Modifizierte Technik zur Verwendung von neonatalen Murinherzen im Langendorff-Präparat

Dieser Ansatz stellt zuverlässig die retrograde Perfusion des neonatalen Ex-vivo-Mausherzens in weniger als drei Minuten her. Dadurch wird das jüngstmögliche Studienalter von mehreren Wochen auf 10 postnatale Tage reduziert. Dieses isolierte retrograde perfundierte Modell ermöglicht die Untersuchung des neonatalen Herzens während einer kritischen Phase der kardialen Entwicklung in einer genetisch veränderbaren und kostengünstigen Spezies.

Während sich dieses Modell für die Untersuchung physiologischer und pharmakologischer Reaktionen auf Ischämie-Reperfusion im neonatalen Herzen eignet. Es könnte auch für die Isolierung von Kardiomyozyten verwendet werden. Um die neugeborene Maus-Aortenkanüle herzustellen, verwenden Sie eine scharfe Schere, um die Spitze abzuschneiden und das Ende einer 26-Gauge-Edelstahlnadel abzustumpfen, wobei Sie darauf achten, den Durchmesser des Nadellumens nicht zu crimpen oder einzuschränken.

Glätten Sie dann die Schnittkante, um Grate zu entfernen, indem Sie das abgestumpfte Ende auf der Labortischplatte vorsichtig mit einer Hin- und Herbewegung abkratzen. Als nächstes befestigen Sie die hergestellte Kanüle an der Langendorff-Apparatur und beurteilen Strömung und Widerstand. Messen Sie die Durchflussraten durch die Kanüle, indem Sie die Puffermenge über ein Intervall von einer Minute sammeln und messen.

Um die Druckdifferenz über die Kanüle zu quantifizieren, während der Krebs-Heneseleit-Puffer fließt, messen Sie den Druck im System mit und ohne angeschlossene Kanüle. Berechnen Sie dann den Kanülenwiderstand mit der folgenden Formel. Als nächstes entfernen Sie die 26-Gauge-Kanüle aus der Langendorff-Apparatur und befestigen einen Hochdruckschlauch an der Verhornungsstelle des Geräts.

Befestigen Sie dann die Aortenkanüle am distalen Ende des Schlauches und entlüften Sie den Schlauch und die Kanüle mit sauerstoffreichem Puffer, um sicherzustellen, dass alle Blasen entfernt werden. Um die Bildung von koronaren Mikrothromben zu verhindern, verabreichen Sie einem 10 Tage alten Mäusewelpen eine intraperitoneale Injektion von Heparin mit einer 26-Gauge-Nadel auf einer Ein-Milliliter-Spritze. Lassen Sie das Heparin einige Minuten zirkulieren, bevor Sie mit der Injektion eines Anästhetikums fortfahren.

Als nächstes platzieren Sie die betäubte Maus in Rückenlage und sichern Sie die Gliedmaßen sofort nach Bewusstlosigkeit. Beginnen Sie mit der Ernte, sobald das Tier nicht auf Zehenkneifen reagiert, da das Tier während der ersten Dissektion spontan atmet. Mit einer geraden Sezierschere wird ein quer subxiphoider Schnitt über die Breite des Tieres gemacht, der die Bauchhöhle freilegt.

Bitten Sie einen Assistenten, den Xiphoidprozess mit einer Pinzette zu erfassen, schneiden Sie dann den Brustkorb bilateral entlang der mittleren Achsellinie in Kopfhaldenrichtung und reflektieren Sie das Brustbein und die Rippen schädelnd, um die Brustorgane freizulegen. Nachdem Sie das Zwerchfell besser identifiziert haben, schneiden Sie den vorderen Teil vollständig ein. Identifizieren Sie die infradiaphragmatische untere Hohlvene oberhalb der Leber und transektieren Sie sie mit einer gekrümmten Irisschere, während Sie eine leichte innere Kopfschmerzspannung auf dem proximalen Segment mit Iriszange beibehalten.

Schneiden Sie dann mit einer gekrümmten Irisschere posterior entlang der inneren Oberfläche der Wirbelsäule, während Sie die untere Hohlvene nach oben und aus der Brusthöhle ziehen. Wenn das Herz mobilisiert wird, winkeln Sie die Schere nach vorne und durchtrennen Sie die großen Gefäße überlegen, um Herz und Lunge vollständig zu entfernen. Tauchen Sie die Probe sofort in eiskalten Krebs-Henseleit-Puffer oder Kochsalzlösung.

Das Herz sollte innerhalb von Sekunden aufhören zu schlagen. Legen Sie ein Stück Papiertuch auf den Boden einer flachen Petrischale, um Reibung zu erzeugen, um das Herz während der Kanülierung zu stabilisieren. Befeuchten Sie das Papiertuch mit eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer, um zu verhindern, dass das Herz daran haftet.

Legen Sie die vorbereitete Petrischale unter das Seziermikroskop und stellen Sie den Fokus ein. Legen Sie nun die Aortenkanüle, die am Hochdruck-Verlängerungsschlauch befestigt ist, zusammen mit einer 5-0-Seidennaht, die lose um ihre Nabe gebunden ist, unter das Seziermikroskop. Nachdem Sie die ausgeschnittenen Thoraxorgane in die Petrischale gelegt haben, identifizieren Sie den Thymus anhand seines weißen Glanzes und zweier Lappen und richten Sie das Exemplar so aus, dass der Thymus vorderer und überlegener ist.

Als nächstes trennen Sie mit einer Pinzette stumpf die Lappen des Thymus und legen die großen Gefäße frei. Identifizieren Sie dann die Aorta, indem Sie unterscheidende Verzweigungsmerkmale des Aortenbogens lokalisieren und sie mit einer feinen scharfen Schere nur proximal zum Start der Arteria subclavia transektieren. Greifen Sie nun vorsichtig die transektorierte Aorta mit fein gebogenen Pinzetten im Juwelierstil und kanülieren Sie die Aorta vorsichtig mit einer stumpfen Nadel mit 26 Gauge, wobei Sie darauf achten, die Aortenklappe nicht zu beschädigen.

Greifen Sie mit einer fein gekrümmten Pinzette die Aorta um die Kanüle und leiten Sie eine retrograde Perfusion ein, um die ischämische Zeit zu begrenzen. Bitten Sie den Assistenten, die Enden der locker gebundenen Naht zu greifen und die Aorta vorsichtig um die Kanüle zu wickeln. Drücken Sie die Naht über oder unter die fein gekrümmte Pinzette, ziehen Sie dann die Naht fest und bestätigen Sie die Angemessenheit des Koronarflusses.

Trennen Sie den Hochdruckschlauch vom Langendorff-Gerät, greifen Sie die Nabe der Kanüle und trennen Sie die stumpfe Nadel vom Hochdruck-Verlängerungsschlauch. Befestigen Sie dann schnell die Nabe der Kanüle am Gerät. Sobald das Herz in der üblichen Position am Langendorff-Apparat aufgehängt ist, wird eine ausreichende Durchblutung bestätigt.

Schneiden Sie Lunge, Thymus und überschüssiges Gewebe vorsichtig ab. Dann schneiden Sie den rechten Vorhof ein, damit das Koronarsinusabwasser frei tropfen kann. Machen Sie einen kleinen Knoten am Ende einer 5-0 Seidennaht, dann durchbohren Sie ein kleines Stück Paraffinfolie mit der Nadel und schieben Sie das Paraffin zum geknoteten Ende.

Führen Sie die Nadel vorsichtig durch die Spitze des Ventrikels und ziehen Sie die Naht durch das Herz, bis der Paraffinfilm an der Seitenwand des Ventrikels fest sitzt. Führen Sie die Nadel durch die Öffnung der mit Wasser gefüllten Wärmejacke des Langendorff-Apparates, damit das Herz umhüllt und erwärmt werden kann. Befestigen Sie dann die Nadel am Kraftaufnehmer und vermeiden Sie den Koronarsinustropfen.

Passen Sie die Naht an, um ein bis zwei Gramm Basalspannung anzuwenden, wie durch die diastolische Spannung oder die Nadir-Absichtsverfolgung angezeigt. Legen Sie dann Oberflächenelektroden auf die oberen und unteren Pole des Herzens, um das Elektrokardiogramm aufzuzeichnen. Anschließend wird das Koronarsinusabwasser zur Analyse mit einem intravenösen 24-Gauge-Katheter entnommen.

Oberflächenelektroden wurden verwendet, um ein kontinuierliches Elektrokardiogramm aufzuzeichnen, das die Bestimmung der intrinsischen Rate und des Rhythmus ermöglichte. Alle ausreichend durchbluteten Herzen schlagen spontan im Sinusrhythmus. Diese Perfusionsstrategie erfüllte die metabolischen Bedürfnisse des neugeborenen Mausherzens, angesichts der vernachlässigbaren Laktatproduktion und der niedrigen prozentualen Sauerstoffextraktion und des Glukoseverbrauchs.

Physiologische variable Mittelwerte, wie die mittlere denervierte intrinsische Herzfrequenz und der mittlere beobachtete Aortenperfusionsdruck, wurden ebenfalls aufgezeichnet und berechnet. Einige Ausschlusskriterien wie die für die Einleitung der Reperfusion erforderliche Zeit, die Dauer der Arrhythmie und der Aortenperfusionsdruck müssen berücksichtigt werden, um die Konsistenz des neonatalen Präparats zu gewährleisten. Nach Etablierung der Perfusion können Interventionen wie Arzneimittelabgabe, Induktion von Ischämie-Reperfusionsverletzungen, Veränderungen von Metaboliten oder Abgabe enzymatischer Wirkstoffe zur Kardiomyozytenisolierung auftreten.