Quantifizierung des Eisentransports über die Mausplazenta in vivo unter Verwendung nichtradioaktiver Eisenisotope

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es Forschern ermöglicht, die Eisenverteilung in vivo ohne Radioaktivität zu verfolgen und zu quantifizieren. Da mehrere stabile Eisenisotope gleichzeitig innerhalb derselben Probe nachgewiesen werden können, kann diese Technik verwendet werden, um die Aufnahme, Regulierung und Verteilung von Eisen aus verschiedenen Quellen zu verstehen. Fügen Sie zunächst 12 normale Salzsäure zu dem Eisen-58 in der vom Verkäufer gelieferten Glasdurchstechflasche hinzu und setzen Sie die Kappe lose wieder auf.

Um das Eisen aufzulösen, erwärmen Sie die Lösung eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius. Wenn immer noch nicht aufgelöst, lassen Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur im Abzug auflösen. Um dann die Eisenchloridlösung zu erzeugen, oxidieren Sie das verbleibende Eisenchlorid, indem Sie die Lösung mit abgenommener Kappe auf 60 Grad Celsius erwärmen, um die Oxidation zu erleichtern.

Fügen Sie einen Mikroliter 35% Wasserstoffperoxid pro 50 Mikroliter der Lösung hinzu, um die Oxidation weiter zu erleichtern. Lassen Sie die Eisenchloridlösung bei 60 Grad Celsius mit abgenommener Kappe in der Haube, um die Probe zu verdampfen. Dann rekonstituieren Sie das Eisenchlorid zu 100 Millimol mit Reinstwasser.

Berechnen Sie die benötigte Wassermenge basierend auf dem anfänglichen Metallgewicht. Als nächstes wird ein Milliliter Eisennitrilotriacetat hergestellt, indem die vorbereitete Eisenchloridlösung mit Nitrilotriacetat in einem Molverhältnis von ein zu fünf in Gegenwart von 20 Millimolar-Natriumbicarbonat für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Dann werden 500 Milligramm Apotransferrin in vier Milliliter Transfer- und Ladepuffer gelöst und vier Milliliter dieser Apotransferrinlösung in die vorbereitete Eisennitrilotriacetatlösung im 15-Milliliter-Röhrchen gegeben.

Um eine maximale Beladung von Eisennitrilotriacetat auf Apotransferrin zu ermöglichen, überprüfen Sie, ob die Lösung einen pH-Wert von 7,5 aufweist, und stellen Sie den pH-Wert gegebenenfalls mit Natriumbicarbonat oder Salzsäure ein. Inkubieren Sie die Mischung für 2 1/2 Stunden bei Raumtemperatur. Als nächstes entfernen Sie das überschüssige ungebundene Eisennitrilotriacetat und freigesetztes Nitrilotriacetat, indem Sie die Eisen-58-Transferrinlösung in eine Molekulargewichts-Cutoff-Säule übertragen und die Säule zentrifugieren.

Nach dem Zentrifugieren die Säule zweimal waschen, indem Sie 10 Milliliter Transferrinladepuffer hinzufügen und die Säule zentrifugieren. Dann waschen Sie die Säule mit 10 Milliliter Kochsalzlösung und zentrifugieren Sie erneut. Zum Schluss sterilisieren Sie die Eisen-58-Transferrinlösung mit einem 0,22-Mikron-Spritzenfilter und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis sie gebrauchsfertig ist.

Bereiten Sie eine 35 Milligramm pro Milliliter Eisen-58-Transferrinlösung in Kochsalzlösung vor. Dann legen Sie eine anästhesierte schwangere Maus auf ein Heizkissen und injizieren Sie langsam und vorsichtig die Eisen-58-Transferrinlösung in den retroorbitalen Sinus. Sechs Stunden nach der Injektion euthanasieren Sie die Maus und entfernen Sie die Gebärmutter vorsichtig mit einer sterilen Pinzette und einer Sektionschere.

Schneiden Sie eine fetale Plazentaeinheit ab, die einen einzelnen Fötus und eine Plazenta im Fruchtsack umfasst, der von einem Teil der Gebärmutter umgeben ist. Als nächstes schneiden Sie vorsichtig durch die Gebärmutter und die Fruchtblase, ohne den Fötus und die Plazenta zu stören. Dann schälen Sie die Fruchtblase zurück und entfernen Sie den Fötus und die Plazenta.

Nachdem Sie die Nabelschnur durchtrennt haben, tupfen Sie den Fötus und die Plazenta auf einem sauberen Arbeitstuch ab, um überschüssiges Fruchtwasser zu entfernen, und notieren Sie das Gewicht der gesamten Plazenta. Schneiden Sie jede Plazenta mit einer Rasierklinge in zwei Hälften. Jede Hälfte in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen geben und in flüssigem Stickstoff einfrieren.

Um die Embryoleber zu sammeln, opfern Sie den Embryo und fixieren Sie den Embryo zur Stabilisierung, wobei der Bauch freiliegt. Machen Sie mit einer Sektionschere einen kleinen Einschnitt, an dem die Nabelschnur befestigt war. Führen Sie ein Ende der Dissektionsschere in den Einschnitt ein und führen Sie einen 1/4-Zoll-Mittelflächenschnitt in Richtung der koronalen Ebene durch.

Führen Sie dann transversale Ebenenschnitte durch, um die fetale Leber freizulegen. Entfernen Sie mit einer Pinzette die fetale Leber und notieren Sie das Gewicht der gesamten embryonalen Leber. Die gesamte embryonale Leber in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen geben und in flüssigem Stickstoff einfrieren.

Lagern Sie das Gewebe unbegrenzt bei minus 80 Grad Celsius. Um das Nicht-Häm-Eisen in den Plazenten und fetalen Lebern zu quantifizieren, tauen Sie die Plazentahälften und die ganze fetale Leber auf. Dann wiegen Sie die Plazentahälften.

Geben Sie 400 Mikroliter Proteinfällungslösung in die Gewebeproben und homogenisieren Sie das Gewebe mit einem elektrischen Homogenisator. Inkubieren Sie die Proben bei 100 Grad Celsius für eine Stunde. Dann kühlen Sie sie bei Raumtemperatur Wasser für zwei Minuten.

Öffnen Sie die Kappen, um den Druck abzubauen. Dann schließen Sie die Röhrchen wieder. Nachdem Sie die Probe zentrifugiert haben, um die Gewebereste zu pelletieren, überführen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues markiertes Röhrchen für die ICP-MS-Analyse.

Neben der Quantifizierung des Hämeisens ist das Gewicht des nach dem Zentrifugieren erhaltenen Pellets aufzuzeichnen. Dann verdauen Sie die Pellets in 10 Milliliter konzentrierter 70% Salpetersäure, ergänzt mit einem Milliliter 30% Wasserstoffperoxid. Erhitzen Sie die Proben 15 Minuten lang auf 200 Grad Celsius, bevor Sie sie zur ICP-MS-Analyse schicken.

Die ICP-MS-Messung ermöglichte den Nachweis von zwei verschiedenen Eisenisotopen. Das am häufigsten vorkommende Eisenisotop, Eisen-56, spiegelt chronische Ionenveränderungen in Geweben wider. Ein weiteres Isotop, Eisen-58, spiegelt akute Veränderungen in der Verteilung des injizierten Eisens wider.

Die Eisen-56-Messung bestätigte, dass Embryolebern aus eisenarmen Schwangerschaften im Vergleich zu denen in eisenreichen Schwangerschaften geringere Eisenspeicher aufwiesen. Die Eisen-58-Messung bestätigte, dass bei eisenarmen Schwangerschaften über sechs Stunden weniger Eisen in die embryonale Leber übertragen wurde als bei eisenreichen Schwangerschaften. Denken Sie während des Verfahrens daran, das Gewicht der Gewebe aufzuzeichnen.

Diese Gewichte sind notwendig, um Eisenkonzentrationen zu berechnen. Da Eisen-58 keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen und Entsorgung erfordert, kann unverarbeitetes Gewebe für andere Analysen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Western Blotting oder qPCR.