolierung und Charakterisierung von epididymalen Ad-MSCs von Ratten bereit, gefolgt von einem einfachen, kurzen Protokoll zur Generierung von IPCs aus denselben Ratten-Ad-MSCs.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, rotes Fettgewebe, getrocknete mesenchymale Stammzellen zu isolieren und zu charakterisieren und sie mit einfachen Methoden in Richtung insulinproduzierender Zellen zu differenzieren. Mesenchymale Stammzellen haben die Wege in der Genetik gefunden. Sie können aus verschiedenen Quellen wie Knochenmark, Fettgewebe und perinatalem Gewebe isoliert werden.
Sie akzeptieren ausgezeichnete kulturelle Eigenschaften. Sie sind multipotent und können potenziell verschiedene Krankheiten behandeln. Fettgewebe bietet eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen.
Diese Fett-MSCs können leicht aus Lipo-Aspiraten mit hoher Ausbeute im Vergleich zu anderen Quellen wie Knochenmark isoliert werden. Und sie können eine gute Quelle sowohl für autologe als auch für allogene Transplantationen sein. In diesem Video stellen wir ein einfaches Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von adipösen mesenchymalen Stammzellen aus Fett von Ratten-Nebenhoden vor.
Dieses Verfahren ist eine einfache, hocheffiziente Methode zur Isolierung. Nach der Isolierung werden wir die Differenzierung dieser adipösen mesenchymalen Stammzellen in insulinproduzierende Zellen mit einem einfachen, relativ kurzen Protokoll ertragen. Wir beginnen mit der Isolierung von adipösen mesenchymalen Stammzellen durch kollagene Verdauung von Nebenhodenfett, um eine stärkere vaskuläre Fraktion zu erhalten.
Dann werden mesenchymale Stammzellen durch ihre plastische Adhärenz sowie die Expression von CD-Markern und die Differenzierung in mehrere mesodermale Linien charakterisiert. Anästhisieren Sie das Tier und euthanasieren Sie es dann mit Zervixdislokation. Sprühen Sie den ganzen Körper mit 70% Ethanol und beginnen Sie mit der Exzision der Haut und der Muskeln im unteren Teil des Bauches.
Dann legen Sie die Hoden mit dem Nebenhodenfett frei. Schneiden Sie das Nebenhodenfett vorsichtig ab. Achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht mit den Fetten zu schneiden.
Schneiden Sie in einer Biosicherheitskabine das Fettgewebe mit Pinzette und Skalpell in kleine Stücke. Das Fettgewebe in ein Zentrifugenröhrchen mit 10 Milliliter sterilem PBS überführen. Beginnen Sie mit dem Waschen, indem Sie das Falcon-Rohr 45 Sekunden lang kippen.
Lassen Sie dann die Röhre fünf Minuten stehen, um sie in zwei Schichten zu trennen. Entfernen Sie das infranierte PBS mit einer 10-Milliliter-Spritze. Wiederholen Sie diese Waschschritte vier- bis fünfmal, bis PBS klar ist.
Nach dem Waschen das Fettgewebe in kollagener Lösung wieder suspendieren und dann im Schüttelwasserbad inkubieren, bis das Gewebe fast homogen ist. Danach wirbeln Sie die kollagene Mischung des Gewebes für 15 Sekunden ein und zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten lang. Nach der Zentrifugation haben Sie drei Schichten.
Verwerfen Sie vorsichtig den Überstand über der stromalen Gefäßfraktion. Zuerst die Ölschicht oben vorsichtig entsorgen, gefolgt von der Echoschicht, ohne das stromale Gefäßfraktionspellet zu stören. Die Stromal-Gefäßfraktion wird in steriler BSA wieder suspendiert und fünf Minuten lang rezentrifugiert.
Gesamte Zentrifugation, legen Sie komplette DMEM F-12-Medien in einen 25 Zentimeter großen quadratischen Kolben. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das stromale Gefäßpellet in vollständigen DMEM F-12-Medien wieder suspendieren. Und Transfer in die Kulturflasche.
In 37 Grad 5% Kohlendioxid-Inkubator legen. Entfernen Sie am nächsten Tag nicht angehängte Zellen und ersetzen Sie die Medien durch frische Medien. Ab dem nächsten Tag der Isolation werden die fibroblastenähnlichen Zellen erscheinen.
Dann werden sie im Laufe der Zeit allmählich an Anzahl und Größe zunehmen. Durch das Passieren werden die Zellen homogener. Diese Zellen weisen alle Charakterisierungskriterien für mesenchymale Stammzellen auf.
Diese Zellen wurden mit Hilfe dieses einfachen Protokolls, das Nicotinamid-Beta-Mercaptoethanol und Exendin-4 enthält, in Richtung insulinproduzierender Zellen differenziert. Während der Differenzierungsschritte beginnen die Zellen, ihre fibroblastische Form zu verlieren und ich denke, clusterartige Morphologie. Bei Verwendung von insulinproduzierenden Zellen zeigen sie eine positive karminrote Disithon-Färbung, dann exprimieren verwendete insulinproduzierende Zellen verschiedene Beta-Zellmarker wie Pdx-1, mafA und Insulin.
Darüber hinaus sezernieren induzierte insulinproduzierende Zellen höhere Insulinspiegel im Überstand, wenn sie mit einer höheren Glukosekonzentration konfrontiert werden. Wir haben ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von adipösen mesenchymalen Stammzellen zur Verfügung gestellt. Wir stellen hier auch ein relativ kurzes, einfaches und effizientes Protokoll zur Differenzierung von adipösen mesenchymalen Stammzellen in insulinproduzierende Zellen zur Verfügung.
Dies bietet Forschern ein Einfallstor, um in das Gebiet der mesenchymalen Stammzellen einzusteigen und ihre Differenzierung in insulinproduzierende Zellen zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Charakterisierung von aus Fettgewebe stammenden mesenchymalen Stammzellen (Ad-MSCs) aus dem epididymalen Gewebe von Ratten, gefolgt von ihrer Differenzierung in insulinproduzierende Zellen (IPCs). Die dargestellten Methoden sind einfach und für eine unkomplizierte Anwendung im Labor eingerichtet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Regenerative Medizin
- Endokrinologie
Hintergrund
- Stammzellen aus mesenchymalem Gewebe (MSCs) können aus verschiedenen Geweben gewonnen werden, einschließlich Fettgewebe.
- Fettgewebe ist eine reichhaltige Quelle für mesenchymale Stammzellen mit günstigen Kulturbedingungen.
- MSCs besitzen das Potenzial, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, darunter insulinproduzierende Zellen.
- Das Verständnis des Differenzierungsprozesses kann zur Entwicklung von Therapien bei Diabetes beitragen.
Zweck der Studie
- Isolierung und Charakterisierung von raten epididymalen Ad-MSCs.
- Entwicklung eines Protokolls zur Differenzierung dieser Zellen in IPCs.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode für zukünftige Forschungsvorhaben in der regenerativen Medizin.
Verwendete Methoden
- Isolierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) aus dem epididymalen Fettgewebe von Ratten.
- Charakterisierung der isolierten MSCs mittels Standardmarkern.
- Induktion der Differenzierung in insulinproduzierende Zellen.
- Beurteilung der Funktionalität insulinproduzierender Zellen nach der Differenzierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Ad-MSCs mit charakteristischen Oberflächenmarkern.
- Nachgewiesene Differenzierung von Ad-MSCs in IPCs.
- Funktionelle Bewertung zeigte, dass IPCs zur Insulinsekretion fähig sind.
- Das Protokoll stellt eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von IPCs aus Ad-MSCs bereit.
Schlussfolgerungen
- Ad-MSCs sind eine geeignete Quelle zur Erzeugung insulinproduzierender Zellen.
- Das Protokoll kann die weitere Forschung zur Behandlung von Diabetes unterstützen.
- Zukünftige Studien könnten das therapeutische Potenzial dieser IPCs untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Adiposale mesenchymale Stammzellen (Ad-MSCs) bieten eine nachwachsende, ethisch unbedenkliche Quelle zur Generierung insulinproduzierender Zellen (IPCs) in der Diabetesforschung. Das Protokoll beschreibt eine einfache und reproduzierbare Methode zur Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs aus dem epididymalen Fettgewebe von Ratten, gefolgt von der Differenzierung in IPCs unter Verwendung definierter biochemischer Signale. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung bei der frühen therapeutischen Entdeckung für Stoffwechselerkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Multipotenz von MSCs und deren Differenzierung in Richtung einer pankreatischen Beta-Zell-Schicksalslinie.
- Operativer Wert: Stellt eine standardisierte Quelle von Ad-MSCs mit nachgewiesener Expression von CD90, CD73 und CD105 für reproduzierbare Experimente bereit.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von IPCs mittels glucosestimulierter Insulinsekretion (GSIS) und Dithizonfärbung, wodurch eine Beta-Zell-ähnliche Funktionalität bestätigt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt insulinproduzierende Zellen (IPCs), die wichtige Transkriptionsfaktoren von Beta-Zellen exprimieren (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1), die für Wirkstoff-Screening-Assays verwendet werden können.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die skalierbare Herstellung von IPCs aus adipösen mesenchymalen Stammzellen (Ad-MSCs) zur hochdurchsatzfähigen Untersuchung der Insulinsekretionsdynamik.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch konsistente Differenzierungsprotokolle unter Verwendung von HG-DMEM, β-Mercaptoethanol, Nicotinamid und Exendin-4.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Zeigt die translationale Relevanz, indem IPCs erzeugt werden, die auf Glukose-Reize mit erhöhter Insulinsekretion reagieren.
- Operativer Wert: Unterstützt die präklinische Kontinuität, indem eine nachwachsende Zellquelle für Dosis-Wirkungs- und Wirksamkeitsprüfungen in Diabetesmodellen bereitgestellt wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert das biologische Risiko, indem die Multipotenz vor der IPC-Induktion durch osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierung bestätigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Bewertung, insbesondere für Diabetes-Therapeutika, die auf die Ersetzung oder Funktion von Beta-Zellen abzielen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Plastizität mesenchymaler Stammzellen und deren Differenzierungspfad-Spezifikation unter Verwendung definierter Differenzierungsreize.
- Screening: Ermöglicht die Herstellung von testbereiten insulinproduzierenden Zellen mit quantifizierbaren Ergebnissen wie Insulinsekretionsraten und Markerausprägung.
- Analytik: Bietet messbare Endpunkte wie die glucosestimulierte Insulinsekretion (GSIS), Dithizonfärbung und qPCR für Beta-Zell-Marker zur Vergleichbarkeit experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die in-vitro-Generierung insulinproduzierender Zellen mit der präklinischen Validierung durch funktionelle Insulinfreisetzungs-Assays.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Erzeugung insulinproduzierender Zellen aus Fettgewebe für mehrere Projekte und Zelllinien.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Erzeugung von IPCs durch Charakterisierung über mehrere Zelllinien hinweg und funktionelle Validierung.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit der Isolierung und Differenzierung von Ad-MSCs in verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Entwicklung von Diabetes-Therapien durch Validierung zellulärer Modelle der Beta-Zellfunktion.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von stammzellbasierten Ansätzen für die Behandlung metabolischer Erkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von Stammzellen, Differenzierungstechniken und Durchflusszytometrie zur Immunphänotypisierung.
- Setzt Zugang zu Zentrifugen, Biosicherheitswerkbänken, Inkubatoren und Geräten für Glukose-stimulierte Insulinsekretionsassays voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Verdauungs-, Wasch- und Ansäteverfahren, um eine konsistente Ausbeute an stromalem vaskulärem Fraktion zu gewährleisten.
- Erfordert eine Anpassung der Differenzierungszeitpunkte und Reagenzkonzentrationen, wenn verschiedene Fettdepots oder Spezies verwendet werden.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit, Zellen der Passage 3–5 zu verwenden, um Homogenität und Multipotenz vor der Differenzierungsinduktion sicherzustellen.
