Name: Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Erfahren Sie nicht-invasive Methoden zur Lokalisierung von Photorezeptor-Membranproteinen in Drosophila mittels eGFP-Fluoreszenz. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung erblicher Blindheit beim Menschen.

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Wir danken unseren studentischen Forschern im Laufe der Jahre. Insbesondere Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim und Laura Jaggy, deren Daten in diesem Protokoll als repräsentative Ergebnisse verwendet wurden. Die Forschung unserer hier vorgestellten Gruppe wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) an Armin Huber gefördert.

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Anwendbarkeit von Fluoreszenzproteinen und die Einfachheit des Screenings durch DPP-Bildgebung und retinale Wasserimmersionsmikroskopie haben sich in vielen Gruppen12 als erfolgreich erwiesen. Ähnliche Strategien wie die hier vorgestellten wurden in mehreren genetischen Screens verwendet, um Defekte in der Rhodopsinexpression, Homöostase, Netzhautorganisation oder zellulären Integrität mit Hilfe von Rh1::eGFP17,18,19,20,21<s...

Durch die Abgabe und Entfernung von Proteinen zur und von der Plasmamembran steuert der Membranproteintransport in Neuronen die Plasmamembranausrüstung mit Rezeptoren sowie Ionenkanälen und reguliert dadurch die neuronale Funktion. Fehlregulationen oder Defekte im Proteintransport haben typischerweise schädliche Auswirkungen auf Zellen und führen zu neuronaler Degeneration. Beim Menschen kann dies neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson oder Retinitis pigmentosa1 verursachen. Photorezeptoren im Facettenauge von Drosophila melanogaster sind zu einem In-vivo-Modellsystem für die Untersuchung des Membranproteintransportsgeworden 2. Dies liegt nicht nur an der genetischen Vielseitigkeit von Drosophila , die effektive genetische Screens ermöglicht, sondern auch daran, dass alle wesentlichen Bestandteile der lichtabsorbierenden Photorezeptormembran sehr detailliert charakterisiert sind und effiziente mikroskopische Techniken zur Verfügung stehen, die auf das Fliegenauge angewendet werden können. Diese Techniken stehen im Mittelpunkt dieses Artikels.
In Drosophila-Photorezeptorzellen bildet die apikale Plasmamembran einen dicht gepackten Stapel von Mikrovilli entlang einer Seite der Zelle, der als Rhabdomere bezeichnet wird. Die Rhabdomere der Photorezeptorzellen R1-6 sind in einem charakteristischen trapezförmigen Muster angeordnet, während die Photorezeptorzellen R7 und R8 ein einzelnes Rhabdomere in der Mitte diesesTrapezes 3 bilden. Der Membranproteintransport wird für einen regulierten Umsatz von rhabdomeralen Membranproteinen wie Rhodopsin und den lichtaktivierten Ionenkanälen TRP (transient receptor potential) und TRPL (TRP-like) benötigt, um die richtige Menge dieser Phototransduktionsproteine im Rhabdomere sicherzustellen. Photorezeptormembranproteine werden im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und über den Golgi-Apparat zum Rhabdomere transportiert. Nach der Aktivierung von Rhodopsin durch Licht kann ein Rhodopsinmolekül entweder durch Absorption eines zweiten Photons inaktiviert oder durch Clathrin-vermittelte Endozytose aus dem Rhabdomere entfernt werden. Endozytosiertes Rhodopsin wird entweder im Lysosom abgebaut oder in den Rhabdomerezurückgeführt 4,5. Der Ionenkanal TRPL wird nach Aktivierung der Phototransduktionskaskade ebenfalls internalisiert und durchläuft eine lichtabhängige Translokation zwischen dem Rhabdomere (wo er sich befindet, wenn Fliegen im Dunkeln gehalten werden) und einem ER-angereicherten Staufach im Zellkörper (zu dem er bei Beleuchtung innerhalb weniger Stunden transportiert wird)6,7,8,9,10 . Im Gegensatz zu endozytosiertem Rhodopsin werden nur geringe Mengen TRPL über den endolysosomalen Weg abgebaut, und der Großteil wird stattdessen intrazellulär gespeichert und bei dunkler Anpassung wieder in den Rhabdomer zurückgeführt6. TRPL kann somit zur Analyse des lichtgetriggerten Transports von Plasmamembranproteinen verwendet werden. Drosophila-Photorezeptorzellen werden auch zur Untersuchung der neuronalen Degeneration eingesetzt. Die Degeneration von Photorezeptorzellen wird häufig durch die Beurteilung der Struktur von Rhabdomeren bestimmt, die infolge degenerativer Prozesse zerfallen5.
Um die subzelluläre Lokalisation von TRPL und Rhodopsin in Photorezeptorzellen oder die Degeneration von Photorezeptorzellen zu untersuchen, wurden hier zwei Fluoreszenzmikroskopie-Methoden angewendet, die sich hinsichtlich Analysegeschwindigkeit und Auflösung unterscheiden. Eine sehr schnelle, nicht-invasive Methode, die für genetische Screens verwendet werden kann, jedoch mit einer begrenzten räumlichen Auflösung, ist der Nachweis der Fluoreszenz in der tiefen Pseudopupille (DPP). Das DPP ist ein optisches Phänomen von Arthropoden-Facettenaugen, dessen geometrischer Ursprung1971 von Franceschini und Kirschfeld ausführlich erklärt wurde 11. Kurz gesagt, auf mehreren optischen Ebenen unterhalb der Netzhautüberlagerung können Bilder von Rhabdomeren aus benachbarten Ommatidien beobachtet werden. Auf einer Fokusebene durch die Mitte der Augenkrümmung bilden diese überlagerten Projektionen ein Bild, das dem trapezförmigen Layout von Rhabdomeren in einem einzigen Ommatidium ähnelt, das nur um Größenordnungen größer ist. Dieses Phänomen kann auch unabhängig von der exogenen Expression von Fluoreszenzproteinen (z.B. TRPL::EGFP 8) beobachtet werden, was den Nachweis des DPP jedoch erleichtert (Abbildung 1A-A'')12. Eine zweite nicht-invasive Methode ist die Wasserimmersionsmikroskopie, die auf der Abbildung fluoreszierend markierter Proteine beruht, nachdem der Dioptrienapparat der Augen optisch mit Wasser neutralisiert wurde (Abbildung 1B-C'')12. Mit der Wasserimmersionsmethode kann die relative Menge an TRPL::eGFP in den Rhabdomeren oder im Zellkörper für einzelne Photorezeptorzellen quantitativ beurteilt werden. Darüber hinaus können nicht-translozierende fluoreszenzmarkierte Proteine verwendet werden, um die rhabdomerale Integrität zu bewerten und den zeitlichen Verlauf einer möglichen Degeneration quantitativ zu bestimmen, wie hier beschrieben.
Während Aufzeichnungen des DPP bei weitem die einfachste und schnellste dieser Methoden sind, ist die räumliche Auflösung der von ihnen generierten Daten begrenzt. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Gründe, warum ein DPP fehlen kann, die für die DPP-Bildgebung selbst nicht unbedingt erkennbar sind. Da der DPP eine Summe mehrerer Ommatidien darstellt, gehen Informationen über einzelne Zellen verloren. Daher erfüllt die DPP-Bildgebung mit niedriger Auflösung eine wichtige Funktion beim Screening einer großen Anzahl von Fliegen, sollte jedoch im Allgemeinen von Aufnahmen mit höherer Auflösung mittels Wasserimmersionsmikroskopie gefolgt werden. Wasserimmersionsmikroskope erlauben Interpretationen über einzelne Zellen, Entwicklungsdefekte, Augenmorphologie, Proteinfehllokalisation oder Netzhautdegeneration sowie die Quantifizierung dieser Effekte. Dieses Protokoll beschreibt diese beiden Techniken im Detail.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über die in diesem Protokoll dargestellten Mikroskopievariationen für das Drosophila-Auge. Schematische Darstellungen und exemplarische Mikroaufnahmen der (A-A'') fluoreszierenden tiefen Pseudopupillenbildgebung (DPP), (B-B'') der tödlichen Wasserimmersionsmikroskopie von fluoreszierenden Rhabdomeren und (C-C'') der nicht-tödlichen Wassertropfenmikroskopie von fluoreszierenden Rhabdomeren. Maßstabsleiste (A''): 100 μm. Maßstabsstäbe (B''-C''): 10 μm Die Abbildung wurde gegenüber Referenz13 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Anästhesie-Fliegenpad</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Kaltlichtlampe (KL 1500 LCD)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit UV-Lampe, Kamera, Filterset und Software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blau Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstoffröhre (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 &micro; W cm-2, Ee590nm = 215 &micro; W cm-2] und [760 Lux, Ee470nm = 173 &micro; W cm-2, Ee590nm = 147 &μ; W cm-2]</td><td>Osram</td><td>4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>Laborpipette (20-200 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (94 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (200 & Mikro; L)</td><td>Labsolute</td><td>7695844</td><td></td></tr><tr><td>Plastilin (Blu-Tack)</td><td>Bostik</td><td>30811745</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop (SMZ445)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop mit UV-Lampe, Kamera, Filer-Set und Software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung des membranproteintransports in drosophila-photorezeptorzellen unter verwendung von egfp-markierten proteinen

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Der Membranproteintransport reguliert den Einbau und die Entfernung von Rezeptoren und Ionenkanälen in die Plasmamembran. Dieser Prozess ist grundlegend wichtig für die Zellfunktion und die Zellintegrität von Neuronen. Drosophila-Photorezeptorzellen sind zu einem Modell für die Untersuchung des Membranproteintransports geworden. Neben Rhodopsin, das bei Beleuchtung aus der Photorezeptormembran internalisiert und abgebaut wird, weist der transiente Rezeptorpotential-ähnliche (TRPL) Ionenkanal in Drosophila eine lichtabhängige Translokation zwischen der rhabdomeralen Photorezeptormembran (wo es sich im Dunkeln befindet) und dem Photorezeptorzellkörper (zu dem es bei Beleuchtung transportiert wird) auf. Dieser intrazelluläre Transport von TRPL kann auf einfache und nicht-invasive Weise untersucht werden, indem eGFP-markiertes TRPL in Photorezeptorzellen exprimiert wird. Die eGFP-Fluoreszenz kann dann entweder in der tiefen Pseudopupille oder mittels Wasserimmersionsmikroskopie beobachtet werden. Diese Methoden ermöglichen den Nachweis der Fluoreszenz im intakten Auge und sind daher nützlich für Hochdurchsatz-Assays und genetische Screens für Drosophila-Mutanten , die bei der TRPL-Translokation defekt sind. Hier werden die Herstellung von Fliegen, die mikroskopischen Techniken sowie Quantifizierungsmethoden, mit denen diese lichtgetriggerte Translokation von TRPL untersucht wird, ausführlich erläutert. Diese Methoden können auch für Handelsstudien an anderen Drosophila-Photorezeptorproteinen , zum Beispiel Rhodopsin, angewendet werden. Darüber hinaus können diese Methoden durch die Verwendung von eGFP-markierten rhabdomeralen Proteinen verwendet werden, um die Degeneration von Photorezeptorzellen zu beurteilen.

Transgene Drosophila-Fliegen, die ein TRPL::eGFP-Fusionsprotein unter der Kontrolle des Rhodopsin-1-Promotors exprimieren, wurden erzeugt. Bei diesen Fliegen wird TRPL::eGFP in den Photorezeptorzellen R1-6 des Facettenauges exprimiert und zeigt eine beleuchtungsabhängige Lokalisation. Wenn Fliegen im Dunkeln gehalten werden, wird TRPL::eGFP in die äußeren Rhabdomere eingearbeitet. Nach mehrstündiger Beleuchtung transloziert TRPL in den Zellkörper, wo es in einem ER-angereicherten Kompartiment gespeichert wird. <...

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

GFP-markierte Photorezeptorproteine, wie der Ionenkanal TRPL GFP, ermöglichen es uns, den Proteintransport in Neuronen mit nichtinvasiven Techniken zu untersuchen. Diese Methode kann auch zur Überwachung der Photorezeptordegeneration verwendet werden. So können die molekularen Grundlagen von Erbkrankheiten, die beim Menschen zur Erblindung führen, im Drosophila-Auge untersucht werden.Die zelluläre Lokalisation von GFP-markierten Proteinen kann durch Beobachtung der Fluoreszenz in der tiefen Pseudopupille oder durch Wasserimmersionsmikroskopie beurteilt werden. Beide Methoden ermöglichen eine schnelle Bestimmung der Lokalisation visueller Proteine und die Beobachtung struktureller Defekte von Rhabdomeren aufgrund der Degeneration von Photorezeptorzellen. Um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, ist der wichtigste Aspekt die Ausrichtung des Fliegenauge.Während der Durchführung dieser Technik sollte man sich auf Ommatidien konzentrieren, die sich leicht in Richtung der Peripherie des Auges befinden. Ich werde das Verfahren der DPP-Bildgebung demonstrieren, während die beiden Techniken mit Wasserimmersionsmikroskopie von meiner Kollegin Dr. Krystina Wagner und Matthias Zeger, einem Doktoranden in unserer Gruppe, demonstriert werden. Um mit der Tiefen-Pseudopupillen- oder DPP-Bildgebung zu beginnen, betäuben Sie ein bis drei Tage alte Fliegen und positionieren Sie eine von ihnen in der Mitte des Mikroskopobjektivs auf der Seite, so dass entweder das linke oder rechte Auge dem Objektiv genau radial zugewandt ist.Erhöhen Sie die Vergrößerung, um das gesamte Auge anzupassen, und zentrieren Sie die zentralen Ommatidien des Auges. Wenn möglich, verringern Sie die Schärfentiefe des Mikroskops, indem Sie die Doppelblende der Blende auf eine flache Einstellung einstellen. Als nächstes schalten Sie die UV-Lampe des Mikroskops mit maximaler Intensität ein.Wählen Sie dann den Fluoreszenzfiltersatz des Mikroskops entsprechend dem in den Augen exprimierten Fluoreszenzprotein aus und stellen Sie den Lichtweg in Richtung der am Mikroskop montierten Kamera ein. Passen Sie die Bildhelligkeit mithilfe der Live-Imaging-Funktion in der Software an eine Einstellung an, die nur bestimmte Signale des Auges erkennt, indem Sie die Belichtungszeit und den Verstärkungswert erhöhen. Richten Sie den Mikroskopfokus in das Auge ein, um das überlagerte Bild des DPP zu erzeugen.Machen Sie dann einen Schnappschuss des fluoreszierenden DPP. Um eine Fliege in einer tödlichen Variante vorzubereiten, kleben Sie ein Stück Plastilin auf einen Objektträger und ein weiteres Stück in die Mitte einer Petrischale. Füllen Sie die Petrischale mit eisgekühltem destilliertem Wasser und einigen Eisflocken.Legen Sie dann eine eisbetäubte Fliege unter ein Stereomikroskop auf den mit Plastilin beschichteten Objektträger. Drehen Sie die Fliege auf den Rücken und durchbohren Sie eine Insektennadel durch die Mitte des Brustkorbs. Befestigen Sie den Stift horizontal auf dem mit Plastilin beschichteten Objektträger und richten Sie entweder das linke oder das rechte Auge der Fliege nach oben.Fixieren Sie dann vorsichtig den Objektträger mit seiner Plastilin-freien Seite nach unten in der Petrischale, um eine Rotation des Fliegenkopfes zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass das Fliegenauge mit Wasser bedeckt ist. Alternativ, um eine Fliege in einer nicht-tödlichen Variante vorzubereiten, übertragen Sie die eisbetäubte Fliege mit dem Kopf zuerst in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze und drücken Sie die Fliege vorsichtig mit Druckluft in Richtung der Spitze.Schneiden Sie dann mit einem Skalpell die Pipettenspitze direkt vor dem Kopf ab und drücken Sie die Fliege vorsichtig einige Millimeter in die Pipettenspitze. Schneiden Sie die Pipettenspitze wieder ab und drücken Sie die Fliege mit der Druckluft zurück zur Spitze, so dass nur der Kopf der Fliege aus der Pipettenspitze herausragt. Nachdem Sie ein Stück Plastilin auf einen Objektträger geklebt haben, drücken Sie die Pipettenspitze so hinein, dass das linke oder rechte Auge nach oben zeigt.Stellen Sie sicher, dass das Auge unter dem Mikroskop richtig ausgerichtet ist. Wählen Sie für die Bildaufnahme ein Objektiv zum Eintauchen in Wasser aus. Im Falle einer nicht-tödlichen Variation verwenden Sie eine Laborpipette, um einen großen Tropfen gekühlten Wassers an der Unterseite des Wassertauchobjektivs zu haften.Legen Sie den Objektträger mit der vorbereiteten Fliege vorsichtig auf den Mikroskoptisch. Senken Sie dann das Wassertauchobjektiv manuell ab, bis es die Wasseroberfläche berührt oder das Auge der Fliege den Tropfen berührt. Schalten Sie dann den Lichtweg in Richtung der Mikroskopkamera um und erzeugen Sie ein Livebild.Stellen Sie den Fokus für die Kamera neu und bewerten Sie die Ausrichtung des Auges, wobei zu berücksichtigen ist, dass das Auge dem Mikroskopobjektiv radial zugewandt sein muss. Verwenden Sie die Nachschlagetabellensoftware, um Übersättigung zu erkennen. Bei nicht pigmentierten Fliegen sollten Sie die Belichtungszeit so einstellen, dass die hellsten Pixel für jedes Bild knapp unter der Sättigungsgrenze liegen.Nehmen Sie ein Bild auf und speichern Sie es als Rohdatei, um alle entsprechenden Metadaten der Aufnahme zu archivieren. Exportieren Sie dann das Bild in ein tif-Format. Um die relative eGFP-Fluoreszenz in den Rhabdomeren von Wassertauchmikroskopen zu quantifizieren, passen Sie die ImageJ-Einstellungen an, indem Sie auf Analysieren klicken, dann auf Messungen einstellen klicken und nur das Kontrollkästchen für den mittleren Grauwert aktivieren.Importieren Sie das tif-Bild, indem Sie auf Datei und dann auf Öffnen klicken. Wählen Sie einen repräsentativen Bereich des fokussierten Bildes und vergrößern Sie ihn auf 200 bis 300 %, indem Sie wiederholt die Strg-Taste drücken und zusammen. Wählen Sie als Nächstes das Oval-Werkzeug aus und erzeugen Sie beim Drücken der Umschalttaste eine kreisförmige Auswahl im Bild, die deutlich kleiner als eine fluoreszierende Rhabdomere ist.Suchen Sie dann nach der genauen Größe, die unter der Symbolleiste im ImageJ-Hauptfenster angezeigt wird. Um die Fluoreszenzintensitäten innerhalb der kreisförmigen Auswahl zu messen, bewegen Sie den Kreis mit den Pfeiltasten auf der Tastatur zum ersten Rhabdomere, und klicken Sie auf Analysieren und dann auf Messen. Ein Ergebnisfenster mit dem gemessenen Grauwert wird angezeigt.Fahren Sie mit Messungen von Rhabdomeren zwei bis sechs fort und messen Sie auch das Hintergrundsignal. Nehmen Sie bei nicht pigmentierten Fliegen zusätzliche Messungen der entsprechenden Zellkörperbereiche vor. Messen Sie die Fluoreszenz von zwei weiteren Ommatidien, was zu drei technischen Replikaten führt.Markieren Sie die analysierten Ommatidien mit dem Bleistiftwerkzeug und speichern Sie dieses Bild zur Dokumentation. Wählen Sie die gemessenen Grauwerte aus, kopieren Sie sie aus dem Ergebnisfenster und fügen Sie sie zur weiteren Berechnung in die Tabellenkalkulationssoftware ein. Sortieren Sie die Fluoreszenzintensitätswerte nach ihrer Herkunft in die Kategorien Rhabdomere, Zellkörper und Hintergrund und berechnen Sie die mittlere Intensität aus jeder Kategorie.Berechnen Sie dann die relative Menge an eGFP, die im Rhabdomere vorhanden ist, indem Sie die erste Formel für nicht pigmentierte Augen und die zweite für pigmentierte Augen verwenden. Alternativ können Sie zur Quantifizierung der Augenmorphologie durch eGFP-Fluoreszenz in Wasser-Tauchmikroskopie-Aufnahmen drei benachbarte Ommatidien in einem repräsentativen Bereich des Bildes auswählen, der im Fokus steht. Bewerten Sie die 18 Rhabdomere der Auswahl individuell nach ihrer eGFP-Intensität, Kantenschärfe und Kontrast in Bezug auf das umgebende Hintergrundsignal.Bewerten Sie schließlich die deutlich sichtbaren Rhabdomeres mit einem Wert von zwei, wöchentlich sichtbare Rhabdomeres mit einem Wert von eins und fehlende Rhabdomeres mit einem Wert von Null, um einen Degenerationsindex zu erzeugen. In transgenen Drosophila-Fliegen, die ein eGFP TRPL-Fusionsprotein exprimieren, verschwindet die rhabdomerale Fluoreszenz aufgrund der Translokation des eGFP TRPL im Licht. Dies ermöglicht die Durchführung eines genetischen Screenings, um Mutanten zu identifizieren, die bei der Internalisierung des eGFP TRPL defekt sind.Bei Kontrollfliegen transloziert eGFP TRPL nach 16 Stunden Beleuchtung aus den Rhabdomeren in den Zellkörper, was zu einer signifikanten Abnahme der rhabdomeralen Fluoreszenz im Vergleich zum dunkel angepassten Zustand führt. Die zweite dunkle Inkubation hebt die rhabdomerale Fluoreszenz wieder auf den Ausgangswert an. Bei der TRPL-Translokationsdefekten Mutante vps35MH20 ändert sich das Fluoreszenzmuster jedoch nach 16 Stunden Beleuchtung und einer anschließenden Dunkelanpassung für 24 Stunden nicht drastisch.Diese Quantifizierungsmethode kann einen statistisch hochsignifikanten Recyclingfehler nachweisen. Weißäugige Fliegen ermöglichen den Nachweis von Fluoreszenzsignalen sowohl aus dem Rhabdomere als auch aus dem Zellkörper. Im Gegensatz dazu sind bei rotäugigen Fliegen Fluoreszenzsignale nur in Rhabdomeren nachweisbar, nicht aber im Zellkörper.Hinsichtlich der Quantifizierung der Netzhautdegeneration kann die eGFP TRP-Fluoreszenz über mehrere Wochen beurteilt werden. Wenn der Degenerationsindex zwei Wochen lang in einem 12-stündigen hellen, 12-stündigen Dunkelzyklus gehalten wurde, sank er bei mutierten Fliegen, aber nicht bei Kontrollfliegen. In diesem Protokoll muss man zwischen pigmentierten und nicht pigmentierten Augen unterscheiden.Da die Pigmentierung das Fluoreszenzsignal beeinflusst, wurde die quantitative Wasserimmersionsmikroskopie für beide Fälle einzeln optimiert. DPP-Bildgebung und Wasserimmersionsmikroskopie sind Hochdurchsatzmethoden mit begrenzter Auflösung. Um die subzelluläre Lokalisation zu untersuchen, empfehlen wir die Immunfluoreszenzmikroskopie an Gewebeschnitten.Für eine detaillierte Analyse degenerativer Phänotypen kann eine Elektronenmikroskopie durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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