Protokoll für menschliche Blastoide, die die Entwicklung und Implantation von Blastozysten modellieren

Die Forschung an menschlichen Embryonen ist durch ihre geringe Verfügbarkeit und ethische Bedenken begrenzt, so dass die Gewinnung individueller Modelle, die die frühe menschliche Entwicklung originalgetreu reproduzieren, den wissenschaftlichen und medizinischen Fortschritt unterstützen würde. Die Fähigkeit dieser Technik, die menschliche Entwicklung vorherzusagen, hängt von ihrer Fähigkeit ab, die Sequenzen der Blastozystenzellbestimmung und der Morphogenese entsprechend der Entwicklungssequenz und dem Entwicklungstempo effektiv zu reproduzieren, und eine solche Modellierung würde die Bildung von Zellen sicherstellen, die das Blastozystenstadium wirklich widerspiegeln. In Zukunft können humane Blastoide verwendet werden, um therapeutische Ziele zu identifizieren und zur präklinischen Modellierung beizutragen, beispielsweise zur Verbesserung eines In-vitro-Fertilisationsmediums oder zur Entwicklung nicht-hormoneller Kontrazeptiva.

Das Verfahren wird von Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer und Giovanni Sestini demonstriert. Bereiten Sie zunächst die PXGL-Medien, N2B27-Basalmedien, Waschpuffer, PBS und Aggregationsmedien vor und erwärmen Sie sie. Schließen Sie MEFs aus der hPSC-Suspension für die Bildung von Blastoiden aus.

Für den MEF-Ausschluss bereiten Sie eine gelatinebeschichtete Platte vor, indem Sie einen Milliliter 0,1% Gelatine in die Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen geben. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 30 bis 90 Minuten. Um die Zellen zu ernten, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit einem Millimeter PBS.

Fügen Sie 500 Mikroliter Zellablösungslösung zu jeder Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Dissoziation von Kolonien in einzelne Zellen zu verfolgen. Verdünnen Sie die Zellablöselösung mit einem Milliliter Waschpuffer.

Sammeln Sie die Zellen von der Platte, indem Sie fünf bis 10 Mal vorsichtig pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr. Drehen Sie die Zellen bei 200 RCF für vier Minuten herunter.

Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 1,5 Milliliter PXGL-Medium in jedem Well. Samen Sie die Zellen auf den mit Gelatine beschichteten Platten für den MEF-Ausschluss aus und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 60 bis 90 Minuten. Sobald die naiven Zellen für den MEF-Ausschluss ausgesät sind, entfernen Sie das PBS aus MicroWells und gleichen Sie die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern basalem N2B27-Medium für jeden MicroWell-Chip aus und inkubieren Sie für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Sammle den Überstand, der die nicht angehängten naiven Zellen enthält. Übertragen Sie es in eine 15-Milliliter-Röhre und drehen Sie die Zellen bei 200 RCF für vier Minuten herunter. Verwerfen Sie die Medien und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter N2B27-Basalmedien.

Zählen Sie die Zellen mithilfe von Objektträgern zum Zählen von Zellen. Drehen Sie die Zellen bei 200 RCF für vier Minuten herunter. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie eine angemessene Menge an N2B27-Medien hinzu, die 10 Mikromolar Y27632 enthalten, um eine Zelldichte von 30.000 Zellen pro 50 Mikroliter zu erhalten.

Entfernen Sie das Medium aus den äquilibrierten MicroWell-Arrays und fügen Sie 25 Mikroliter N2B27-Medien mit 10 Mikromolaren Y27632 hinzu. Fügen Sie 50 Mikroliter Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, damit die Zellen in den Boden des MicroWell fallen können. Dann fügen Sie 125 Mikroliter N2B27-Medium hinzu, ergänzt mit 10 Mikromolar Y27632.

Innerhalb von 24 Stunden werden Aggregate naiver hPSCs auf dem MicroWell-Chip beobachtet. Initiieren Sie die Blastoidbildung, indem Sie das PALY-Medium vorbereiten. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius vorwärmen.

Entfernen Sie das Aggregationsmedium und fügen Sie den MicroWells 200 Mikroliter vorgewärmtes PALY-Medium hinzu. Legen Sie die Zellkulturplatte wieder in einen hypoxischen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Medienwechsel am ersten Tag.

Entfernen Sie am zweiten Tag das PALY-Medium und fügen Sie 200 Mikroliter N2B27-Medium hinzu, ergänzt mit LPA und 10 Mikromolar Y27632. Wiederholen Sie den Medienwechsel am dritten Tag. Die vollständige Blastoidbildung erfolgt am vierten Tag.

Bereiten Sie naive hPSC-Zellsuspension für die Blastoidbildung vor, wie zuvor beschrieben. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie eine angemessene Menge an N2B27-Medien hinzu, die 10 Mikromolar Y27632 enthalten, um die Zelldichte von 70 Zellen pro 100 Mikroliter des Mediums zu erhalten. Um Zellen am Boden der Vertiefungen zu gruppieren, zentrifen Sie die Platte bei 200 RCF für zwei Minuten bei Raumtemperatur.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter hypoxischen Kulturbedingungen. Innerhalb von 24 Stunden werden Aggregate von naiven hPSCs an den Bohrlöchern beobachtet. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitetes und vorgewärmtes zweifaches PALY-Medium zu den Vertiefungen hinzu.

Legen Sie die Zellkulturplatte wieder in einen hypoxischen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entsorgen Sie nach 24 Stunden die Hälfte des Mediums und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter vorgewärmtes PALY-Medium. Wiederholen Sie den Schritt bis zum vierten Tag.

Bereiten Sie naive HPSC-Zellsuspension für die Troposphärenbildung vor, wie zuvor beschrieben. Sobald sich nach 24 Stunden Aggregate naiver HPSCs gebildet haben, tauschen Sie das Aggregationsmedium mit PALY ohne LIF aus, ergänzt durch drei mikromolare SC144, um Trophosphären zu bilden, die das frühe Trophektoderm darstellen. Um Trophosphären zu bilden, die reifes Trophektoderm darstellen, tauschen Sie das Aggregationsmedium mit PALY aus, ergänzt durch zwei mikromolare XMUMP1.

Aktualisieren Sie das Medium täglich. Die vollständige Trophosphärenbildung erfolgt am vierten Tag. Um die Zellzustände zu bewerten, vergleichen Sie die transkriptomischen Daten von Blastoid- und Trophosphären mit den entsprechenden Kontrollen, einschließlich postimplantationsähnlicher humaner Trophoblast-Stammzellen.

Naive hPSCs, die in PXGL kultiviert wurden, waren aggregierte und kavitierte Strukturen, die zwischen 48 und 72 Stunden nach der PALY-Induktion entstanden und innerhalb von 96 Stunden einen Durchmesser von 150 bis 250 Mikrometern erreichten. Basierend auf morphometrischen Parametern und dem Vorhandensein der drei Linien erreichte die Induktionseffizienz 70 bis 80% Trophosphären wurden mit einer Effizienz von 50 bis 60% innerhalb von 96 Stunden nach der Induktion gebildet. Die Blastoidbildung war in kommerziell erhältlichen Ultra-Low-Attachment-96-Well-Platten unter optimierten Induktionsbedingungen erfolgreich.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie wurde verwendet, um den Zustand der blastoiden Zellen weiter zu charakterisieren. Zellen zeigen deutlich reproduzierbare Clustering-Profile, unabhängig von den Parametern, die für die Clusterung und Visualisierung von Daten verwendet werden, was es ermöglichte, die drei Blastozystenlinien sicher zu unterscheiden. Zwischen 24 und 60 Stunden bilden die pluripotenten PXGL-Stammzellen Analoga des Epiblasten und des Trophektoderms.

Dann bilden sich zwischen 60 und 96 Stunden Analoga des polaren Trophektoderms und des primitiven Endoderms. Dies ist die Reihenfolge der Spezifikation innerhalb der Blastozyste, so dass Blastoide die Entwicklungssequenz der Linienspezifikation rekapitulieren. Die Zusammenführung von Blastoid-Datensätzen mit dem Referenzdatensatz von Zellen, die aus Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien isoliert wurden, zeigte, dass 97% der Zellen aus Blastoiden mit den Blastozystenzellen gruppiert waren, aber nicht mit Zellen aus Postimplantationsembryonen.

Unabhängige Analysen bestätigten, dass die Stammzellen im Laufe der Zeit Zellen bildeten, die zwischen dem fünften Tag und dem 7.5. Tag transkriptionell mit den Zellen menschlicher Embryonen übereinstimmten. Dies ist in der Tat das Entwicklungsstadium, in dem sich die menschliche Blastozyste bildet. Sie bestätigten auch, dass mehr als 95% der Zellen in Blastoiden ein Transkriptom haben, das den drei Zelllinien der Blastozysten entspricht, während 3% der Zellen außerhalb des Ziels lagen und mit den Postimplantationsstadien übereinstimmten.

Bemerkenswert ist, dass unsere anfänglichen 2D-Kulturen auch etwa 5% der Zielzellen ausmachen. Das äquivalente Entwicklungsstadium kann auch visualisiert werden, indem die Expressionsmuster spezifischer Marker wie CDX2 für das Blastozystentrophektoderm und PRMD14 für den Blastozysten-Epiblasten betrachtet werden. Die Qualität der anfänglichen PXGL-Kultur ist absolut entscheidend, und die Anzahl der Zellen innerhalb des ursprünglichen Aggregats ist ebenfalls kritisch und kann mit MicroWells gesteuert werden.

Die Gesamtgröße des zellulären Aggregats nach 24 Stunden sollte etwa 50 bis 70 Mikrometer betragen. Die effiziente Bildung von Phase-Vollblastoiden ebnet den Weg für die Untersuchung der Prozesse der Implantation und Postimplantationsentwicklung des menschlichen Embryos.