Name: Erzeugung und Erweiterung primärer, maligner pleuraler Mesotheliom-Tumorlinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung und Erweiterung primärer maligner pleuraler Mesotheliom-Tumorlinien aus Patientengewebe. Diese Methode reduziert Fibroblastenkontamination und ermöglicht Studien zu Tumor-Immun-Interaktionen.

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Wir möchten Raquel Laza-Briviesca für ihren Beitrag zum Start dieses Protokolls und Dr. Boris Sepesi, Dr. Reza Mehran und Dr. David Rice für die Zusammenarbeit bei der Gewebeentnahme danken. Es gibt keine zusätzlichen Mittel, die mit dieser Arbeit verbunden sind.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institution Review Board (IRB) des MD Anderson Cancer Center der University of Texas genehmigt. Dies betrifft Standard-of-Care, chirurgisch resezierte MPM-Tumoren, die nach Einverständniserklärung entfernt wurden.
1. Aufbereitung von Tumorverdauungsmedien und anderen zugehörigen Medien
<ol><li>Um Tumorverdauungsmedien vorzubereiten, fügen Sie 5 ml 100% Pen / Streptokokken (Penicillin / Streptomycin) zu 500 ml sterilem Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.<ol>
<li>Überführen Sie das Medium zu einem 500 ml, 0,22 μm Polyethersulfon (PES) Sterilfilter für die Vakuumfiltration. HINWEIS: Filtrations- und Ansaugschritte sollten mit einem Standard-Vakuumdruck von 75-150 Torr durchgeführt werden.</li>
		<li>Beschriften und datieren Sie das Tumorverdauungsmedium und lagern Sie es bei 4 °C. HINWEIS: Das Medium kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um den tumorverdauenden enzymatischen Cocktail vorzubereiten, fügen Sie 2,5 ml 3% Kollagenase Typ 1, 1 ml 1,5 mg / ml Hyaluronidase, 20 μL 250.000 Einheiten / ml DNA 1 bis 16,5 ml Verdauungsmedium in einem konischen 50 ml Schlauch in einer laminaren Durchflusshaube hinzu. HINWEIS: Das Gesamtvolumen des tumorverdauenden enzymatischen Cocktails beträgt 20 ml; pro Tumorprobe werden jedoch nur 10 ml benötigt. So kann der restliche Cocktail bei -20 °C gelagert werden, bis er benötigt wird. Aliquots nicht wieder einfrieren.</li>
	<li>Um das vollständige Tumormedium herzustellen, fügen Sie 5 ml 100% Pen / Streptokokken und 50 ml fetales Rinderserum (FBS) zu 500 ml sterilem RPMI 1640 in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.<ol>
<li>Überführen Sie das Medium auf einen 500 mL, 0,22 μm PES Sterilfilter für die Vakuumfiltration.</li>
		<li>Beschriften und datieren Sie das komplette Tumormedium und lagern Sie es bei 4 °C. HINWEIS: Das Medium kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um serumreduziertes Medium für den Hungertod vorzubereiten, fügen Sie 5 ml 100% Pen/Streptokokken und 5 ml FBS zu 500 ml sterilem RPMI 1640 in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.<ol>
<li>Überführen Sie das Medium auf einen 500 mL, 0,22 μm PES Sterilfilter für die Vakuumfiltration.</li>
		<li>Das serreduzierte Medium etikettieren, datieren und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Das Medium kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Herstellung des Gefriermediums fügen Sie 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 45 ml FBS in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.<ol>
<li>Übertragen Sie das Medium auf einen 50 mL, 0,22 μm PES Sterilfilter für die Vakuumfiltration.</li>
		<li>Etikettieren und datieren fünf 15 ml konische Röhrchen.</li>
		<li>Übertragen Sie 10 ml Gefriermedium auf jedes Rohr und lagern Sie die Röhrchen bei -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um antibiotikafreies Medium für Mykoplasmentests vorzubereiten, fügen Sie 50 ml FBS zu 500 ml sterilem RPMI 1640 in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.<ol>
<li>Übertragen Sie das Medium auf einen 50 mL, 0,22 μm PES Sterilfilter für die Vakuumfiltration.</li>
		<li>Kennzeichnen und datieren Sie das antibiotikafreie Medium und lagern Sie es bei 4 °C. HINWEIS: Das Medium kann 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um den Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierpuffer (FACS) für die phänotypische Analyse vorzubereiten, fügen Sie 16,6 ml steriles Rinderserumalbumin zu 500 ml steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Laminar-Flow-Haube hinzu.<ol>
<li>Beschriften und datieren Sie den FACS-Puffer und lagern Sie ihn bei 4 °C. HINWEIS: Der FACS-Puffer erfordert keine Filtersterilisation, solange beide Komponenten steril gelagert werden. Der FACS-Puffer kann vor dem Öffnen 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Verdauung von Tumorgewebe
<ol><li>Übertragen Sie 10 ml tumorverdauenden enzymatischen Cocktail von Schritt 1.2 in einen Dissoziationsschlauch.</li>
	<li>Übertragen Sie das Stück Tumorgewebe mit einem sterilen Skalpell auf einen sterilen 6-Well-Plattendeckel. HINWEIS: Die Menge an Medium, die mit dem Tumorgewebe übertragen wird, ist für die Verarbeitung ausreichend.<ol>
<li>Entfernen Sie alles Fettgewebe, nekrotisches Gewebe und / oder Blutgerinnsel mit einem neuen sterilen Skalpell und einer neuen Pinzette. HINWEIS: Fettgewebe ist normalerweise gelblich im Aussehen und halbfest. Nekrotisches Gewebe ist dunkler als das umgebende Gewebe im Aussehen und sehr weich; Sowohl Fett- als auch nekrotisches Gewebe brechen leicht auseinander. Blutiges Gewebe erscheint leuchtend rot und kann bei Manipulation Blut in das Medium abgeben. Nach der Entfernung sollte das resultierende Tumorgewebe je nach Gewebetyp Form behalten und blass oder rosa sein.</li>
		<li>Schneiden Sie das gesamte Tumorgewebe in 1 mm3 kleine Fragmente. Um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet, fügen Sie dem Tumorgewebe 500 μL sterile 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) hinzu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tumorfragmente in den Dissoziationsschlauch mit 10 ml tumorverdauendem enzymatischem Cocktail überführen (Schritt 2.1). Schließen Sie den Schlauch fest, legen Sie ihn mit der Kappe nach unten auf den Gewebedissoziator und fügen Sie den Heizapparat hinzu, indem Sie ihn wie eine Hülse über den Dissoziationsschlauch auftragen und drücken, um ihn an Ort und Stelle zu klicken. HINWEIS: Die maximale Kapazität für jede Röhre beträgt 4 g Tumor und 10 ml Volumen.</li>
	<li>Wählen Sie die vorprogrammierte Einstellung auf der Dissoziator-37C_h_TDK_1 aus. Überprüfen Sie den Status nach 10 Minuten, um sicherzustellen, dass kein Verstopfungsfehler vorliegt, wie durch das blinkende rote Licht angezeigt. HINWEIS: Dieses Programm arbeitet bei 1.865 U / min für 1 h bei eingeschalteter Temperatur bei 37 ° C. HINWEIS: Wenn eine Verstopfung auftritt, entfernen Sie den Dissoziationsschlauch und schwenken Sie ihn manuell, um das im Deckel gefangene Gewebe zu entfernen. Ersetzen Sie dann die Röhre auf dem Dissoziator und setzen Sie das Programm fort.</li>
	<li>Nach dem 1 h Aufschluss das Dissoziationsrohr entfernen und in eine Laminar-Flow-Haube legen. Filtern Sie den verdauten Tumor, indem Sie ein 70 μm Zellsieb auf ein 50 ml konisches Rohr legen und den verdauten Tumor mit einer 10 ml Pipette auf den Filter pipettieren. Wenn der Filter verstopft, wechseln Sie zu einem neuen Filter.<ol>
<li>Spülen Sie das Dissoziationsröhrchen mit 10 ml frischen Tumoraufschlussmedien aus und führen Sie die Wäsche durch den Filter.</li>
		<li>Entfernen Sie den 70-μm-Filter und entsorgen Sie ihn.</li>
		<li>Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 40 ml mit Tumorverdauungsmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Mit einer 2 ml Ansaugpipette, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml sterilem vollständigem Tumormedium.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.6.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand wie in Schritt 2.7 beschrieben ab. Suspendieren Sie die Zellen in 3 ml sterilem vollständigem Tumormedium und übertragen Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung einer sterilen 6-Well-Platte.</li>
	<li>Halten Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.</li>
	<li>Nach 24 h das verwendete Medium aus dem verdauten Tumor in Brunnen 1 in einen neuen Brunnen (Brunnen 2) in derselben 6-Well-Platte übertragen. Fügen Sie 3 ml steriles vollständiges Tumormedium zu Brunnen 1 hinzu.</li>
	<li>Das verwendete Medium aus den Vertiefungen 1 und 2 übertragen und nach Schritt 2.11 24 h in der gleichen 6-Well-Platte zu Welle 3 kombinieren. Fügen Sie 3 ml steriles vollständiges Tumormedium in die Vertiefungen 1 und 2 hinzu.</li>
	<li>Das Medium aus allen 3 Vertiefungen absaugen und 3 ml vollständiges Tumormedium nach Schritt 2.12 48 h in jede Vertiefung pipettieren.</li>
</ol>3. Generierung der primären Tumorzelllinie
<ol><li>Bestimmen Sie mit einem Inverted-Phase-Mikroskop den Prozentsatz der Fibroblastenkontamination in der frühen Passagekultur. HINWEIS: Fibroblasten sind im Allgemeinen lang und unregelmäßig und haben eine schlecht definierte Zellmembran. Sie erscheinen dünn oder flach auf einer Z-Skala.<ol>
<li>Wenn die Fibroblastenkontamination größer als 20% der Zellen in der frühen Passagekultur ist, kultivieren Sie weiter, nachdem Sie das vollständige Medium durch ein reduziertes Serummedium ersetzt haben.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Ersatz mit reduziertem Serummedium in Schritt 3.1.1 zweimal pro Woche für 3-4 Wochen.</li>
		<li>Wenn die Kultur eine Konfluenz von 80% erreicht, passieren Sie die Zellen, indem Sie 50: 50 in 2 neue Vertiefungen einer 6-Well-Platte aufteilen. Fahren Sie mit 50:50 in reduzierten Serummedien fort, sobald die Zellen eine Konfluenz von 80% erreicht haben.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.1.3 bis zu 4 Wochen lang und gehen Sie bei Bedarf in größeren Kulturkolben durch, indem Sie 50:50 aufteilen, sobald die Kultur 80% Konfluenz erreicht hat. Wenn die Fibroblastenpopulation nicht auf 10% oder weniger reduziert ist, fahren Sie mit Schritt 3.2 fort, um die differentielle Trypsinisierungsmethode zur Entfernung der Fibroblastenkontamination zu versuchen. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 3.3 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um Tumorzellen anzureichern, spülen Sie den Brunnen vorsichtig mit 1x PBS ab, um das serumhaltige Medium zu entfernen.<ol>
<li>Fügen Sie Trypsin wie folgt hinzu: 1 ml pro Well, wenn Sie sich in einer 6-Well-Platte befinden, 2 mL für einen T25-Kolben, 3 mL für einen T75-Kolben.</li>
		<li>Legen Sie die 6-Well-Platte oder den Kolben für 1 min in einen Inkubator bei 37 °C. Entfernen Sie die Platte oder den Kolben aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Wenn sich die Zellen teilweise heben oder schweben, entfernen Sie vorsichtig die suspendierten Zellen und nur Trypsin. Legen Sie die Zellen in eine 15 ml konische Röhre, die ein gleiches oder größeres Volumen an vollständigem Tumormedium enthält. HINWEIS: Diese partielle Sammlung von Zellen, die auf Adhäsionseigenschaften basiert, ist die erste von mehreren Fraktionen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 und 3.2.2, bis alle Zellen angehoben sind oder 4 Fraktionen entfernt wurden.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie alle unabhängigen Fraktionen bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand wie in Schritt 2.7 beschrieben und resuspendieren Sie die Zellen mit 5 ml sterilem, serumreduziertem Medium.</li>
		<li>Die Zellen werden für jede Fraktion in einem T25-Kolben beschichtet und die Kolben bei 37 °C in einen Inkubator gegeben.</li>
		<li>Beurteilen Sie die Kultur nach 48 h, um festzustellen, welche Fraktion für Tumorzellen im Vergleich zu Fibroblasten angereichert ist. Entsorgen Sie fibroblastenreiche Kolben. Wenn die Fibroblastenkontamination <10% beträgt, setzen Sie die Expansion im gesamten Tumormedium fort und fahren Sie mit Schritt 4 fort. Wenn die Fibroblastenkontamination 10-30% beträgt, wiederholen Sie die Schritte 3.1.2-3.1.4. Wenn die Fibroblastenkontamination größer als 30% ist, wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.2.7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn in der frühen Passagekultur nur wenige oder keine Fibroblasten nachgewiesen werden, setzen Sie die Passage der Zellen im vollständigen Tumormedium fort, indem Sie 50:50 spalten, sobald die Zellen zu 80% in ihrer 6-Well-Platte oder ihrem Kolben zusammenfließen.</li>
</ol>4. Erweiterung der primären Tumorzelllinie der frühen Passage
<ol><li>Sobald die primäre Tumorkultur 10% oder weniger der Fibroblastenkontamination enthält, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es zweimal pro Woche durch steriles vollständiges Tumormedium. HINWEIS: Das optimale mittlere Volumen für einen T25 beträgt 5 ml; T75 ist 12 ml; T150 ist 25 ml.<ol>
<li>Passage der Kultur 50:50 in größere Flaschen nach Bedarf, sobald sie 80% Konfluenz in der Platte oder Flasche erreicht hat. HINWEIS: Die Kultur muss je nach Wachstum möglicherweise mit einem höheren Verhältnis verabschiedet werden. Passen Sie an, dass die Kultur alle 3-5 Tage eine 80% ige Konfluenz erreicht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passage bis die Kultur in Passage 4 oder höher ist. Sobald die Kultur zu 80% in mindestens zwei T75-Kolben konfluent ist, fahren Sie mit Schritt 5 fort.</li>
</ol>5. Charakterisierung und Banking etablierter primärer Tumorzelllinie
<ol><li>Kryokonservieren Sie einen T75-Kolben als frühes Durchgangsgefrieren. Für Mykoplasmentests der verbleibenden T75-Kolben fahren Sie mit Schritt 5.2 fort.<ol>
<li>Zur Kryokonservierung von Zellen mit früher Passage wird 1 Röhrchen alizitiertes Gefriermedium aufgetaut, das in Schritt 1.5 hergestellt wurde.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen durch Trypsinisierung, indem Sie zuerst die Platte mit 1x PBS waschen, wie in Schritt 3.2 beschrieben, und Trypsin hinzufügen, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben.</li>
		<li>Stellen Sie den Kolben für 3 min in einen Inkubator bei 37 °C. Entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Wenn sich die Zellen heben oder schweben, entfernen Sie vorsichtig die suspendierten Zellen und das Trypsin. Legen Sie die Zellen in eine 15 ml konische Röhre, die ein gleiches oder größeres Volumen an vollständigem Tumormedium enthält. HINWEIS: Wenn die Zellen nach 3 min haften, legen Sie den Kolben für weitere 2 Minuten zurück in den Inkubator.</li>
		<li>Mischen Sie das Röhrchen gut durch vorsichtiges Pipettieren und entfernen Sie 20 μL zum Zählen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Während sich die Zellen drehen, zählen Sie mit einem laborspezifischen Zählprotokoll wie Trypanblau oder Acridin Orange / Propidiumiodid (AO / PI).</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Zellen nach der Zentrifugation in Gefriermedium mit mindestens 2 × 106 Zellen/1 ml Gefriermedium.</li>
		<li>Übertragen Sie 1 ml der Zellsuspension von Schritt 5.1.7 auf vormarkierte 1,5 ml Kryoviale.</li>
		<li>Legen Sie die Kryoviale in eine Gefrierkammer mit kontrollierter Rate und übertragen Sie sie sofort auf -80 °C.</li>
		<li>Lagern Sie die Zellen bis zu 1 Woche bei -80 °C, bevor sie zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Teilen Sie einen T75-Kolben 50:50 für Mykoplasmentests. Wechseln Sie das Medium in ein antibiotikafreies Medium, das in Schritt 1.6 hergestellt wurde.<ol>
<li>Nach 72 h tauen Sie das Mykoplasmen-Detektionsreagenz, das Substrat und die Kontrollen vor dem Test 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf.</li>
		<li>Sammeln Sie 1 ml des zu testenden Überstands aus jeder zu testenden Kultur und legen Sie ihn in ein 15 ml konisches Rohr.</li>
		<li>Pelletieren Sie alle suspendierten Zellen, indem Sie den Überstand bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.</li>
		<li>Laden Sie 100 μL Probenüberstände und Kontrollen in eine weiße 96-Well-Platte. 100 μL Mykoplasmen-Detektionsreagenz zu jeder Probe und Kontrolle hinzufügen.</li>
		<li>5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Legen Sie die Platte in einen Plattenleser und lesen Sie die Lumineszenz ab (Lesen A, d.h. erste Lesung). HINWEIS: Das Protokoll des Herstellers des Mykoplasmen-Kits gibt an, dass die Standardeinstellungen der multifunktionalen Plattenleser beibehalten werden. Der Messwert wird am Lumineszenzendpunkt mit einer Integrationszeit von 1 s und einer Verstärkung von 135 festgelegt. Der Plattenleser verwendet eine Auto-Scale-Routine, um das Verstärkungssignal für jedes Experiment zu optimieren. Die Integrationszeit von 1 s ist Standardstandard. Beide Einstellungen dienen zur Einstellung der Intensität des vom Plattenleser interpretierten Leuchtsignals und müssen je nach Plattenleser ggf. angepasst werden.</li>
		<li>Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenleser und fügen Sie jeder Probe und den Kontrollen 100 μL des Mykoplasmen-Detektionssubstrats hinzu.</li>
		<li>10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Legen Sie die Platte in den Plattenleser und lesen Sie die Lumineszenz ab (Lesung B, d.h. zweite Lesung).</li>
		<li>Um die Mykoplasmen-Positivität zu bestimmen, bestimmen Sie das Verhältnis von Lesen B zu Lesen A. HINWEIS: Mykoplasmen-Positivitätsverhältnisse sind im Protokoll des Herstellers des Mykoplasmen-Kits beschrieben. Die Messwerte A und B werden mit den gleichen Einstellungen erfasst und spiegeln einfach die Lesereihenfolge wider.<ol>
<li>Betrachten Sie ein Verhältnis < 1 als Mykoplasmen-negativ.</li>
			<li>Betrachten Sie ein Verhältnis von 1-1,2 als nicht schlüssig und wiederholen Sie Schritt 5.2.</li>
			<li>Betrachten Sie ein Verhältnis > 1,2 als Mykoplasma-positiv und überwachen Sie diese Kultur; Beenden Sie die Kultur bei Bedarf.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Durchflusszytometrie-Charakterisierung von Mykoplasmen-negativen Tumorzellen<ol>
<li>Lösen Sie die Tumorzellen mit Hilfe des Zelldissoziationspuffers.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen und suspendieren Sie die Zellen bei 1 × 106/ml im FACS-Puffer aus Schritt 1.7.</li>
		<li>Entfernen Sie 100 μL Zellsuspension in einzelne Röhrchen zur Oberflächenfärbung.</li>
		<li>Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand und blockieren Sie Fc-Rezeptoren, indem Sie die Zellen in 500 μL 5% Ziegenserum im FACS-Puffer bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 2 ml FACS-Puffer hinzu und zentrifieren Sie die Suspension bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie die Oberflächenfleckenmischung aus Antikörpern (Tabelle 1) und FACS-Puffer hinzu, so dass das endgültige Volumen 100 μL beträgt. Bedecken Sie die Proben und färben Sie sie 30 min lang auf Eis.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 5.3.6.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand und fixieren Sie die Zellen, indem Sie in 200 μL 1% Paraformaldehyd (PFA) plus 0,25% EtOH resuspendieren. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten mit den Proben vor Licht geschützt.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 5.3.6. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL FACS-Puffer zur Erfassung mit einem geeigneten Durchflusszytometer. HINWEIS: Es wird erwartet, dass Mesotheliom-Tumorzellen positiv für Mesothelin und N-Cadherin sind. Einige können auch CD90 ausdrücken.</li>
	</ol></li>
	<li>Erweitern Sie in vollständiges Tumormedium und Bank, wie in den Schritten 4.1 bzw. 5.1 beschrieben.</li>
</ol>

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</ol>

CH ist Mitglied des SAB für Briacell Therapeutics und der Mesothelioma Applied Research Foundation. Alle anderen Autoren haben nichts offenzulegen.

Während dieses Protokoll einfach ist, gibt es ein paar kritische Schritte, die genau befolgt werden müssen. Das Einfrieren der frühen Passage ist wichtig, um die Fähigkeit zu erhalten, den Tumorzellanreicherungsprozess zu wiederholen, wenn er zunächst nicht erfolgreich ist. Die Fähigkeit, die fibroblastische Kontamination mit dem Auge zu beurteilen, um die richtige Spaltungs- und Medienhungertechnik zu bestimmen, ist entscheidend für die Verhinderung von Fibroblastenüberwucherung in der Kultur. Darüber hinaus erfordert d...

Das maligne Pleuramesotheliom (MPM) ist ein seltener Tumor, der stark mit Asbestexposition assoziiert ist. Obwohl immuntherapiebasierte Ansätze ermutigende Ergebnisse gezeigt haben, gibt es einen Mangel an Behandlungsmöglichkeiten für Patienten, die diese Krankheit entwickeln, und die Gesamtüberlebensrate von 5 Jahren ist niedrig 1,2. An mehreren Institutionen werden Anstrengungen unternommen, um diese Krankheit besser zu verstehen und neue therapeutische Ziele zu identifizieren, die die Patientenergebnisse verbessern können. Während es mehrere Mesotheliom-Mausmodelle gibt, ist der Zugang zu primären Mesotheliom-Tumorzellen begrenzter3. Die In-vitro-Expansion primärer Mesotheliom-Tumorzellen würde ein wertvolles Modellsystem liefern, mit dem Tumorzellen und ihre Interaktion mit autologen Immunzellen wie tumorinfiltrierenden Lymphozyten direkt untersucht werden können. Während es Berichte über die Expansion der primären Mesotheliom-Tumorzelllinien gibt, sind diese wenige und bieten keine detaillierte Standard-Operationsmethode (SOP). Darüber hinaus sind nur wenige Zelllinien aus kommerziellen Quellen wie der American Type Culture Collection (ATCC) verfügbar. Während die Verfügbarkeit von primären Tumorlinien begrenzt ist, wurde gezeigt, dass Tumorzellen aus Pleuraergüssen und direkt aus dem Tumorgewebe erweitert werden können 4,5. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass erweiterte Tumorzelllinien das molekulare Profil des ursprünglichen Tumors 4,5,6 erhalten.
Unser Labor untersucht die tumorimmune Mikroumgebung von MPM und hat eine Methode zur Erweiterung primärer MPM-Tumorzelllinien aus chirurgisch resezierten Fällen entwickelt. Diese Methode basiert auf unseren Erfahrungen bei der Etablierung primärer metastasierender Melanom-Tumorzelllinien. Ziel dieser Arbeit ist es, einen detaillierten, praktischen Ansatz für die Erweiterung der primären Mesotheliom-Tumorlinie unter Verwendung eines 2D-Modellsystems und anschließender phänotypischer Profilierung zu bieten. Angesichts des jüngsten Erfolgs von Checkpoint-Blockadestrategien, die auf CTLA4 und PD-1 in der Erstlinieneinstellungabzielen 2, könnte die Fähigkeit, viele primäre Tumorlinien zu erzeugen, das Verständnis sowohl der intrinsischen Resistenzmechanismen des Tumors fördern als auch ein wichtiges Modellsystem zur Beurteilung der T-Zell-Erkennung bereitstellen und so unser Verständnis der Immunantwort bei MPM vertiefen.
Die Haupteinschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass jeder Tumor eine andere Mikroumgebung enthält und ein hohes Maß an Variabilität des Expansionserfolgs besteht. Darüber hinaus selektiert diese Methode nach Tumorzellen, die sich in einem 2D-Kultursystem ausdehnen können. Andere Methoden, die die Herstellung einer 3D-Sphäroid- oder Organoidkultur beinhalten, könnten einen alternativen Ansatz bieten, der eine höhere Erfolgsrate der Expansion ermöglichen oder dazu führen kann, dass Zelllinien abgeleitet werden können, die sich in einem traditionellen 2D-System nicht ausdehnen können. Solche 3D-Kulturen haben sich als nützlich für die Erzeugung von Tumorarten erwiesen, die schwer zu erweitern sind, zum Beispiel Bauchspeicheldrüsenkrebs7.

<table><tbody><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Aspirationspipetten</td><td>BD Falcon</td><td>357558</td> serologische Pipetten BD Falcon 357543 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>50</td></tr><tr><td>mL konische Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Mikrotiterplatten, Gewebekultur behandeltes</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Ein Protease-Kollagenase-Gemisch, das als wirksamer bei der Konservierung von Epitopen für die Durchflusszytometrie gilt.</td></tr><tr><td>anti-CD325 (N-Cadherin) PE</td><td>Invitrogen</td><td>12-3259-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD90 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>561558</td><td></td></tr><tr><td>anti-Mesothelin APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-118-096</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin 30%</td><td>Sigma</td><td>A8577-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zelldissoziationspuffer, enzymfrei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Cell Sieb (70 & Mikro; m)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge mit 15 mL und 50 mL Adaptern</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>1,5 g Kollagenase Typ I in 100 mL steriles DMEM auflösen und in 5 mL Volumen aliquotieren. Gut etikettieren und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Gefrierkammer mit kontrollierter Rate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-350-50</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>CulturPlate-96</td><td>Packard Instrument Company</td><td>6005680 Weiße</td><td>, undurchsichtige 96-Well-Mikroplatte.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>Aliquot bei 50 μ; L, gut etikettieren und bei -20 °C lagern. Nach dem Auftauen bei 4 Grad halten; C für bis zu 1 Monat.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tubes-Filter top</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C-Tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Okto-Dissoziator mit Heizgerät</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td>Enthält spezielle Heizgerätehülsen, die zum Ausüben von Wärme auf die C-Rohre während der Dissokation verwendet werden.</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Aliquot und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Lösung, 500 mL</td><td>Corning</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>0,15 g Hyaluronidase in 100 mlL sterilem DMEM auflösen und in 1,0 mL Aliquots verteilen. Gut etikettieren und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Inversphasenmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lebender/toter gelber Farbstoff</td><td>Life Technologies</td><td>L-34968</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen, 20 & Mikro; L</td><td>ART</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettor, 0,5-20 & Mikro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycoalert Assay-Kontrollset</td><td>Lonza</td><td>LT07-518</td><td>Aliquot-Positivkontrollen und Lagerung bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Mycoalert Plus Mykoplasmen-Detektionskit</td><td>Lonza</td><td>LT07-710</td><td>Aliquot Reagenz und Substrat und Lagerung bei -20 °C. Bewahren Sie den restlichen Puffer und das Aliquot für die Negativkontrolle auf und lagern Sie es bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>15710</td><td>Präparation des Stoffes durch Filtrieren durch einen PVDF-Spritzenfilter (Millex Kat.-Nr. SLVV033RS) und aliquot unter einem Abzug. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 10.000 U/ml</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierhilfe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser mit Lumineszenzfähigkeit</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>Jedes Plattenlesegerät mit diesen Spezifikationen kann verwendet werden</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medien Corning</td><td></td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Andwin</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP steriles Vakuumfiltrationssystem, 0,22 &Mikro; m PES Express PLUS, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Filter, 0,22 & Mikro; m PES Express PLUS, 50 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>sterile Pinzette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolben, mit Gewebekulturen behandelt</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben, mit Gewebekulturen behandelt</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblaue Lösung 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0,05 % </td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI) Lösung</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-5ML</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung und erweiterung primärer, maligner pleuraler mesotheliom-tumorlinien

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Aktuelle Methoden zur Erweiterung primärer Tumorzelllinien aus seltenen Tumorarten fehlen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Erweiterung primärer Tumorzellen aus chirurgisch reseziertem, malignem Pleuramesotheliom (MPM), indem es einen vollständigen Überblick über den Prozess von der Verdauung bis zur Anreicherung, Expansion, Kryokonservierung und phänotypischen Charakterisierung bietet. Darüber hinaus stellt dieses Protokoll Konzepte für die Tumorgenerierung vor, die für mehrere Tumorarten nützlich sein können, wie z. B. die differentielle Trypsinisierung und den Einfluss von Dissoziationsmethoden auf den Nachweis von Zelloberflächenmarkern für die phänotypische Charakterisierung. Die Haupteinschränkung dieser Studie ist die Auswahl von Tumorzellen, die sich in einem zweidimensionalen (2D) Kultursystem ausdehnen. Variationen dieses Protokolls, einschließlich dreidimensionaler (3D) Kultursysteme, Medienergänzungen, Plattenbeschichtung zur Verbesserung der Haftung und alternativer Disaggregationsmethoden, könnten diese Technik und die Gesamterfolgsrate bei der Etablierung einer Tumorlinie verbessern. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Basismethode zur Etablierung und Charakterisierung von Tumorzellen aus diesem seltenen Tumor.

Um die Fibroblastenkontamination von frühen Passagekulturen zu bestimmen, werden Zellen mit einem Inverted-Phase-Mikroskop bewertet, um die Häufigkeit von Fibroblasten im Verhältnis zu den anderen vorhandenen adhärenten Zellen zu identifizieren. Abbildung 1 zeigt Beispiele für eine zunehmende Fibroblastenkontamination von 80% (Abbildung 1A), 50% (Abbildung 1B) und 30% (Abbildung 1C) im Vergleich zu einer Kultur ohne Fibroblastenkontamination (<strong class="xfig...

Das Ziel dieser Methodenarbeit ist es, eine robuste und reproduzierbare Methodik für die Anreicherung, Erzeugung und Expansion von primären Tumorzelllinien aus chirurgisch resezierten Pleuramesotheliomen zu demonstrieren.

Erzeugung und Erweiterung primärer, maligner pleuraler Mesotheliom-Tumorlinien

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Dieses Protokoll bietet eine Grundlage für die Tumorzellexpansion, die wiederum eine eingehende Untersuchung der Tumorzellfunktion und der genomischen Zustände ermöglicht. Darüber hinaus bietet es ein In-vitro-Modellsystem, um den Einfluss des Tumors auf die Immunantwort zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein basiertes Protokoll zur Etablierung mesothelartiger Tumorlinien aus Patientengewebe bietet.Es gibt derzeit kein standardisiertes Protokoll für dieses Modellsystem. Der schwierigste Aspekt dieser Technik ist das Vorhandensein einer Fibroblastenkontamination in frühen Passagekulturen. Es ist wichtig, ein solides Verständnis von Fibroblasten im Vergleich zur Tumorzellmorphologie zu haben, um festzustellen, ob Fibroblasten-Hungerversuche funktionieren.Beginnen Sie damit, 10 Milliliter tumorverdauenden enzymatischen Cocktail in einen Dissoziationsschlauch zu übertragen. Übertragen Sie das Stück Tumorgewebe mit einem sterilen Skalpell auf einen sterilen Deckel mit sechs Bohrlöchern. Entfernen Sie alle fetten nekrotischen Gewebe und Blutgerinnsel mit einem neuen sterilen Skalpell und einer neuen Pinzette.Schneiden Sie das gesamte Tumorgewebe in einen Kubikmillimeter kleine Fragmente. Um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet, fügen Sie dem Tumorgewebe 500 Mikroliter sterile Hank's Balanced Salt-Lösung (HBSS) hinzu. Übertragen Sie Tumorfragmente in den Dissoziationsschlauch, der 10 Milliliter tumorverdauenden enzymatischen Cocktail enthält.Schließen Sie das Rohr fest. Legen Sie die Kappe mit der Kappe nach unten auf den Gewebedissoziator und versorgen Sie den Dissoziator mit Wärme. Wählen Sie die vorprogrammierte Einstellung am Dissoziator auf die 37 Grad Celsius menschliche Tumordissoziationskit-Einstellung 1 und überprüfen Sie den Status nach 10 Minuten, um sicherzustellen, dass kein Verstopfungsfehler durch das blinkende rote Licht angezeigt wird.Entfernen Sie nach einer Stunde das Dissoziationsrohr und legen Sie es in eine Laminar-Flow-Haube. Filtern Sie den verdauten Tumor, indem Sie ein 70-Mikrometer-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Konusröhrchen legen und den verdauten Tumor mit einer 10-Milliliter-Pipette auf den Filter pipettieren. Wenn der Filter verstopft, wechseln Sie zu einem neuen Filter.Spülen Sie den Dissoziationsschlauch mit 10 Millilitern frischen Tumoraufschlussmedien aus und waschen Sie ihn durch den Filter. Entfernen und verwerfen Sie den Filter. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit dem Tumorverdauungsmedium auf 40 Milliliter.Bei 500 x g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Mit einer zwei Milliliter Ansaugpipette, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören, und suspendieren Sie die Zellen mit 10 Millilitern sterilem Tumormedium. Dann zentrigieren Sie die Röhrchen und aspirieren Sie den Überstand wie gezeigt.Als nächstes suspendieren Sie die Zellen in drei Millilitern sterilem Tumormedium und übertragen die Zellsuspension in eine Vertiefung einer sterilen Sechs-Well-Platte. Halten Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 Grad mit 5% Kohlendioxid. Nach 24 Stunden das verwendete Medium aus dem verdauten Tumor in Brunnen eins in einen neuen Brunnen in derselben Sechs-Well-Platte überführen und dann drei Milliliter steriles Tumormedium zu Well One hinzufügen.Bestimmen Sie mit einem Inverted-Phase-Mikroskop den Prozentsatz der Fibroblastenkontamination in der frühen Passagekultur. Wenn die Fibroblastenkontamination mehr als 20% der Zellen in der frühen Passagekultur beträgt, kultivieren Sie weiter, nachdem Sie das Tumormedium durch das reduzierte Serummedium ersetzt haben. Wenn die Fibroblastenpopulation nicht auf 10% oder weniger reduziert ist, spülen Sie den Brunnen vorsichtig mit PBS ab, um das serumhaltige Medium zu entfernen.Fügen Sie einen Milliliter Trypsin pro Vertiefung in eine Platte mit sechs Vertiefungen hinzu. Legen Sie die Platte oder den Kolben mit sechs Vertiefungen für eine Minute in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die Platte oder den Kolben aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen mit einem inversen Mikroskop.Wenn sich die Zellen teilweise heben oder schweben, entfernen Sie vorsichtig die suspendierten Zellen und nur Trypsin. Legen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter konische Röhre, die ein gleiches oder größeres Volumen an vollständigem Tumormedium enthält. Wiederholen Sie das Trypsinisieren, bis drei bis vier Brüche entfernt sind.Alle unabhängigen Fraktionen bei 500 x g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren. Mit einer zwei Milliliter Ansaugpipette, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern sterilem reduziertem Serummedium.Beschichten Sie die Zellen in einem T-25-Kolben für jede Fraktion und legen Sie die Kolben in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Zur Kryokonservierung von Zellen der frühen Passage tauen Sie ein Röhrchen alizitiertes Gefriermedium auf. Sammeln Sie die Zellen durch Trypsinisierung, indem Sie zuerst die Platte mit PBS waschen und Trypsin hinzufügen, wie zuvor gezeigt.Stellen Sie den Kolben für drei Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Wenn sich die Zellen heben oder schweben, entfernen Sie vorsichtig die suspendierten Zellen und das Trypsin.Legen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter konische Röhre, die ein gleiches oder größeres Volumen an vollständigem Tumormedium enthält. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens durch vorsichtiges Pipettieren. Entfernen Sie 20 Mikroliter Zellsuspension zum Zählen.Anschließend zentrifugieren Sie die restliche Zellsuspension bei 500 x g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn sich die Zellen drehen, zählen Sie mit einem laborspezifischen Zählprotokoll, z. B. Trypanblau oder Acridin Orange / Propidiumiodid. Resuspendieren Sie die Zellen nach der Zentrifugation in Gefriermedium mit einem Minimum von 5 x 10 bis zur sechsten Zelle pro Milliliter Gefriermedium und übertragen Sie einen Milliliter dieser Zellsuspension auf vormarkierte 1,5 Milliliter Kryofrüchte.Legen Sie die Kryofrüchte in eine kontrollierte Gefrierkammer und übertragen Sie sie sofort auf minus 80 Grad Celsius. Die Abbildung zeigt eine zunehmende Faserblastenkontamination von 80% 50% und 30% im Vergleich zu einer Kultur ohne Fibroblastenkontamination. Diese Abbildung zeigt die repräsentative Durchflusszytometrie-Oberflächenfärbung von vier primären Mesotheliom-Tumorlinien, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H und einer Melanom-Tumorlinie, MEL526 als Negativkontrolle.Diese Zelllinien können sowohl Mesothelin als auch N-Cadherin exprimieren. Die Bedeutung der Prüfung des Einflusses der enzymatischen Ablösung auf die Expression von Oberflächenproteinmarkern wird ebenfalls gezeigt, da sowohl Trypsin als auch die Proteasekollagenasemischung zum Verlust der Oberflächenexpression von N-Cadherin führten, während CD90 nicht beeinflusst wurde. Wichtige Schritte umfassen die ordnungsgemäße Verarbeitung des Tumors, einschließlich der Entfernung von Blut und Fett vor der Verdauung, die Identifizierung der Fibroblastenkontamination und die Bestimmung, wie die Überwucherung der Fibroblasten begrenzt werden kann.Eine wichtige Methode nach diesem Verfahren sind zytotoxische Lymphozyten-Assays, um die Fähigkeit autologer T-Zellen zu testen, von Patienten abgeleitete Tumorzellen zu erkennen. Diese Technik wird neue antitumorspezifische T-Zell-Rezeptoren identifizieren, die von therapeutischer Bedeutung sein könnten. Darüber hinaus wird es uns ermöglichen, die Wechselwirkung zwischen Tumor und gepaarten tumorinfiltrierenden Lymphozyten und Immundysfunktion zu untersuchen.

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Research

Forschung

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Cancer Research

Krebsforschung

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Erzeugung und Erweiterung primärer, maligner pleuraler Mesotheliom-Tumorlinien

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