Name: Anwendungen der RNA-Interferenz in amerikanischen Kakerlaken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Erfahren Sie RNA-Interferenz-Techniken zur Untersuchung der amerikanischen Kakerlake, einem wichtigen Schädling und Nutzinsekt. Diese Methode ermöglicht gezielte Gen-Knockdowns und liefert Einblicke in molekulare Mechanismen von Entwicklung, Regeneration und Verhalten.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 und 31572325 to C.R., Sh.L.), von der Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 und 2020A1515011267 to C.R.), vom Department of Science and Technology in Guangdong Province (Grant Nos. 2019B090905003 und 2019A0102006), vom Department of Science and Technology in Guangzhou (Grant No. 202102020110), durch das Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 bis Sh.L.).

Die Linie von P. americana wurde ursprünglich von Dr . Huiling Hao zur Verfügung gestellt. Diese Art wird seit 30 Jahren mit Inzuchtgepflegt 9.
1. Schlüpfen und Fütterung von P. americana
<ol><li>Sammeln Sie frische Otheken (unmittelbar nach der Eiablage) von P. americana und inkubieren Sie im dunklen Inkubator bei 25 ° C und 60% Luftfeuchtigkeit für ~ 25 Tage. Dann erhöhen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf 30 ° C und 75% 3 Tage vor dem Schlüpfen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Sieb mit 4 mm Öffnung, um die geschlüpften Nymphen von den Ootheken zu trennen.</li>
	<li>Bewahren Sie die Nymphen in zylindrischen Behältern (12 cm Durchmesser und 10 cm Höhe) im Dunkeln bei 28 °C, 70% Luftfeuchtigkeit auf. Bürsten Sie den Innenrand der Behälter mit Vaseline, um zu verhindern, dass Kakerlaken entkommen. Stellen Sie Rattenfutter, Wasser und Schutz (Eierschalen) zur Verfügung. Achten Sie auf die Aktivität der Nymphen und reinigen Sie regelmäßig den Kot und die Trümmer.</li>
</ol>2. Auswahl der Nymphen im richtigen Stadium
<ol><li>Verwenden Sie eine Glasröhre, um die frisch gehäutete P. americana (weiße Körperfarbe) herauszupicken. Bewahren Sie sie in neuen Behältern auf und warten Sie auf die richtige Phase der Behandlung. HINWEIS: Nach ~ 19 Tagen unter den oben genannten Fütterungsbedingungen stehen die Nymphen in den3. Stadien zur Injektion zur Verfügung. Die Farbe von frisch gehäuteten Kakerlaken ist weiß, und die Stadien werden durch Häutungszeiten geklärt.</li>
</ol>3. Vorbereitung des Zielfragments mit T7-Promotoren
<ol><li>Unter Verwendung der cDNA von P. americana als Vorlage entwerfen Sie gepaarte Primer zur Durchführung einer PCR, um ein DNA-Fragment von 300-800 bp des Zielgens9 zu erhalten. Klonen Sie dann das PCR-Fragment zur Sequenzierung in einen pTOPO-Vektor (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verwenden Sie die Zielfragment-DNA als Vorlage, synthetisieren Sie ein neues Paar Primer mit T7-Promotorsequenz (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') an den 5'-Terminals und führen Sie eine weitere Runde PCR durch, um das Zielfragment mit T7-Promotoren auf jeder Seite9 zu erhalten.</li>
</ol>4. Transkription und Synthese von dsRNA in vitro
<ol><li>10 μL T7 2X Puffer, 2 μL der Enzymmischung, T7 Express (siehe Materialtabelle) und 2 μg PCR-Produkt (erhalten in Schritt 3.2) in das Reaktionssystem geben und das Gesamtvolumen auf 20 μL mit ddH2O addieren. Vorsichtig auf dem Kopf stehend manuell mischen und bei 37 °C für 30 min und 70 °C für 10 min inkubieren, und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen.</li>
	<li>Verdünnen Sie RNase A-Lösung (4 μg/μL) mit ddH 2 O im Verhältnis 1:200. Dann fügen Sie dem System 1 μL RQ1 RNase-freie DNase (1 U/μL) und 1 μL verdünnte RNase A-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Jetzt beträgt das Volumen eines einzelnen Systems 22 μL.</li>
	<li>30 min bei 37 °C inkubieren Dann fügen Sie 10% des Gesamtvolumens (bei gleichzeitiger Durchführung von N-Reaktionen beträgt das Gesamtvolumen N x 22 μL) Natriumacetat und drei Volumina des Gesamtvolumens von Isopropanol hinzu.</li>
	<li>Vorsichtig auf dem Kopf stehend manuell mischen, 5 min auf Eis legen und 10 min bei 4 °C bei 13.000 x g zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, waschen Sie den Rückstand mit 75% Ethanol (mit 25% Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser) und zentrifugieren Sie dann bei 13.000 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand wieder. Trocknen Sie das Pellet 15 min bei Raumtemperatur an der Luft. Verwenden Sie ~ 100 μL DEPC-Wasser, um dsRNA aufzulösen, und verdünnen Sie dann die dsRNA auf die letzten 2 μg / μL. HINWEIS: Die dsRNA konnte 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.</li>
</ol>5. Laden der dsRNA-Lösung in die Spritze
<ol><li>Richten Sie das Programm in der Mikroinjektionspumpe (siehe Materialtabelle) im Voraus ein, um sicherzustellen, dass das Volumen jeder Injektion konsistent ist. Bevor Sie die Spritze verwenden, reinigen Sie die Spritze, indem Sie sie 8-10 Mal mit DEPC-Wasser füllen.</li>
	<li>Installieren Sie die 10-μL-Spritze auf der Mikroinjektionspumpe, starten Sie die Pumpe und füllen Sie die Spritze mit 10 μL dsRNA-Lösung (hergestellt in Schritt 4.6). Injizieren Sie 1 μL der dsRNA in eine Nymphe im 3. Stadium (siehe Schritt 2) und stellen Sie sicher, dass sie nicht in den Körper austritt.</li>
</ol>6. Injektion von dsRNA in P. americana
<ol><li>Betäuben Sie die Kakerlaken mit einer erhöhten Konzentration von CO2 in einem Behälter, bis sich die Kakerlaken nicht mehr bewegen, und fahren Sie dann sofort mit der Injektion fort.</li>
	<li>Nehmen Sie die Kakerlake vorsichtig mit einer Pinzette auf und bringen Sie die Kakerlake mit der Hand in Richtung Nadel. Als nächstes führen Sie die Nadel über den Spalt zwischen zwei abdominalen Somiten horizontal gegen die Epidermis ein. Über die Einfügetiefe gilt: Je flacher, desto besser.</li>
	<li>Dann injizieren Sie die dsRNA-Lösung in die Kakerlake. Zum Schluss die Nadelspitze herausziehen. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadelspitze so nah wie möglich an der Epidermis befindet, um eine Schädigung der inneren Organe zu vermeiden. HINWEIS: Die Injektion sollte unter einem Dissektionsmikroskop erfolgen.</li>
	<li>Geben Sie die injizierten Kakerlaken in saubere Bioassay-Behälter. Warten Sie etwa 10-20 Minuten, damit sie sich von den CO 2-Effekten erholen können. Beschriften Sie die Behälter mit dem Injektionsdatum, der Art und der Dosis der dsRNA sowie dem Alter der P. americana.</li>
	<li>Legen Sie die injizierten Kakerlaken in eine dunkle Umgebung bei 28 ° C, 70% Luftfeuchtigkeit, liefern Sie Wasser, Futter und Schutz und beobachten Sie mögliche Veränderungen im Phänotyp der Kakerlaken regelmäßig.</li>
</ol>7. Knockdown-Bestätigung und phänotypische Analyse
<ol><li>Bewerten Sie die Effizienz von RNAi mit allen verfügbaren molekularbiologischen Techniken wie quantitativer Real-Time PCR (qRT-PCR) und Western Blotting. Für detaillierte qRT-PCR- und Western-Blotting-Verfahren siehe Referenzen 1,12.</li>
	<li>Um RNAi-bezogene Phänotypen zu beobachten und zu analysieren, verwenden Sie das für lebende Tiere geeignete Mikroskop. HINWEIS: RNAi kann die Morphologie, das Verhalten, die Häutung, die Regeneration der Gliedmaßen und andere physiologische Aktivitäten von Kakerlaken beeinflussen. Die spezifische Häufigkeit des Phänotyps wird nach bestimmten Bedingungen berechnet.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431(2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+A+futuristic+tool+and+its+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).</li>
<li>Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+%28RNAi%29+induced+gene+silencing%3A+A+promising+approach+of+hi-tech+plant+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding.</a> International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).</li>
<li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%2C+tactile+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%3A+IN%22%5BJournal%5D)">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).</li>
<li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grainy+head+signaling+regulates+epithelium+development+and+ecdysis+in+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica.</a> Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).</li>
<li>Lozano, J., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+repressive+function+of+Kr%C3%BCppel+homolog+1+on+insect+metamorphosis+in+hemimetabolous+and+holometabolous+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.</a> Scientific Reports. 1, 163(2011).</li>
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<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger%3A+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li>
<li>Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+melanin+pathway+to+overall+body+pigmentation+during+ontogenesis+of+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana.</a> Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+amidst+the+silence%3A+Off-target+effects+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs.</a> Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).</li>
<li>Patel, M., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li>
<li>Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778(2020).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interfering+RNA%3A+A+new+tool+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Dieser Bericht beschrieb eine methodische Schritt-für-Schritt-RNAi-Strategie in P. americana; Bemerkenswert ist, dass es auch auf andere Kakerlaken (Blattella germanica, zum Beispiel) und viele andere Insekten mit geringfügigen Veränderungen angewendet werden kann. Die Gen-Silencing-Effizienz von RNAi ist jedoch nicht immer hoch genug, mit einem offensichtlichen Nachteil gegenüber der Gen-Knockout-Strategie13. Der folgende Resteffekt der Genebene kann die realen Phänotypen stören...

RNA-Interferenz (RNAi), ein evolutionär konservierter Mechanismus, wird allmählich zu einem essentiellen reverse-genetischen Werkzeug, um die Genexpression in vielen Organismen zu hemmen1, seit Andrew Fire und Craig Mello2 die doppelsträngige RNA (dsRNA) vermittelte Genstillestrategie entwickelt haben. dsRNA wird durch das Enzym Dicer in Zellen in Fragmente von 21-23 Nukleotiden, kleinen interferierenden RNAs (siRNAs), gespalten, um den RNAi-Signalweg zu aktivieren. Dann werden siRNAs in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, der an die Ziel-mRNA koppelt, eine mRNA-Spaltung verursacht und schließlich zum Verlust der Genfunktion 3,4,5 führt. Unter den Insektenarten wurden bisher viele systemische RNAi-Experimente in vielen Insektenordnungen berichtet, wie Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera und Blattodea 5,6,7,8.
Kakerlaken (Blattaria) sind eine essentielle Insektenfamilie in Entwicklungs- und metamorphen Studien mit ihren schnellen Wachstumszyklen, ihrer starken Anpassungsfähigkeit an die Umwelt und ihrer hohen Entwicklungsplastizität9. Bevor entdeckt wurde, dass RNAi mit Kakerlaken kompatibel war, konzentrierte sich die bisherige Forschung nur auf die Prävention und Kontrolle von Kakerlaken aufgrund einer Knappheit genetischer Manipulationstechniken bei Kakerlaken. Die einzigartige Struktur der Kakerlaken-Oothek machte es schwierig, einen auf Embryoneninjektionen basierenden Gen-Knockout mit dem CRISPR-Cas9-System durchzuführen. Außerdem zeigen die meisten Gewebe in Kakerlaken (wie P. americana) eine robuste systemische RNAi-Reaktion, die die schnelle Erzeugung dysfunktionaler Phänotypen durch Injektion einer oder mehrerer Ziel-dsRNAs 9,10,11 ermöglicht. Diese Eigenschaften machten RNAi zu einer unverzichtbaren Technik in der Genfunktionsforschung bei P. americana.
Obwohl über die Verwendung von RNAi in der funktionellen Genforschung in P. americana berichtet wurde, war keine detaillierte oder Schritt-für-Schritt-Beschreibung verfügbar. Dieser Bericht enthält eine Schritt-für-Schritt-Betriebsleitlinie für RNAi in P. americana, die für die Genfunktionsstudie bei anderen Kakerlaken nützlich ist. Darüber hinaus ist dieser Leitfaden nicht auf Blattodea beschränkt und kann mit geringfügigen Modifikationen auf viele andere Insekten angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>701 N 10 & Mikro; L Syr (26s/51/2)</td><td>Hamilton</td><td>PN:80300</td><td>Injektions-Inkubator</td></tr><tr><td></td><td>Ningbo Jiangnan Instrument Factory</td><td>RXZ-380A-LED</td><td>Für Kakerlaken, Schlüpfen und Füttern</td></tr><tr><td>Mikro-Injektionspumpe</td><td>Alcott Biotechnology</td><td>ALC-IP600</td><td>Injektion</td></tr><tr><td>pTOPO-Blunt Klonierungskit</td><td>Aidlab Biotechnologie</td><td>CV16</td><td>Für Gen-Clonging</td></tr><tr><td>quantitative Real-Time-PCR-Systeme</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX Connect</td><td>Für qRT-PCR-Analysen</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>Für die dsRNA-Synthese, die Rnase A enthält Lösung (4 &mu; g/&mu; L), Natriumacetat, 3,0 M (pH 5,2), Enzymmix, T7 Express, Nukleasefreies Wasser, Express T7 2x Puffer, RQ1 RNase-freie DNase-Thermocycler</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>S1000</td><td>Für die DNA-Amplifikation</td></tr></tbody></table>

anwendungen der rna-interferenz in amerikanischen kakerlaken

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Kakerlaken, ein Hygieneschädling, sind aufgrund ihrer einfachen Fütterung und ihrer hemimetabolen Eigenschaften essentielle Arten in Insektenentwicklungs- und metamorphen Studien. Insgesamt haben diese Vorteile mit gut annotierten Genomsequenzen die amerikanische Kakerlake Periplaneta americana zu einem wichtigen hemimetabolen Insektenmodell gemacht. Begrenzt durch den Mangel an Knockout-Strategie wird effektiver RNA-Interferenz (RNAi)-basierter Gen-Knockdown zu einer unverzichtbaren Technik in der funktionellen Genforschung von P. americana. Das vorliegende Protokoll beschreibt die RNAi-Operationstechniken in P. americana. Das Protokoll umfasst (1) die Auswahl des P. americana in den richtigen Entwicklungsstadien, (2) die Vorbereitung auf die Injektionseinstellung, (3) die dsRNA-Injektion und (4) die Erkennung der Gen-Knockdown-Effizienz. RNAi ist ein mächtiges umgekehrtes genetisches Werkzeug in P. americana. Die Mehrheit der P. americana-Gewebe ist empfindlich gegenüber extrazellulärer dsRNA. Seine Einfachheit ermöglicht es Forschern, schnell dysfunktionale Phänotypen unter einer oder mehreren gezielten dsRNA-Injektionen zu erhalten, so dass Forscher das P. americana besser für Entwicklungs- und metamorphe Studien verwenden können.

Abbildung 1 zeigt eine erfolgreiche Injektion. Die Mikroinjektionsspritze mit einer Mikrodurchmessernadel sollte horizontal auf den Booster gelegt werden (Abbildung 1A). Die Nadel wird über den Spalt zwischen zwei abdominalen Somiten horizontal gegen die Epidermis eingeführt (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit in den Bauch von P. americana gelangt. Der zu steile Winkel der Nadel schädigt die in...

Das vorliegende Protokoll beschreibt Schritt-für-Schritt-Richtlinien für die RNAi-Operationstechniken in P. americana.

Anwendungen der RNA-Interferenz in amerikanischen Kakerlaken

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

Das Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, amerikanische Kakerlaken zu studieren. Ein häufiger Hygieneschädling und ein nützliches Insekt für die traditionelle chinesische Medizin. Es wird helfen, die molekularen Mechanismen mehrerer Lebensaktivitäten amerikanischer Kakerlaken zu erforschen, indem bestimmte Gene niedergeschlagen werden.Der Hauptvorteil dieser Technologie ist, dass sie Gene in amerikanischen Kakerlaken oder anderen ähnlichen Insekten niederschlagen kann, die nicht für die Genbearbeitung geeignet sind. Diese Technologie kann verwendet werden, um verschiedene Bereiche wie die genetische und epigenetische Regulation, den Entwicklungsprozess von Geweben, die Regeneration von Anhängseln, das Paarungsverhalten und andere interessante Seiten der amerikanischen Kakerlake zu erforschen. Diese Technologie ist einfach zu bedienen und vielseitig.Wir empfehlen, die Tiere während der DSRA-Injektionsbehandlung gesund zu halten. Ich glaube, dass Anfänger diese Technik nach mehreren Übungssitzungen leicht beherrschen können. Trennen Sie zunächst die geschlüpften Nymphen mit einem vier Millimeter großen Öffnungssieb von den Ootheken.Wählen Sie die weiße, frisch gemälzte P.americana mit einer Glasröhre aus. Legen Sie die P.americana in neue Behälter und warten Sie auf das richtige Stadium der Behandlung. Im Reaktionssystem fügen Sie 10 Mikroliter T7 2X-Puffer, 2 Mikroliter des T7 Express-Enzymmixes und zwei Mikrogramm PCR-Produkt hinzu.Schließlich machen Sie das Gesamtvolumen auf 20 Mikroliter mit doppelt destilliertem Wasser aus. Vorsichtig kopfüber manuell mischen und bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren, dann 70 Grad Celsius für 10 Minuten. Verdünnen Sie 4 Mikrogramm pro Mikroliter RNase A-Lösung mit DEPC-Wasser in einem Verhältnis von 1 zu 200.Dann fügen Sie dem System 1 Mikroliter einer Einheit pro Mikroliter RQ1 RNase Free Dnase und 1 Mikroliter verdünnte RNase A-Lösung hinzu. Bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Dann fügen Sie 10% des Gesamtvolumens von Natriumacetat und drei Volumina des Gesamtvolumens von Isopropanol hinzu.Vorsichtig auf dem Kopf stehend manuell mischen, dann fünf Minuten auf Eis legen und bei 13.000 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Als nächstes waschen Sie den Rückstand mit 75% Ethanol, mit 25% DEPC-behandeltem Wasser und zentrifugieren Sie dann bei 13.000 g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.Überstände wieder entfernen, das Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Anschließend die doppelsträngige RNA mit etwa 100 Mikrolitern DEPC-Wasser auflösen und auf die Endkonzentration von 2 Mikrogramm pro Mikroliter verdünnen. Richten Sie das Programm in der Mikroinjektionspumpe ein, um sicherzustellen, dass das Volumen jeder Injektion konsistent ist.Dann reinigen Sie die Spritze, indem Sie sie 8 bis 10 Mal mit DEPC-Wasser füllen. Installieren Sie die 10-Mikroliter-Spritze auf der Mikroinjektionspumpe. Starten Sie dann die Pumpe und füllen Sie die Spritze mit 10 Mikrolitern doppelsträngiger RNA-Lösung.Anästhesieren Sie die Kakerlaken mit Kohlendioxid, nehmen Sie sie dann vorsichtig mit einer Pinzette auf und bringen Sie die Kakerlake von Hand in Richtung der Nadel. Als nächstes führen Sie die Nadel über den Spalt zwischen zwei abdominalen Somiten horizontal gegen die Epidermis ein. Injizieren Sie die doppelsträngige RNA-Lösung in die Kakerlake und stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze so nah wie möglich an der Epidermis ist, um eine Schädigung der inneren Organe zu vermeiden.Zum Schluss die Nadelspitze herausziehen. Geben Sie die injizierten Kakerlaken in saubere Bioassay-Behälter. Warten Sie etwa 10 bis 20 Minuten, damit sie sich von den Auswirkungen von Kohlendioxid erholen können.Beschriften Sie die Behälter mit dem Injektionsdatum, der Art und der Dosis der doppelsträngigen RNA und dem Alter der P.americana. Ddc- oder DOPA-Decarboxylase- und Dpp- oder decapentaplegische Gene wurden als zwei Beispiele ausgewählt, um den Phänotyp der gemälzten Kakerlaken nach doppelsträngiger RNA-Injektion zu beobachten, und dsMocK, das kein Ziel bei den Tieren hat, wurde als Negativkontrolle genommen. Die RNAi-Effizienz wurde mittels qRT PCR nachgewiesen.Die Gene wurden signifikant mit einem P-Wert von weniger als 0,01 für dsDdc und weniger als 0,05 für dsDpp niedergeschlagen. P.americana mit Knockdown-DDC-Genen hatte die weiße Epidermis aufgrund einer blockierten Melanisation. Im Experiment mit dsDpp-Injektionen störte die RNAi die Regeneration der Gliedmaßen.Die Insekten sollten gesund sein und ohne Schaden injiziert werden. Diese Technologie bietet eine einfache Möglichkeit, Genfunktionen für Insekten zu erforschen, die nicht geneditiert werden können, wie z.B. amerikanische Kakerlaken.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

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