Name: Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Erfahren Sie einen robusten Kryo-EM-Workflow mit cryoSPARC, RELION und Scipion zur hochaufgelösten Strukturbestimmung von Makromolekülen am Beispiel des Adeno-assoziierten Virus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Carlos Oscar Sorzano für die Hilfe bei der Installation von Scipion3 und Kilian Schnelle und Arne Moeller für die Hilfe beim Datentransfer zwischen verschiedenen Verarbeitungsplattformen. Ein Teil dieser Forschung wurde durch den NIH-Zuschuss U24GM129547 unterstützt und am PNCC an der OHSU durchgeführt und über EMSL (grid.436923.9), eine vom Office of Biological and Environmental Research gesponserte DOE Office of Science User Facility, zugänglich gemacht. Diese Studie wurde durch ein Start-up-Stipendium der Rutgers University an Arek Kulczyk unterstützt.

<ol><li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li>
<li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li>
<li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li>
<li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cisTEM%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383(2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li>
<li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XMIPP%3A+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li>
<li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cryo-EM+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li>
<li>Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020).</li>
<li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topaz-Denoise%3A+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019).</li>
<li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018).</li>
<li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li>
<li>Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019).</li>
<li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li>
<li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MonoRes%3A+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li>
<li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li>
<li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li>
<li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV-DJ%29-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194(2020).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166(2018).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Artikel stellen wir einen robusten SPA-Workflow für die Kryo-EM-Datenverarbeitung über verschiedene Softwareplattformen hinweg vor, um hochauflösende 3D-Rekonstruktionen zu erreichen (Abbildung 1). Dieser Workflow ist auf eine Vielzahl von biologischen Makromolekülen anwendbar. Die nachfolgenden Schritte des Protokolls sind in Abbildung 4 dargestellt, einschließlich Filmvorverarbeitung, Partikelkommissionierung und -klassifizierung sowie mehrerer Metho...

Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Einzelpartikelanalyse (SPA) ermöglichen die Strukturbestimmung einer Vielzahl von biomolekularen Baugruppen in ihrem hydratisierten Zustand und helfen, die Rolle dieser Makromoleküle im atomaren Detail zu beleuchten. Verbesserungen in der Mikroskopoptik, Computerhardware und Bildverarbeitungssoftware haben es ermöglicht, Strukturen von Biomolekülen mit einer Auflösung von mehr als 2 Å 1,2,3 zu bestimmen. Mehr als 2.300 Kryo-EM-Strukturen wurden 2020 in der Protein Data Bank (PDB) hinterlegt, verglichen mit 192 Strukturen im Jahr 20144, was darauf hindeutet, dass Kryo-EM für viele Strukturbiologen zur Methode der Wahl geworden ist. Hier beschreiben wir einen Workflow, der drei verschiedene SPA-Programme zur hochauflösenden Strukturfindung kombiniert (Abbildung 1).
Das Ziel von SPA ist es, 3D-Volumina einer Zielprobe aus verrauschten 2D-Bildern zu rekonstruieren, die von einem Mikroskopdetektor aufgenommen wurden. Detektoren sammeln Bilder als Filme mit einzelnen Bildern des gleichen Sichtfeldes. Um die Probe zu erhalten, werden Frames mit einer niedrigen Elektronendosis gesammelt und haben somit ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Darüber hinaus kann die Elektronenbelichtung eine Bewegung innerhalb der verglasten Kryo-EM-Gitter induzieren, was zu Bildunschärfe führt. Um diese Probleme zu überwinden, werden die Rahmen so ausgerichtet, dass sie die strahleninduzierte Bewegung korrigieren, und gemittelt, um eine Mikroaufnahme mit einem erhöhten SNR zu erhalten. Diese Mikroaufnahmen werden dann einer CTF-Schätzung (Contrast Transfer Function) unterzogen, um die Auswirkungen von Defokus und Aberrationen, die vom Mikroskop auferlegt werden, zu berücksichtigen. Aus den CTF-korrigierten Mikroaufnahmen werden einzelne Partikel ausgewählt, extrahiert und in 2D-Klassendurchschnitte sortiert, die unterschiedliche Orientierungen der Probe in Glaseis darstellen. Der resultierende homogene Satz von Partikeln wird als Input für die ab initio 3D-Rekonstruktion verwendet, um ein grobes Modell oder Modelle zu erzeugen, die dann iterativ verfeinert werden, um eine oder mehrere hochauflösende Strukturen zu erzeugen. Nach der Rekonstruktion werden strukturelle Verfeinerungen durchgeführt, um die Qualität und Auflösung der Kryo-EM-Karte weiter zu verbessern. Schließlich wird entweder ein Atommodell direkt von der Karte abgeleitet, oder die Karte ist mit atomaren Koordinaten ausgestattet, die an anderer Stelle erhalten wurden.
Verschiedene Softwarepakete sind verfügbar, um die oben beschriebenen Aufgaben zu erfüllen, einschließlich Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 und andere. Während diese Programme ähnlichen Verarbeitungsschritten folgen, verwenden sie verschiedene Algorithmen, um beispielsweise Partikel auszuwählen, anfängliche Modelle zu generieren und Rekonstruktionen zu verfeinern. Darüber hinaus erfordern diese Programme ein unterschiedliches Maß an Benutzerwissen und Eingriffen, da einige von der Feinabstimmung von Parametern abhängen, die als Hürde für neue Benutzer dienen können. Diese Diskrepanzen führen oft zu Karten mit inkonsistenter Qualität und Auflösung auf allen Plattformen14, was viele Forscher dazu veranlasst, mehrere Softwarepakete zu verwenden, um die Ergebnisse zu verfeinern und zu validieren. In diesem Artikel heben wir die Verwendung von cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 hervor, um eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion von AAV, einem weit verbreiteten Vektor für die Gentherapie15, zu erhalten. Die oben genannten Softwarepakete sind für akademische Benutzer kostenlos; cryoSPARC v3 und Scipion 3 benötigen Lizenzen.

<table><tbody><tr><td>CryoSPARC</td><td>Structura Biotechnologie Inc.</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr> <tr><td>CTFFIND 4</td><td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td><td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td><td></td></tr><tr><td>MotionCorr2</td><td>UCSF Macromolecular Structure Group</td><td>https://msg.ucsf.edu/software</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC</td><td>)http://www.phenix-online.org/</td><td></td></tr><tr><td>PyEM</td><td>University of California, San Francisco</td><td>https://github.com/asarnow/pyem</td><td></td></tr><tr><td>RELION</td><td>MRC Labor für Strukturbiologie</td><td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td><td></td></tr><tr><td>Scipion</td><td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td><td>http://scipion.i2pc.es/</td><td></td></tr> <tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF Ressource für Biocomputing, Visualisierung und Informatik</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td><td></td></tr></tbody></table>

ein robuster einzelteilchen-kryo-elektronenmikroskopie-verarbeitungs-workflow (kryo-em) mit cryosparc, relion und scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Jüngste Fortschritte sowohl in der Instrumentierung als auch in der Bildverarbeitungssoftware haben die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zur bevorzugten Methode für Strukturbiologen gemacht, um hochauflösende Strukturen einer Vielzahl von Makromolekülen zu bestimmen. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnung stehen neue und erfahrene Benutzer mehrere Software-Suiten zur Verfügung, die den gleichen grundlegenden Workflow rationalisieren: Filme, die von den Mikroskopdetektoren aufgenommen wurden, werden für die Schätzung der strahleninduzierten Bewegung und der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) korrigiert. Als nächstes werden Partikelbilder ausgewählt und aus gemittelten Filmbildern für die iterative 2D- und 3D-Klassifizierung extrahiert, gefolgt von 3D-Rekonstruktion, Verfeinerung und Validierung. Da verschiedene Softwarepakete unterschiedliche Algorithmen verwenden und unterschiedliche Fachkenntnisse erfordern, unterscheiden sich die von ihnen generierten 3D-Karten häufig in Qualität und Auflösung. So übertragen Benutzer regelmäßig Daten zwischen einer Vielzahl von Programmen für optimale Ergebnisse. Dieses Dokument bietet eine Anleitung für Benutzer zum Navigieren in einem Workflow durch die gängigen Softwarepakete: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, um eine nahezu atomare Auflösungsstruktur des Adeno-assoziierten Virus (AAV) zu erhalten. Wir haben zunächst eine Bildverarbeitungspipeline mit cryoSPARC v3 detailliert beschrieben, da die effizienten Algorithmen und die benutzerfreundliche GUI es den Benutzern ermöglichen, schnell zu einer 3D-Karte zu gelangen. Im nächsten Schritt verwenden wir PyEM und interne Skripte, um Partikelkoordinaten von der besten 3D-Rekonstruktion in cryoSPARC v3 zu RELION-3 und Scipion 3 zu konvertieren und zu übertragen und 3D-Karten neu zu berechnen. Schließlich skizzieren wir Schritte zur weiteren Verfeinerung und Validierung der resultierenden Strukturen durch die Integration von Algorithmen aus RELION-3 und Scipion 3. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie drei Verarbeitungsplattformen effektiv nutzen können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Datensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Wir haben eine umfassende SPA-Pipeline vorgestellt, um eine hochauflösende Struktur mit drei verschiedenen Verarbeitungsplattformen zu erhalten: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3. Abbildung 1 und Abbildung 4 fassen den allgemeinen Verarbeitungsworkflow zusammen, und in Tabelle 1 sind die Einschränkungsprotokolle aufgeführt. Diese Protokolle wurden bei der Verfeinerung einer 2,3 Å-Struktur von AAV verwendet, wodurch eine nahezu Nyquist-Auflös...

Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie ist die Methode zur strukturierten Bestimmung von Makromolekülen bei nahezu atomarer Auflösung. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnungen stehen mehrere Softwarepakete zur Verfügung, doch das Ergebnis auf 3D-Karten variiert oft in Qualität und Auflösung aufgrund der Unterschiede in den Algorithmen, die bei Berechnungen angewendet werden. Daher ist die Verwendung einer Kombination verschiedener Programme oft von Vorteil, um die optimalen Ergebnisse zu erzielen.Dieses Protokoll führt Benutzer durch die Navigation im Workflow über drei verschiedene Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen: CryoSPARC, RELION und Scipion. Wir werden zeigen, wie man diese Pipeline nutzen kann, um eine hochauflösende Struktur des Adeno-assoziierten Virus zu erhalten, das ein weit verbreiteter Vektor für die Gentherapie ist. Nachdem Sie CryoSPARC v3 in einem Webbrowser geöffnet und den Arbeitsbereich für das Projekt erstellt haben, navigieren Sie zum neuen Arbeitsbereich und öffnen Sie den Job Builder im rechten Bereich.Klicken Sie auf Filme importieren und geben Sie den Filmpfad und den Referenzdateipfad an. Legen Sie dann die Erfassungsparameter fest. Klicken

a-robust-single-particle-cryo-electron-microscopy-cryo-em-processing

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Verarbeitung von Kryo-EM-Bildern mit der Software-Suite SPHIRE vor. Das vorliegende Protokoll kann für fast alle Einzelteilchen-EM-Projekte angewendet werden, die auf eine nahezu atomare Auflösung abzielen.

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Die Einzelpartikelanalyse in der Kryo-Elektronenmikroskopie ist eine der wichtigsten Techniken, um die Struktur biologischer Ensembles mit hoher Auflösung zu bestimmen. Scipion bietet die Werkzeuge, um die gesamte Pipeline zu erstellen, um die vom Mikroskop erfassten Informationen zu verarbeiten und eine 3D-Rekonstruktion der biologischen Probe zu erreichen.

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie erfordert ein geeignetes Softwarepaket und eine benutzerfreundliche Pipeline für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. Hier präsentieren wir die Anwendung eines vollautomatischen Bilderfassungssoftwarepakets, Latitude-S, und einer praktischen Pipeline zur Datenerfassung von vitrifizierten Biomolekülen unter niedrig dosierten Bedingungen.

Benutzerfreundliche Datenerfassungssoftware mit hohem Durchsatz und vollautomatischer Datenerfassung für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein verallgemeinertes und einfach zu implementierendes Schema für die Datenerfassung von gekippten Einzelpartikeln in Kryo-EM-Experimenten. Ein solches Verfahren ist besonders nützlich, um eine qualitativ hochwertige EM-Karte für Proben zu erhalten, die aufgrund der Einhaltung der Luft-Wasser-Grenzfläche unter einer bevorzugten Orientierungsverzerrung leiden.

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Das Multi-Grid-Screening der Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist oft ein langwieriger Prozess, der stundenlange Aufmerksamkeit erfordert. Dieses Protokoll zeigt, wie Sie eine Standard-Leginon-Sammlung und Smart Leginon Autoscreen einrichten, um diesen Prozess zu automatisieren. Dieses Protokoll kann auf die meisten KryoEM-Löchrigfoliengitter angewendet werden.

Kryo-Elektronenmikroskopie-Screening-Automatisierung über mehrere Gitter hinweg mit Smart Leginon

Eine fortschrittliche Partikelauswahlmethode für Kryo-EM, nämlich CryoSieve, verbessert die Auflösung der Dichtekarte, indem sie einen Großteil der Partikel in den endgültigen Stapeln entfernt, wie ihre Anwendung auf einem realen Datensatz zeigt.

Verbesserung der Dichtekarten durch Entfernen der Mehrheit der Partikel in den finalen Stacks der kryogenen Elektronenmikroskopie mit Einzelpartikeln

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines schnellen Gitterherstellungsgeräts sowohl für die schnelle Gitterherstellung als auch für das schnelle Mischen und Einfrieren, um zeitaufgelöste Experimente durchzuführen.

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

Dieses Manuskript skizziert die Blot-and-Plunge-Methode zum manuellen Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Elektronenmikroskopie mit einem Partikel.

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Erfahren Sie einen robusten Kryo-EM-Workflow mit cryoSPARC, RELION und Scipion zur hochaufgelösten Strukturbestimmung von Makromolekülen am Beispiel des Adeno-assoziierten Virus.

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Weitere Videos entdecken