Vergleich von Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze aus Bodenproben
6. Januar 2022
Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.
Die Isolierung entomopathogener Pilze ist für die Entwicklung eines Biopestizids von Bedeutung und kann hilfreich sein, um die Vielfalt, Verbreitung und Ökologie dieser speziellen Gruppe zu untersuchen. Die Verwendung von Insektenködern zur Isolierung entomopathogener Pilze gilt als kostengünstige und hocheffiziente Methode. Chloramphenicol, Thiabendazol, Cycloheximid, künstliche Medien verwenden kein Dodin und benötigen weniger Platz im Bodenprobenprozess.
Zu den kritischen Schritten gehören die Untersuchung von CTC-Platten nach einer und zwei Wochen, um zu verhindern, dass sich andere Pilze verengen und entomopathogene Pilze in der Entwicklung sind, und dann die Identifizierung entomopathogener Pilzkolonien basierend auf ihrer Makromorphologie und Mikromorphologie. Beginnen Sie mit dem Sammeln von 800 Gramm Erde bis zu einer Tiefe von 10 Zentimetern mit einer kleinen Schaufel. Lagern Sie die Proben in Polypropylenbeuteln bei Raumtemperatur bis zum Beginn des Experiments.
Kleine Wurzeln können auch gesammelt werden, da bekannt ist, dass entomopathogene Pilze eine Rhizosphärenkompetenz haben. Zur Isolierung von Pilzen mit Chloramphenicol, Thiabendazol, Cycloheximid oder CTC-selektivem künstlichem Medium werden 0,35 Gramm der Bodenprobe mit oder ohne Wurzeln gewogen. Legen Sie diese Probe in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.
Während Sie in einer Biosicherheitskabine arbeiten, fügen Sie einen Milliliter sterile 0,01 Volumenprozent Polyoxyethylensorbitanmonooleat-wässrige Suspension zu dem Mikroröhrchen hinzu, das den Boden enthält, und wirbeln Sie das Rohr für 30 Sekunden ein. Entfernen und pipettieren Sie 50 Mikroliter des Überstands auf die Mitte der Petriplatten mit CTC-Medium. Verwenden Sie dann einen sterilen Drigalski-Spatel mit einem Durchmesser von sechs Millimetern, um die Suspensionen homogen auf die Oberfläche des Mediums zu verteilen.
Inkubieren Sie die Platten in Klimakammern bei 25 Grad Celsius und mindestens 80% relativer Luftfeuchtigkeit im Dunkeln. Nach sieben, 14 und 21 Tagen Inkubation beobachten Sie die Platten für das Wachstum von Pilzkolonien. Zur Isolierung der Pilze mittels oberflächendesinfizierter Galleria mellonella und Tenebrio molitor Spätstadium Larven als Insektenköder.
Tauchen Sie die Larve für eine Minute zur Sterilisation in 0,5% Natriumhypochlorit. Dann waschen Sie die Larven zweimal mit sterilem Wasser. Montieren Sie die Köder in Plastiktöpfen mit 10 kleinen Löchern von 10 Millimetern Durchmesser im Deckel, die 250 Gramm der gesammelten Erde enthalten.
Homogenisieren Sie den Boden jeden zweiten Tag, um maximalen Kontakt der Larven mit dem Boden zu ermöglichen, und analysieren Sie die Töpfe täglich, um tote Insekten zu suchen. Nachdem Sie tote Insekten aus dem Topf entfernt haben, sterilisieren Sie Insekten oberflächlich mit 0,5% Natriumhypochlorit für eine Minute. Um die Mykose zu begünstigen, legen Sie die sterilen Insekten sieben Tage lang in eine feuchte Kammer bei 80% relativer Luftfeuchtigkeit und 25 Grad Celsius.
Bei Mykose die Konidien von der Insektenoberfläche ernten und mit Hilfe der mikrobiologischen Schleife die Konidien auf Kartoffeldextrose-Agar-Medium, das 0,05% Chloramphenicol oder PDAC-Medium enthält, unter einem stereoskopischen Mikroskop platzieren. Als Alternative legen Sie die gesamte infizierte Larve auf das PDAC-Medium. Und inkubieren Sie die Kulturplatten in einer Klimakammer, wie bereits erläutert.
Identifizieren Sie nach 14 Tagen Inkubation die EPF-Arten, indem Sie die makromorphologischen Eigenschaften der Pilzkulturen auf den Platten analysieren, wie im Manuskript beschrieben. Als nächstes übertragen Sie die Luftkonidien für drei Tage bei 80% relativer Luftfeuchtigkeit und 25 Grad Celsius in Gleitkulturen. Nach drei Tagen färben Sie den Objektträger mit Lactophenolblau, um die mikroskopischen Merkmale zu beobachten.
Beobachten Sie unter einem optischen Mikroskop die Pilzstrukturen wie Anordnung, Konidiophoren, Form und Größe der Konidien beim 400-fachen und bestätigen Sie die EPF-Identifikation. In der Studie wurden 51 EPF-Stämme der Arten Metarhizium und Beaveria aus 524 Bodenproben isoliert. Die repräsentative Analyse zeigt die mikromorphologischen Eigenschaften einiger Isolate von Metarhizium-Arten und Beaveria-Arten.
Das Vorkommen von EPF in den 24 Bodenproben wurde mit drei verschiedenen Methoden der Isolierung untersucht. Galleria mellonella Köder erwiesen sich als effizienter in der Isolierung, gefolgt von Tenebrio Molitor Köder und CTC-Medium. Die gleichen 24 Bodenproben zeigten keine Erholung von Beaveria-Arten, sondern nur Metarhizium.
Die wichtigsten Dinge, an die man sich erinnern sollte, sind die Übertragung der Luftkonidien auf den Objektträger, wobei die Mikroskopmerkmale beobachtet und die Identifizierung entomopathogener Pilze anhand morphologischer Schlüssel bestätigt wird. Weitere Methoden umfassen die Verwendung anderer selektiver künstlicher Medien mit einer bestimmten Chemikalie, um das Wachstum von Verunreinigungen wie Dodin zu reduzieren. Die Suche nach neuen Pilzisolaten mit herausragenden Biokontrolleigenschaften ist entscheidend, um die Wirksamkeit von Pilzen bei der Arthropoden-Schädlingsbekämpfung zu erhöhen und weitere Fragen im Bereich der Pathologie wirbelloser Tiere zu untersuchen.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Isolierung entomopathogener Pilze aus tropischen Böden unter Verwendung von Insektenködern und hebt die Effizienz verschiedener Methoden hervor. Die Isolierung zielt darauf ab, das Verständnis der Pilzvielfalt zu vertiefen und zur Entwicklung von Biopestiziden beizutragen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Entomopathogene Pilze
- Bodenmikrobiologie
- Entwicklung von Biopestiziden
Hintergrund
- Kostengünstige Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze.
- Bedeutung der Untersuchung von Bodenproben für ökologische Studien.
- Verwendung selektiver Medien zur effektiven Isolierung von Pilzen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Pilzen mithilfe von Insektenködern (Galleria mellonella und Tenebrio molitor).
- Verwendung selektiver künstlicher Medien (CTC-Medium, Kartoffel-Dextrose-Agar).
- Mikroskopische Beobachtung zur Identifizierung von Pilzarten.
Hauptergebnisse
- 51 Stämme der Arten Metarhizium und Beauveria, isoliert aus 524 Bodenproben.
- Der Köder Galleria mellonella zeigte die höchste Effizienz bei der Pilzisolation.
- Kein Nachweis von Beauveria-Arten in den getesteten Proben.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert effektiv Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze.
- Die Ergebnisse tragen zur Biocontrol-Forschung und möglichen landwirtschaftlichen Anwendungen bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von entomopathogenen Pilzen aus Bodenproben ist ein grundlegender Schritt bei der Entdeckung von Biopestiziden, wobei die Effizienz der Methode direkten Einfluss auf die Zielvalidierung und die Identifizierung aussichtsreicher Kandidaten hat. Der Vergleich zwischen Insektenködern und selektiven Nährmedien ermöglicht eine Risikominimierung bei der frühen Auswahl antifungaler Wirkstoffkandidaten, indem die Ausbeute bei der Isolierung erhöht und falsch-negative Ergebnisse verringert werden. Dies trägt zu einer besseren Vorhersagbarkeit bei der Auswahl geeigneter Zielstrukturen für Programme zur Bekämpfung von Schädlingsarthropoden bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Pilzvielfalt in Bodenökosystemen, um neuartige Metarhizium- und Beauveria-Stämme mit potenzieller Bioaktivität zu identifizieren.
- Operativer Wert: Insektenköder-Methoden (Galleria mellonella, Tenebrio molitor) weisen eine höhere Isolationsleistung als das CTC-Medium auf und verbessern so den Zugang zu Zielorganismen für die nachfolgende Charakterisierung.
- Translationeller Wert: Die isolierten Stämme unterstützen die mechanistische Risikominimierung, indem sie phänotypische Virulenz durch morphologische und molekulare Identifizierung mit der genetischen Identität verknüpfen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet validierte Pilzisolate für die Entwicklung von Assays, die auf die Pathogenität gegenüber Arthropoden und die Wirtsspezifität abzielen.
- Operativer Wert: Standardisierte Isolationsprotokolle unter Verwendung von Insektenködern verbessern die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Pilzisolierung aus verschiedenen Bodenproben.
- Eignung für Assays: Ermöglicht die Herstellung reiner Kulturen zur Gewinnung von Konidien und zur morphologischen Bestätigung anhand von Objektträgern, wodurch konsistente phänotypische Screening-Eingaben unterstützt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevantes System: Isolierte EPF-Stämme dienen als präklinische Modelle zur Bewertung der Virulenz gegenüber Insektenschädlingen und unterstützen so die Entwicklung von Biocontrol-Produkten.
- Vorhersagegenauigkeit: Die molekulare Identifizierung der Isolate auf Art-Ebene erhöht die Zuverlässigkeit bezüglich des Zielorganismus und unterstützt die Auswahl von Stämmen für Formulierungsstudien.
- Kontinuität: Etablierte Isolierungsverfahren ermöglichen die langfristige Verfolgung des Vorkommens von Pilzen in landwirtschaftlichen Böden und liefern damit Grundlagen für das Management von Resistenzentwicklung und Stammrotation.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Isolationsmethode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen gewonnene EPF-Stämme zur phänotypischen Untersuchung auf Virulenz und Wirtsspezifität weitergeleitet werden, um die Identifizierung von Leitstoffen in Biopestizid-Pipelines zu unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Pilzökologie und Pathogenität, indem EPF aus komplexen Bodenmatrizen gewonnen werden können.
- Screening: Erzeugt standardisierte Pilzpräparationen für Hochdurchsatz-Virulenztests unter Verwendung von Insektenwirten.
- Analytik: Die Ergebnisse der morphologischen und molekularen Identifizierung liefern quantitative und qualitative Daten für den Vergleich und die Auswahl von Stämmen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Umweltisolierung mit der präklinischen Evaluierung über konservierte Virulenzmechanismen bei Metarhizium und Beauveria.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Isolierprotokoll unter Verwendung von Insektenködern kann über verschiedene Standorte und Bodentypen hinweg standardisiert werden, wodurch eine skalierbare Lagerung von Pilzstämmen für zukünftige Screening-Kampagnen ermöglicht wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Zielvielfalt und verringert die mechanistische Unschärfe bei der Auswahl von Wirkstoffen für die Entwicklung von Biopestiziden.
- Operativer Wert: Insektenködermethoden bieten eine höhere Ausbeute und geringere technische Variabilität als selektive Medien und verbessern so die Erfolgsraten bei der Isolierung.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Entscheidungen über die Weiterentwicklung von Stämmen, indem der Zugang zu virulenten Isolaten aus Umweltproben verbessert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem der Pool charakterisierter EPF-Stämme mit bestätigter Morphologie und Identität erweitert wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Insekten, in der Pilzmorphologie sowie in aseptischen Techniken für die Köderpräparation und die Ernte von Konidien.
- Benötigt klimakontrollierte Inkubationskammern, die 25 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit für das Pilzwachstum und die Induktion der Mykose aufrechterhalten.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen erfordert eine einheitliche Sterilisation der Köder, Homogenisierung des Bodens und festgelegte Zeitabläufe für die Verarbeitung nach der Mykose.
- Die Anpassung an verschiedene Bodentypen kann Anpassungen der Expositionszeit der Köder und des Bodenvolumens in Abhängigkeit von der lokalen Prävalenz entomopathogener Pilze erforderlich machen.
- Zu den Einschränkungen gehören die Abhängigkeit von der Lebensfähigkeit der Larven sowie Umweltbedingungen, die den Erfolg der Mykose beeinflussen, wie im Protokoll durch die Verwendung feuchter Kammern und Oberflächensterilisationsschritte beschrieben.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
Soil Sampling and Isolation Methods for Entomopathogenic Fungi (EPF)
4:29
Identification of Entomopathogenic Fungi (EPF): Metarhizium and Beauveria Species
5:21
Results: Micromorphological Characteristics and Occurrence of Entomopathogenic Fungi in Various Soil Samples
6:16
Conclusion
