Name: Protokoll für menschliche Blastoide, die die Entwicklung und Implantation von Blastozysten modellieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Erfahren Sie, wie menschliche Blastoide mit 70-80% Effizienz generiert werden, um frühe Embryonalentwicklung und Implantation zu modellieren. Diese Methode nutzt naive hPSCs und sequenzielle Medienwechsel für präklinische Anwendungen.

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Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert (ERC-Co-Finanzhilfevereinbarung Nr. 101002317 "BLASTOID: a discovery platform for early human embryogenesis"). H.H.K. wird gefördert durch den Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF), Lise Meitner Programm M3131-B. Wir danken Yasuhiro Takashima für die gemeinsame Nutzung der H9- und H9-GFP-Zelllinien und Austin Smith, Peter Andrews und Ge Guo für die gemeinsame Nutzung der HNES1-, Shef6-, niPSC 16.2b- und cR-NCRM2-Zelllinien. Wir danken Hossein Baharvand für die gemeinsame Nutzung der Endometriumorganoide. Wir danken Joshua M. Brickman für die gemeinsame Nutzung der RNA, die aus PrE-differenzierten Zellen und nEND-Zellen isoliert wurde. Wir danken Shankar Srinivas für die Weitergabe der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten des perigastrulären Embryos. Wir danken Aleksand Bykov und Luisa Cochella für die technische Unterstützung bei der Vorbereitung der SMARTSeq2-Bibliothek. Wir danken der NGS-, Biooptik- und Stammzelleinrichtung bei IMBA für die wichtige Unterstützung.

Das Institut für Molekulare Biotechnologie der Österreichischen Akademie der Wissenschaften hat eine Patentanmeldung EP21151455.9 eingereicht, in der die Protokolle für die menschliche Blastoidbildung und den Blastoid-Endometrium-Interaktionsassay beschrieben werden. HK, AJ, HHK und NR sind die Erfinder dieses Patents. Alle anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

In der vorliegenden Studie zeigen wir Schritt für Schritt, wie man menschliche Blastoide mit hoher Effizienz mit einem einfachen und robusten Protokoll etabliert. Nach der Aggregation naiver PXGL-hPSCs und ihrer dreifachen Hemmung bilden sich Blastoide effizient (> 70%) und erzeugen sequentiell die 3 Blastozystenanaloga innerhalb von 4 Tagen. Einschränkungen in der Effizienz und Qualität der Blastoide (z. B. Vorhandensein von Off-Target-Zellen) können auftreten, wenn der Anfangszustand suboptimal ist. Bemerkenswert ist, dass wir gemessen haben, dass PXGL-hPS-Zellen etwa 5% der Zellen enthalten, die die Postimplantationsstadien widerspiegeln. Diese Zellen könnten die Bildung von hochwertigen Blastoiden einschränken. Neben dem anfänglich naiven PXGL-Zustand, der den Blastozysten-Epiblasten widerspiegelt, ist ein weiterer entscheidender Faktor das Medium, das für die Blastoidebildung verwendet wird. Um schnell Blastozysten-ähnliche Zellen zu bilden und die Bildung von Off-Target-, postimplantationsähnlichen Zellen zu verhindern, schlagen wir vor, dass die Hemmung der dreifachen Signalwege (Hippo, ERK, TGF-β) unerlässlich ist. Während verschiedene Zelllinien unterschiedliche Ausbeuten an Blastoid bei ERK/TGF-β-Hemmung ergeben (im Allgemeinen etwa 10%-20%), führt die Exposition gegenüber LPA zur Bildung einer gleich hohen Blastoidausbeute über alle Zelllinien hinweg, wobei strenge morphometrische und Abstammungsspezifikationskriterien verwendet werden. LPA wirkt möglicherweise auf die Hemmung des Hippo-Signalwegs, der eine entscheidende Rolle bei der ersten Linientrennung zwischen Epiblast- und Trophektoderm-Linien bei Maus und Menschspielt 8,51. Die signifikante Verbesserung der Blastoideffizienz durch LPA deutet darauf hin, dass die Hippo-Signalweg-vermittelten inner-äußeren Zellspezifikationsmechanismen, die in der Blastozyste im Spiel sind, während der Blastoidbildung kooptiert werden. Eine aktuelle Einschränkung liegt in der Tatsache, dass wir aufgrund einer Suboptimalität der Protokolle, die zur Kultivierung menschlicher Blastozysten oder Blastoide am zeitäquivalenten Tag 7-13 (nach Blastozysten- / Blastoidebildung) verwendet werden, nicht in der Lage sind zu beurteilen, inwieweit wir die Entwicklung nach der Implantation richtig modellieren können.
Die Analyse des transkriptomischen Zustands der blastoiden Zellen kann leicht mit scRNAseq, geeigneten Referenzkarten und bioinformatischen Methoden erreicht werden. Zuvor zeigte die transkriptomische Analyse, dass in PXGL kultivierte hPSCs dem Blastozysten-Epiblasten im Vergleich zum primierten Zustand ähnlicher sind. Einschränkungen bei der Analyse der Daten können auftreten, wenn die Referenzkarte nur Zellen im Blastozystenstadium umfasst. Die Referenzkarte sollte Zellen enthalten, die aus postimplantativen Embryonen stammen, um das Vorhandensein potenzieller Off-Target-Zellen zu beurteilen. Um blastoide Zellen zu vergleichen, wäre in Zukunft eine Referenzkarte mit allen Geweben des menschlichen Konzeptus vor und nach der Implantation äußerst wertvoll. Darüber hinaus würden Multi-Omics-Einzelzellreferenzkarten, z. B. einschließlich Transkriptom, Chromatinzugänglichkeit und DNA-Methylierung, weiter helfen. Schließlich würden standardisierte bioinformatische Methoden zur quantitativen Bewertung der Ähnlichkeiten zwischen Zellen aus Embryomodellen und Referenzkonzepten und zur positiven Identifizierung von Off-Target-Zellen dazu beitragen, die Ergebnisse unvoreingenommen zu analysieren und zu vergleichen.
Insgesamt besitzen Blastoide, die durch dreifache Hemmung von Hippo-, TGF-β- und ERK-Signalwegen gebildet werden, die vier Merkmale 1) hocheffiziente Morphogenese, 2) korrekte Abfolge der Linienspezifikation, 3) hohe Reinheit von Blastozysten-ähnlichen Zellen auf Transkriptomebene, 4) Fähigkeit, die Periimplantationsentwicklung zu modellieren. Diese Eigenschaften von Blastoiden erleichtern den Aufbau von Hypothesen über die Entwicklung und Implantation von Blastozysten, rekapitulieren jedoch nicht frühere Stadien der Embryonalentwicklung. Im Gegensatz zur begrenzten Zugänglichkeit und Vielseitigkeit der menschlichen Blastozyste sind Blastoide für genetische und medikamentöse Screenings für die funktionellen Untersuchungen der Blastozystenentwicklung und -implantation zugänglich. In Zukunft könnte ein solches Grundwissen dazu beitragen, die Formulierung von IVF-Medien zu verbessern, Verhütungsmittel nach der Befruchtung zu entwickeln und die frühe Schwangerschaft besser zu bewältigen.

Ein Mangel an experimentellen Modellen hat das Verständnis der frühen menschlichen Embryogenese eingeschränkt. Das aktuelle Wissen über humanspezifische Aspekte der Embryonalentwicklung stammt aus überschüssigen In-vitro-Fertilisationsembryonen (IVF), die für die Forschung gespendet wurden. Die begrenzte Verfügbarkeit, die Schwierigkeiten experimenteller Manipulationen und die unterschiedliche Qualität der Embryonen behindern jedoch wissenschaftliche Untersuchungen. Im Gegenteil, ein originalgetreues In-vitro-Modell menschlicher Embryonen würde komplexe experimentelle Manipulationen ermöglichen und damit eine ethische Gelegenheit bieten, die Forschung an menschlichen Embryonenzu ergänzen 1,2,3,4. Ein zuvor entwickeltes Modell von Maus-Blastozysten kombinierte embryonale Stammzellen der Maus und Trophoblast-Stammzellen5. In diesem detaillierten Protokoll wird ein Verfahren zur Generierung eines Modells der menschlichen Blastozyste aus naiven pluripotenten Stammzellen beschrieben, das den Kriterien der elementaren Blastozyste treu ist6.
Vier Kriterien für menschliche Blastoide. In einem Versuch, eine standardisierte Definition von menschlichen Blastoiden zu etablieren, schlagen wir hier vier minimale Kriterien vor. Obwohl diese Kriterien nicht erschöpfend sind, könnten sie als Grundlage für die Bewertung der Parameter dienen, die die Bildung menschlicher Blastoide ermöglichen (Abbildung 1A). (1) Blastoide sollten sich in Bezug auf die Morphologie und die Erzeugung der Analoga der drei Linien, nämlich Epiblast (Epi), Trophektoderm (TE) und primitives Endoderm (PrE), effizient bilden. Ineffizienz weist wahrscheinlich auf einen unzureichenden Anfangszellzustand und/oder einen unzureichenden Kulturzustand hin (z. B. Blastoidmedium). (2) Blastoide sollten Analoga der drei Linien entsprechend der Entwicklungssequenz (Epi/TE zuerst, PrE/polarTE zuletzt)7,8 und Timing (Induktion ~ 3 Tage; embryonale Tage 5-7)7,9 erzeugen. (3) Blastoide sollten Analoga des Blastozystenstadiums bilden, nicht jedoch von Postimplantationsstadien (z. B. Epiblasten-, Trophoblasten- oder Amnionzellen nach der Implantation). (4) Schließlich sollten Blastoide in der Lage sein, funktionelle Merkmale der Blastozystenimplantation und -entwicklung zu rekapitulieren. Unter Verwendung dieses Protokolls bilden sich menschliche Blastoide effizient unter Verwendung mehrerer Zelllinien (>70%), sind in der Lage, die Blastozysten-Zellanaloga nacheinander und innerhalb von 4 Tagen zu erzeugen, und die Analoga sind dem Blastozystenstadium transkriptionell ähnlich (>96% basierend auf mehreren Analysen)6,10,11. Schließlich erzeugen Blastoide robust die embryonal-abembryonale Achse, die es ihnen ermöglicht, mit hormonell stimulierten Endometriumzellen durch die polare Region zu interagieren und die Linien bei längerer Kultur robust zu erweitern (Zeitäquivalent: Embryonaler Tag 13).
Die Bedeutung des anfänglichen Zellzustands. Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) können in verschiedenen Zuständen stabilisiert werden, die versuchen, präzise Entwicklungsstadien zu erfassen. Diese Zustände werden durch Kulturbedingungen aufrechterhalten, die, obwohl sie immer noch suboptimal sind, die Zellen in einem Präimplantations- (~ embryonale Tage 5-7) oder postimplantationsähnlichen (~ embryonalen Tage 8-14) Epiblastenstadium12 einschränken. Die transkriptomische Analyse zeigte, dass hPSCs, die in PD0325901, XAV939, Gö6983 und Leukämiehemmerfaktor (LIF; als naive PXGL-hPSCs bezeichnet)13,14 kultiviert wurden, dem Blastozysten-Epiblasten ähnlicher sind als hPS-Zellen, die in Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 2 und Activin15 (als primierte hPS-Zellen 12 bezeichnet werden) und humanen erweiterten pluripotenten Stammzellen (hEPSCs)16 (siehe Analyse in Referenzen 17), 18,19). Dementsprechend passt das Transkriptom von primierten hPSCs am besten zu einem Postimplantations-/Prägastrulations-Cynomolgus-Affen-Epiblasten20. Zusätzliche molekulare Kriterien, wie Transposonexpression, DNA-Methylierung und X-Chromosom-Zustand, bestätigten, dass Variationen des naiven Zustands dem Blastozysten-Epiblasten im Vergleich zum präparierten Zustand 17,21 ähnlicher sind. Schließlich wurden Linien naiver hPSCs erfolgreich direkt aus Blastozysten unter Verwendung von PXGL-Kulturbedingungenabgeleitet 22.
Menschliche frühe Blastozystenzellen sind noch nicht gebunden. Die Spezifikation der murinen Linie erfolgt ab dem Morula-Stadium, das dem Blastozystenstadium23 vorausgeht. Im Gegenteil, Dissoziations- und Reaggregationsexperimente haben gezeigt, dass die menschlichen Trophektodermzellen früher Blastozysten noch nicht gebunden sind24. Dementsprechend hat die Analyse der Zellen menschlicher Blastozysten durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) gezeigt, dass die erste Linienspezifikation (Trophoblast/Epiblast) nach der Bildung der Blastozystenhöhle7 erfolgt. Diese aufgeschobene menschliche Spezifikation korreliert mit Beobachtungen, dass hPS-Zellen potent sind, um Trophoblasten25,26,27 zu bilden, wenn Maus-PSCs weitgehend an die Epiblastenlinie gebunden sind. Diese kombinierten Beobachtungen führten zu der Möglichkeit, dass naive hPS-Zellen ein Blastozystenstadium widerspiegeln und das Potenzial behalten, die drei Blastozystenlinien zu bilden. In letzter Zeit wurde vorgeschlagen, dass die Potenz von hPSCs zur Spezifizierung extraembryonaler Analoga während der Progression von naivem zu primiertem Zustand von Trophektoderm zu Amnion wechselt27. Daher ähneln naive hPS-Zellen eher dem Präimplantationsstadium 17,18,21 und haben eine erhöhte Fähigkeit, Trophoblasten zu bilden, verglichen mit primierten hPSCs27, hEPSCs 16 oder intermediären umprogrammierten Zuständen 28, die dazu neigen, Postimplantationsanaloga 10 zu bilden (Abbildung 1B ). Der anfängliche Zellzustand ist daher entscheidend für die Bildung der entsprechenden extraembryonalen Analoga. Obwohl eine gründliche Side-by-Side-Analyse der konvertierten Trophektoderm-Analoga noch aussteht, scheint ein naiver PXGL-Zustand, der die frühe Blastozyste widerspiegelt, wichtig zu sein, um High-Fidelity-Blastoide zu bilden.
Prompte Spezifikation und Morphogenese durch Signalweghemmung. Die Hemmung des Hippo-Signalwegs ist ein konservierter Mechanismus, der die Trophoblastenspezifikation bei Mäusen, Kühen und Menschen antreibt 9,29,30. Seit 2013 ist auch bekannt, dass die Hemmung des NODAL (A83-01) und der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK; PD0325901 oder gleichwertig) und die Aktivierung der Signalwege des bone morphogenetic protein (BMP) löst präparierte hPSCs aus, um das Transkriptionsnetzwerk zu aktivieren, das mit der Trophoblast-Linie 25,31,32,33,34 assoziiert ist. Darüber hinaus bestätigten kürzlich mehrere Berichte, dass die Hemmung sowohl des NODAL- als auch des ERK-Signalwegs und die Aktivierung von BMP die Trophoblastendifferenzierung von naiven hPSCs 25,31,32,33,34 erleichtern. Wenn schließlich die Trophoblastenspezifikation aus einem naiven Zustand heraus ausgelöst wird, rekapitulieren Zellen Aspekte des Entwicklungsverlaufs des Trophektoderms26. Selbsterneuernde Linien, die das Blastozystentrophektoderm widerspiegeln, wurden jedoch in vitro nicht stabilisiert. Nach der Trophoblastenspezifikation könnte die Induktion des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und der Wnt-Signalwege zusammen mit der HDAC-Hemmung das Fortschreiten der Entwicklung der Trophoblastenerleichtern 34,35 und die Zellen in Linien menschlicher Trophoblastenstammzellen (hTSCs) stabilisieren, die die Zytotrophoblasten nach der Implantationwiderspiegeln 18,35. Solche Linien können sowohl aus Blastozysten als auch aus Plazentageweben abgeleitetwerden 35.
Die zweite extraembryonale Linie, PrE genannt, wird nach Trophoblasten spezifiziert und stammt aus dem Epiblasten 7,9. Im Gegensatz zu murinem PrE36 wird angenommen, dass das menschliche Gegenstück unabhängig von der FGF-Signalisierung37,38 ist. Linien, die das extraembryonale Endoderm (als nEnd bezeichnet) widerspiegeln, wurden aus naiven hPS-Zellen durch Induktion von Signalwegen unter Verwendung von Aktivin A, Wnt und LIF39 gebildet. Im Gegensatz zu Embryo-Inhibitionsexperimenten wurde gezeigt, dass die ERK-Hemmung die Bildung solcher nEND-Zellen in vitro39 verhindert. Bisher wurden solche Linien nicht direkt von Blastozysten abgeleitet.
In letzter Zeit wurden Modelle des frühen Embryos durch die Kombination von Variationen der zuvor für hTSCs 35 und nEND-Zellen39 entwickelten Medien gebildet, wodurch Aktivatoren des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β), EGF und Wnt-Signalwege28,40 verwendet wurden. Diese Embryomodelle bilden sich mit geringer Effizienz (10% -20%) und bilden Zellen, die eher dem Post- als dem Präimplantationsstadium 10 ähneln, einschließlich Analoga des Epiblasten nach der Implantation, des Trophoblasten, des Amnions, der Gastrula, des mesodermalen Gewebes (~ embryonaler Tag 14) und der Zytotrophoblasten10. Im Gegenteil, eine dreifache Hemmung der Hippo-, ERK- und TGF-β-Signalwege steuert effizient die Bildung von Blastoiden, die Blastozysten-ähnliche Zellenumfassen 41. Zusammen mit dem anfänglichen Zellzustand schlagen wir vor, dass die Hemmung der Dreifachwege (Hippo, ERK, TGF-β) der zweite wesentliche Parameter für die Bildung von High-Fidelity-Blastoiden ist (Abbildung 1B).
Auswertung des Zellzustandes und des reflektierten Stadiums mittels scRNAseq. Die Zustände von Zellen, aus denen Blastoide bestehen, können durch scRNAseq-Analyse bewertet werden. Ihre transkriptionelle Ähnlichkeit mit bestimmten embryonalen Stadien kann allein mit Blastoidzellen und im Vergleich zu primierten hPS-Zellen oder hTSCs, die Postimplantationsstadien widerspiegeln, gemessen werden20,35. Die Durchführung von Clusteranalysen mit verschiedenen Definitionsebenen zeigt, wie Subpopulationen progressiv verschmelzen, wenn die Definition abnimmt, und zeigt so die Ähnlichkeiten der Cluster auf. Obwohl die Optimalität in der Anzahl der Cluster gemessen werden kann42, informiert hochauflösendes Clustering auch über das eventuelle Vorhandensein kleiner abnormaler Subpopulationen, beispielsweise in den Postimplantationsstadien10. Die Gene, die zwischen Clustern unterschiedlich exprimiert werden, können Informationen über ihre Analoga im Entwicklungsprozess liefern, indem sie die Expressionsniveaus von Referenzgensätzen bewerten, die stadienspezifische Abstammungslinien definieren. Dies ermöglicht die Messung der Anreicherung von blastoiden Subpopulationen entweder durch unüberwachte Entfernungskarten (z. B. unter Verwendung von Top-angereicherten Genen) oder durch Gen-Set-Enrichment-Analyse (GSEA)43. Unter Verwendung dieses Blastoid-Protokolls bilden sich nur drei Hauptcluster, die die drei Blastozystenlinien transkriptionell widerspiegeln. Ein Cluster umfasst sowohl die anfänglich naiven hPSCs als auch das Epiblastenanalogon der Blastoide. Die Analyse von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte die sequentielle Natur der Linienspezifikation (Trophoblasten beginnen innerhalb von 24 h und primitive Endodermzellen innerhalb von 60 h zu spezifizieren). Ein hochauflösendes Clustering erfasste eine Subpopulation von Zellen (3,2%), die Gene exprimieren, die für Embryonen im Gastrulationsstadium spezifisch sind (möglicherweise Mesoderm oder Amnion). Bemerkenswert ist, dass die anfänglichen naiven hPS-Zellen auch 5% der postimplantationsähnlichen Zellen umfassten, wie zuvor beschrieben44. In einer zweiten Analyse können blastoide Zellen in silico mit Referenzzellen verschmolzen werden, die in verschiedenen Stadien 45,46,47 aus Concepti isoliert wurden, um auf die Niveauäquivalenz zu schließen. Hier wurden Zellen aus Präimplantationskonzepten 45,46, in vitro kultivierten Blastozysten 45 und Embryonen im Gastrulationsstadium47 als Referenzpunkte verwendet. Mit diesem Protokoll wurde quantifiziert, dass die nicht übereinstimmenden blastoiden Zellen, die durch hochauflösendes Clustering aufgedeckt wurden, tatsächlich mit Postimplantationsmesoderm und Amnion gruppieren. In zukünftigen Schritten sollte das Transkriptom-Benchmarking durch die Analyse der Transposonexpression, der DNA-Methylierung und des X-Chromosom-Status ergänzt werden, die auch Orientierungspunkte der Entwicklungsstufen21 liefern.
Bewertung der Achsenbildung und anderer Funktionalitäten menschlicher Blastoide. Eine reife Blastozyste ist durch die Bildung der embryonal-abembryonalen Achsenmusterung Trophoblasten für die Implantation gekennzeichnet. Unter Verwendung dieses Blastoidprotokolls bildet sich eine Achse robust, die durch eine Reifung der proximalen Trophoblasten (z. B. NR2F2 + / CDX2-) veranschaulicht wird, die die Fähigkeit zur Bindung an Endometriumorganoidzellen nur dann erwerben, wenn sie hormonell stimuliert sind48,49. Der Vergleich mit Trophosphären, die nicht den Epiblasten bilden, zeigt, dass diese inneren Zellen angrenzende Trophoblasten zur Reife bringen, um die anfängliche Anheftung an das Endometrium zu vermitteln. Wenn sie in einem erweiterten Kulturmedium kultiviert werden, das für Cynomolgus-Affen-Blastozysten50 entwickelt wurde, dehnen sich alle drei Linien des Blastoides für sechs weitere Tage (Zeitäquivalent von Tag 13) konsequent aus, obwohl ihre Organisation dieses Entwicklungsstadium nicht widerspiegelt.
Die Implikation von hocheffizienten und hochgenauen menschlichen Blastoiden. Die Erhaltung von Entwicklungsprinzipien, die in Modellorganismen entdeckt wurden, ist aufgrund des eingeschränkten Zugangs und der technischen Schwierigkeiten bei der genetischen und physischen Manipulation im menschlichen Conceptus von Natur aus schwer zu testen. Ein hocheffizientes und hochgenaues Blastoid-Modell würde genetische und medikamentöse Hochdurchsatz-Screens ermöglichen, die die Grundlage wissenschaftlicher und biomedizinischer Entdeckungen bilden. Darüber hinaus würde die Einbeziehung komplexer genetischer Veränderungen zur Veränderung und Aufzeichnung biologischer Prozesse solche Studien ergänzen. Insgesamt schlagen wir vor, dass die dreifache Hemmung (Hippo, TGF-β, ERK) von naiven PXGL-hPSCs leitfähig für die effiziente Bildung von High-Fidelity-Humanblastoiden ist, die die vier minimalen Kriterien erfüllen. Die skalierbare und vielseitige Natur dieses Protokolls macht es geeignet, gezielte Hypothesen zu generieren, die dann mit menschlichen Blastozysten validiert werden können. Daher werden menschliche Blastoide die Verwendung von humanem Konzeptus für die In-vitro-Forschung nicht ersetzen, sondern könnten als leistungsfähige Möglichkeit dienen, die Forschung durch bisher unzugängliche experimentelle Ansätze im Herzen des wissenschaftlichen und biomedizinischen Entdeckungsprozesses zu lenken. Das Protokoll zeigt, wie man menschliche Blastoide bildet und auch, wie man die Zellen analysiert, die im Blastoid enthalten sind.

<table><tbody><tr><td>Neurobasale Medien</td><td>im Haus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>im Haus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X N2 Ergänzungen</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>50X B27 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>100X Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>im Haus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM 2-Mercaptoethanol</td><td>Thermofisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>100X Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albuminlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Medchem express</td><td>HY-10254</td><td></td></tr><tr><td>XAV-939</td><td>Medchem express</td><td>HY-15147</td><td></td></tr><tr><td>G&ouml; 6983</td><td>Medchem express</td><td>HY-13689</td><td></td></tr><tr><td>Humaner rekombinanter Leukämie-Hemmfaktor</td><td>im Haus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Medchem express</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>1-Oleoyllysophosphatidsäure (LPA)</td><td>Peprotech</td><td>2256236</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Medchem express</td><td>HY-10583</td><td></td></tr><tr><td>CMRL Medium</td><td>Gibco</td><td>21530027</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut-Serumersatz (KSR)</td><td>Thermofisher</td><td>10-828-028</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biozym</td><td>B423201</td><td>Lösung zur Zellablösung</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Thermofisher</td><td>A1413302</td><td>Wachstumsfaktor-Basalmembran-Extrakt</td></tr><tr><td>TROP2-Antikörper</td><td>R& D systems</td><td>MAB650</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&alpha; Antikörper</td><td>F& D systems</td><td>AF307</td><td></td></tr><tr><td>SC-144</td><td>Axon</td><td>2324</td><td></td></tr><tr><td>XMU-MP-1</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-100526</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td></td><td></td><td>Basalmembranmatrix</td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer Objektträger</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Objektträger für die Zellzählung</td></tr><tr><td>DAPI Färbelösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-570</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoll für menschliche blastoide, die die entwicklung und implantation von blastozysten modellieren

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

Ein Modell der menschlichen Blastozyste, die aus Stammzellen (Blastoid) gebildet wird, würde den wissenschaftlichen und medizinischen Fortschritt unterstützen. Seine Vorhersagekraft hängt jedoch von seiner Fähigkeit ab, die Sequenzen der Blastozystenentwicklung (Morphogenese, Spezifikation, Musterung) effizient, zeitnah und originalgetreu zu rekapitulieren und Zellen zu bilden, die das Blastozystenstadium widerspiegeln. Hier zeigen wir, dass naive humane pluripotente Stammzellen, die unter PXGL-Bedingungen kultiviert und dann für das Hippo dreifach gehemmt werden, Wachstumsfaktor- β und extrazelluläre signalregulierte Kinasewege effizient einer Morphogenese unterzogen werden, um Blastoide zu bilden (>70%). In Übereinstimmung mit dem Entwicklungstiming (~ 4 Tage) entrollen Blastoide die Blastozystensequenz der Spezifikation, indem sie Analoga des Trophoblasten und des Epiblasten erzeugen, gefolgt von der Bildung von Analoga des primitiven Endoderms und der polaren Trophoblasten. Dies führt zur Bildung von Zellen, die der Blastozyste ähnlich sind (>96%) und einer Minderheit von Postimplantationsanaloga. Blastoide strukturieren effizient, indem sie die embryonal-abembryonale Achse bilden, die durch die Reifung der Polarregion (NR2F2+) gekennzeichnet ist, die das spezifische Potenzial erwirbt, sich gerichtet an hormonell stimulierte Endometriumzellen zu binden, wie in utero. Ein solches menschliches Blastoid ist ein skalierbares, vielseitiges und ethisches Modell, um die menschliche Entwicklung und Implantation in vitro zu untersuchen.

Typischerweise sind naive hPSCs, die in PXGL kultiviert werden (Abbildung 2A), aggregierte und kavitierte Strukturen, die nach der PALLY-Induktion zwischen 48 und 72 h entstehen und innerhalb von 96 h einen Durchmesser von 150-250 μm erreichen (Abbildung 2B). Unter Verwendung optimaler (1) Seeding-Zellzahlen, (2) Dauer der Vorkulturaggregation mit N2B27 (0 bis 24 h), (3) Konzentration einzelner chemischer Komponenten (insbesondere LPA) und (4) Dauer der PALLY-Behandlung erreicht die Induktionseffizienz 70% -80%, wie basierend auf morphometrischen Parametern definiert (Gesamtgröße von 150-250 μm, einzelner regelmäßiger Hohlraum, einzelner innerer Zellcluster; Abbildung 2C,D) und das Vorhandensein der drei Abstammungslinien. Ein suboptimaler Anfangszellzustand und / oder Induktionsbedingungen führen zu einer weniger effizienten oder keiner Blastoidebildung. Um maximale Effizienz zu gewährleisten und nur Präimplantationsanaloga zu bilden, ist es entscheidend, eine hochwertige Kultur aus naiven PXGL-hPSCs zu verwenden. Dies kann beurteilt werden, indem mittels FACS der Prozentsatz der Zellen gemessen wird, die positiv auf die Oberflächenmarker SUSD2 (naiver Zustand) und CD24 (primierter Zustand) sind. Zusätzliche Oberflächenmarker, die spezifisch für die extraembryonalen Abstammungslinien außerhalb des Ziels sind (z. B. Amnion, extraembryonales Mesoderm), wären ebenfalls nützlich, sind aber nach unserem besten Wissen derzeit nicht verfügbar. Wenn die erhaltene Bildungseffizienz niedriger ist als die berichteten Ergebnisse, ist es wichtig, alle Komponenten des Blastoidmediums sorgfältig zu überprüfen, insbesondere LPA, das in PBS rekonstituiert wird und das als GPCR-Ligand im Vergleich zu synthetischen Molekülen, die in DMSO rekonstituiert werden, instabiler sein kann. In den meisten Fällen, auch wenn die Ausbeute nicht maximal ist, bestehen die kavitierten Strukturen immer noch aus den drei Blastozystenlinien. Die Entstehung von drei Blastozystenlinien und die Bildung einer embryonal-abembryonalen Achse kann durch die Immunfluoreszenzfärbung von Markern (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Abbildung 2E,G). Trophosphären, die nur aus TE bestehen, helfen, die Rolle der interzellulären Kommunikation weiter zu analysieren. Trophosphären können sich mit einer Effizienz von 50 % bis 60 % innerhalb von 96 h nach der Induktion bilden (Abbildung 2H,I). Die Blastoidbildung kann nicht nur in selbstgebauten Mikrotopf-Arrays, sondern auch in kommerziell erhältlichen Ultra-Low-Attachment-96-Well-Platten mit Optimierung der Induktionsbedingungen durchgeführt werden (siehe Protokoll und Abbildung 2J). Blastoide haben auch die Fähigkeit, sich für weitere 6 Tage weiterzuentwickeln, was dem Embryo des Tages 13 entspricht, mit In-vitro-Differenzierungsprotokoll (Abbildung 2K).
Um den Zellzustand von blastoiden Zellen weiter zu charakterisieren, muss die Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie eingesetzt werden. UMAP wird häufig angewendet, um eine Verteilung von Zellzuständen zu visualisieren, und es wird eine unbeaufsichtigte Clustering-Analyse durchgeführt, um die Nähe einzelner Zellzustände zu bewerten. Unterschiedliche Parameter in der Einzelzelldatenanalyse können beeinflussen, wie Zellen in den UMAPs dargestellt werden, was zu Clustern mit unterschiedlichen räumlichen und relativen Positionen und Formen führt (Abbildung 3A). In dieser Analyse zeigen Zellen jedoch deutlich reproduzierbare Clustering-Profile, unabhängig von den Parametern, die für die Durchführung des Clusterings und der Visualisierung der Daten verwendet werden, was es ermöglicht, die drei Blastozystenlinien mit hoher Sicherheit zu unterscheiden. Wir verwendeten Zellen von Embryonen, die in verschiedenen Entwicklungsstadien geerntet wurden, als Referenz. Die Zusammenführung dieser Datensätze zeigt, dass der Großteil des Trophektoderm-Analogons aus dem Blastoid mit Präimplantationstrophektoderm, aber nicht mit Postimplantationstrophoblasten gruppiert ist (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse wurden auch von einem unabhängigen Konsortiumbestätigt 10.
Wenn gastrulierende Embryonen im Carnegie-Stadium 7 (CS7) in die Referenzkarte eingeführt werden, wird eine kleine Population von blastoiden Zellen (3%) mit den Mesoderm- und Amnionlinien dieser Embryonen gruppiert (Abbildung 3C). Wenn amnionähnliche Zellen in die Referenzkarte eingeführt werden, gruppiert sich eine kleine Population von blastoiden Zellen (&lt; 2%) mit solchen amnionähnlichen Zellen.
Insgesamt werden nur die Strukturen, die einen einzigen regelmäßigen Hohlraum, einen einzigen inneren Zellcluster, eine Gesamtgröße von 150-250 μm, transkriptomische Analoga der drei Blastozystenlinien umfassen und weitgehend frei von anderen Linien (z. B. Amnion, Mesoderm, extraembryonales Mesoderm) umfassen, als menschliche Blastoide betrachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig01.jpg"> Abbildung 1: Vier Features und zwei Ansätze zur Erzeugung von High-Fidelity-Blastoiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig02.jpg"> Abbildung 2: Blastoid und Trophosphären, abgeleitet von Aggregaten naiver hPSC. (A) Phasenkontrastbilder, die naive hPSCs zeigen, die in PXGL-Medium kultiviert und mit bestrahltem MEF kokultiviert wurden. Maßstabsstab: 50 μm. (B) Phasenkontrastbilder, die die morphologische Veränderung naiver hPS-Aggregate zeigen, die auf einem nicht adhärenten Hydrogel-Mikrowell-Array mit 500 nM LPA (PALLY-Medium) kultiviert wurden. Maßstabsstab: 200 μm. (C) Menschliche Blastoide, die sich nach 96 h auf einem Mikrowell-Array gebildet haben. Maßstabsstäbe: 400 μm. (D) Quantifizierung des Prozentsatzes von Mikrowellen, die ein menschliches Blastoid enthalten, das durch die PALLY-Kulturbedingung induziert wird, mit optimierter LPA-Konzentration aus verschiedenen naiven hPSC-Linien (n = 3 Mikrowellenarrays). E) Immunfluoreszenzfärbung menschlicher Blastoide mit Epiblast (EPI)-Markern (gelb) NANOG und OCT4; die TE-Marker (Cyan) CDX2 und GATA3; und der primitive Endodermmarker (Magenta) SOX17 und GATA4. Maßstabsstab: 100 μm. (H-I) Quantifizierung der Zellzahl (links) und des Prozentsatzes der Zellen (rechts), die zu jeder Linie gehören, in Blastoid (96 h) basierend auf der Immunfluoreszenzfärbung von OCT4, GATA3 und GATA4. (G) Immunfluoreszenzfärbung von humanen Blastoiden für CDX2 (Cyan) und NR2F2 (Magenta). (F) Phasenkontrastbilder von Trophosphären im Früh- und Spätstadium auf einem Mikrowellenarray, die durch Zugabe von 3 μM SC144 (H) bzw. 2 μM XMU-MP-1 (I) induziert werden. (J) Phasenkontrastbilder, die die morphologische Veränderung von naiven hPS-Aggregaten zeigen, die in einer Ultra-Low-Attachment-96-Well-Platte mit 500 nM LPA (PALLY-Medium) kultiviert sind. (K) Phasenkontrastbild (links) und Immunfluoreszenzfärbung (rechts) für OCT4 (gelb), GATA3 (cyan) und GATA4 (magenta) in Blastoid, das 6 Tage lang im Zustand der Postimplantationskultur gezüchtet wurde. Maßstabsstab: 100 μm. Diese Zahl ist von 6,10 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig03.jpg"> Abbildung 3: Charakterisierung der Zusammensetzung von Blastoiden durch Einzelzellsequenzierung. (A) Unüberwachte Clustering-Analyse mit verschiedenen UMAP-Parametern des Transkriptoms einzelner Zellen, die aus den verschiedenen Zeitpunkten von Blastoid (24 h, 60 h, 96 h), naiven hPSCs, primierten hPSCs und hTSC (repräsentieren den Postimplantationszytotrophoblasten) abgeleitet sind. (B) UMAP des Transkriptoms von Zellen, die aus Blastoid- (96 h), naiven hPS-Zellen und primierten hPS-Zellen stammen, die mit veröffentlichten Datensätzen aus menschlichen Embryonen der Präimplantations-, Periimplantations- (in vitro kultivierte Blastozysten) und Gastrulationsstadien (Carnegie-Stadium 7, d. h. zwischen E16-19) integriert sind. Einzelne Zellen werden basierend auf ihrer Herkunft in menschlichen Embryonen (links), blastoid-abgeleiteten Zellen oder Stammzellen (Mitte) und dem Ergebnis einer unbeaufsichtigten Clustering-Analyse (rechts) eingefärbt. (C) UMAPs des Transkriptoms von Zellen, die aus Blastoiden, naiven hPSCs, primierten hPSCs stammen und in den veröffentlichten Datensatz aus dem Gastrulationsstadium (Carnegie-Stadium 7, d. h. zwischen E16-19) integriert sind. Einzelne Zellen werden basierend auf ihrer Herkunft in menschlichen Embryonen (links), blastoid-abgeleiteten Zellen oder Stammzellen (Mitte) und dem Ergebnis einer unbeaufsichtigten Clustering-Analyse (rechts) eingefärbt. Diese Zahl ist von6 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Alle in dieser Studie verwendeten Medienzusammensetzungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/Supplementary%20Table%201%20_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Ein Protokoll, das die Bildung menschlicher Blastoide beschreibt, die effizient, zeitnah und sequentiell Blastozysten-ähnliche Zellen erzeugen.

Protokoll für menschliche Blastoide, die die Entwicklung und Implantation von Blastozysten modellieren

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Die Forschung an menschlichen Embryonen ist durch ihre geringe Verfügbarkeit und ethische Bedenken begrenzt, so dass die Gewinnung individueller Modelle, die die frühe menschliche Entwicklung originalgetreu reproduzieren, den wissenschaftlichen und medizinischen Fortschritt unterstützen würde. Die Fähigkeit dieser Technik, die menschliche Entwicklung vorherzusagen, hängt von ihrer Fähigkeit ab, die Sequenzen der Blastozystenzellbestimmung und der Morphogenese entsprechend der Entwicklungssequenz und dem Entwicklungstempo effektiv zu reproduzieren, und eine solche Modellierung würde die Bildung von Zellen sicherstellen, die das Blastozystenstadium wirklich widerspiegeln. In Zukunft können humane Blastoide verwendet werden, um therapeutische Ziele zu identifizieren und zur präklinischen Modellierung beizutragen, beispielsweise zur Verbesserung eines In-vitro-Fertilisationsmediums oder zur Entwicklung nicht-hormoneller Kontrazeptiva.Das Verfahren wird von Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer und Giovanni Sestini demonstriert. Bereiten Sie zunächst die PXGL-Medien, N2B27-Basalmedien, Waschpuffer, PBS und Aggregationsmedien vor und erwärmen Sie sie. Schließen Sie MEFs aus der hPSC-Suspension für die Bildung von Blastoiden aus.Für den MEF-Ausschluss bereiten Sie eine gelatinebeschichtete Platte vor, indem Sie einen Milliliter 0,1% Gelatine in die Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen geben. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 30 bis 90 Minuten. Um die Zellen zu ernten, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit einem Millimeter PBS.Fügen Sie 500 Mikroliter Zellablösungslösung zu jeder Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Dissoziation von Kolonien in einzelne Zellen zu verfolgen. Verdünnen Sie die Zellablöselösung mit einem Milliliter Waschpuffer.Sammeln Sie die Zellen von der Platte, indem Sie fünf bis 10 Mal vorsichtig pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr. Drehen Sie die Zellen bei 200 RCF für vier Minuten herunter.Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 1,5 Milliliter PXGL-Medium in jedem Well. Samen Sie die Zellen auf den mit Gelatine beschichteten Platten für den MEF-Ausschluss aus und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 60 bis 90 Minuten. Sobald die naiven Zellen für den MEF-Ausschluss ausgesät sind, entfernen Sie das PBS aus MicroWells und gleichen Sie die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern basalem N2B27-Medium für jeden MicroWell-Chip aus und inkubieren Sie für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.Sammle den Überstand, der die nicht angehängten naiven Zellen enthält. Übertragen Sie es in eine 15-Milliliter-Röhre und drehen Sie die Zellen bei 200 RCF für vier Minuten herunter. Verwerfen Sie die Medien und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter N2B27-Basalmedien.Zählen Sie die Zellen mithilfe von Objektträgern zum Zählen von Zellen. Drehen Sie die Zellen bei 200 RCF für vier Minuten herunter. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie eine angemessene Menge an N2B27-Medien hinzu, die 10 Mikromolar Y27632 enthalten, um eine Zelldichte von 30.000 Zellen pro 50 Mikroliter zu erhalten.Entfernen Sie das Medium aus den äquilibrierten MicroWell-Arrays und fügen Sie 25 Mikroliter N2B27-Medien mit 10 Mikromolaren Y27632 hinzu. Fügen Sie 50 Mikroliter Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, damit die Zellen in den Boden des MicroWell fallen können. Dann fügen Sie 125 Mikroliter N2B27-Medium hinzu, ergänzt mit 10 Mikromolar Y27632.Innerhalb von 24 Stunden werden Aggregate naiver hPSCs auf dem MicroWell-Chip beobachtet. Initiieren Sie die Blastoidbildung, indem Sie das PALY-Medium vorbereiten. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius vorwärmen.Entfernen Sie das Aggregationsmedium und fügen Sie den MicroWells 200 Mikroliter vorgewärmtes PALY-Medium hinzu. Legen Sie die Zellkulturplatte wieder in einen hypoxischen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Medienwechsel am ersten Tag.Entfernen Sie am zweiten Tag das PALY-Medium und fügen Sie 200 Mikroliter N2B27-Medium hinzu, ergänzt mit LPA und 10 Mikromolar Y27632. Wiederholen Sie den Medienwechsel am dritten Tag. Die vollständige Blastoidbildung erfolgt am vierten Tag.Bereiten Sie naive hPSC-Zellsuspension für die Blastoidbildung vor, wie zuvor beschrieben. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie eine angemessene Menge an N2B27-Medien hinzu, die 10 Mikromolar Y27632 enthalten, um die Zelldichte von 70 Zellen pro 100 Mikroliter des Mediums zu erhalten. Um Zellen am Boden der Vertiefungen zu gruppieren, zentrifen Sie die Platte bei 200 RCF für zwei Minuten bei Raumtemperatur.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter hypoxischen Kulturbedingungen. Innerhalb von 24 Stunden werden Aggregate von naiven hPSCs an den Bohrlöchern beobachtet. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitetes und vorgewärmtes zweifaches PALY-Medium zu den Vertiefungen hinzu.Legen Sie die Zellkulturplatte wieder in einen hypoxischen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entsorgen Sie nach 24 Stunden die Hälfte des Mediums und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter vorgewärmtes PALY-Medium. Wiederholen Sie den Schritt bis zum vierten Tag.Bereiten Sie naive HPSC-Zellsuspension für die Troposphärenbildung vor, wie zuvor beschrieben. Sobald sich nach 24 Stunden Aggregate naiver HPSCs gebildet haben, tauschen Sie das Aggregationsmedium mit PALY ohne LIF aus, ergänzt durch drei mikromolare SC144, um Trophosphären zu bilden, die das frühe Trophektoderm darstellen. Um Trophosphären zu bilden, die reifes Trophektoderm darstellen, tauschen Sie das Aggregationsmedium mit PALY aus, ergänzt durch zwei mikromolare XMUMP1.Aktualisieren Sie das Medium täglich. Die vollständige Trophosphärenbildung erfolgt am vierten Tag. Um die Zellzustände zu bewerten, vergleichen Sie die transkriptomischen Daten von Blastoid- und Trophosphären mit den entsprechenden Kontrollen, einschließlich postimplantationsähnlicher humaner Trophoblast-Stammzellen.Naive hPSCs, die in PXGL kultiviert wurden, waren aggregierte und kavitierte Strukturen, die zwischen 48 und 72 Stunden nach der PALY-Induktion entstanden und innerhalb von 96 Stunden einen Durchmesser von 150 bis 250 Mikrometern erreichten. Basierend auf morphometrischen Parametern und dem Vorhandensein der drei Linien erreichte die Induktionseffizienz 70 bis 80% Trophosphären wurden mit einer Effizienz von 50 bis 60% innerhalb von 96 Stunden nach der Induktion gebildet. Die Blastoidbildung war in kommerziell erhältlichen Ultra-Low-Attachment-96-Well-Platten unter optimierten Induktionsbedingungen erfolgreich.Die Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie wurde verwendet, um den Zustand der blastoiden Zellen weiter zu charakterisieren. Zellen zeigen deutlich reproduzierbare Clustering-Profile, unabhängig von den Parametern, die für die Clusterung und Visualisierung von Daten verwendet werden, was es ermöglichte, die drei Blastozystenlinien sicher zu unterscheiden. Zwischen 24 und 60 Stunden bilden die pluripotenten PXGL-Stammzellen Analoga des Epiblasten und des Trophektoderms.Dann bilden sich zwischen 60 und 96 Stunden Analoga des polaren Trophektoderms und des primitiven Endoderms. Dies ist die Reihenfolge der Spezifikation innerhalb der Blastozyste, so dass Blastoide die Entwicklungssequenz der Linienspezifikation rekapitulieren. Die Zusammenführung von Blastoid-Datensätzen mit dem Referenzdatensatz von Zellen, die aus Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien isoliert wurden, zeigte, dass 97% der Zellen aus Blastoiden mit den Blastozystenzellen gruppiert waren, aber nicht mit Zellen aus Postimplantationsembryonen.Unabhängige Analysen bestätigten, dass die Stammzellen im Laufe der Zeit Zellen bildeten, die zwischen dem fünften Tag und dem 7.5. Tag transkriptionell mit den Zellen menschlicher Embryonen übereinstimmten. Dies ist in der Tat das Entwicklungsstadium, in dem sich die menschliche Blastozyste bildet. Sie bestätigten auch, dass mehr als 95% der Zellen in Blastoiden ein Transkriptom haben, das den drei Zelllinien der Blastozysten entspricht, während 3% der Zellen außerhalb des Ziels lagen und mit den Postimplantationsstadien übereinstimmten.Bemerkenswert ist, dass unsere anfänglichen 2D-Kulturen auch etwa 5% der Zielzellen ausmachen. Das äquivalente Entwicklungsstadium kann auch visualisiert werden, indem die Expressionsmuster spezifischer Marker wie CDX2 für das Blastozystentrophektoderm und PRMD14 für den Blastozysten-Epiblasten betrachtet werden. Die Qualität der anfänglichen PXGL-Kultur ist absolut entscheidend, und die Anzahl der Zellen innerhalb des ursprünglichen Aggregats ist ebenfalls kritisch und kann mit MicroWells gesteuert werden.Die Gesamtgröße des zellulären Aggregats nach 24 Stunden sollte etwa 50 bis 70 Mikrometer betragen. Die effiziente Bildung von Phase-Vollblastoiden ebnet den Weg für die Untersuchung der Prozesse der Implantation und Postimplantationsentwicklung des menschlichen Embryos.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Das Schicksal einer einzelnen embryonalen Zelle kann durch vererbte Moleküle und / oder durch Signale von benachbarten Zellen beeinflusst werden. Mit Hilfe Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Xenopus Embryos können einzelne Blastomeren für Kultur isoliert identifiziert werden, um die Beiträge der ererbten Moleküle gegenüber Zell-Zell-Interaktionen zu beurteilen.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

MicroSecure Vitrification wurde als nicht-kommerzielles, aseptisches, geschlossenes Vitrifikationssystem entwickelt, das den guten Herstellungs- und Gewebehandhabungspraktiken der FDA entspricht. Aufgrund der Rücknahme von hydrophoben verstopften Embryonalhalmen aus der Industrie wurde das Vitrifikationsverfahren dahingehend geändert, dass eine innere Versiegelung vor dem standardmäßigen internen Baumwollstopfen vorgesehen ist.

Modifizierte MicroSecure Vitrifikation: Eine sichere, einfache und sehr effektive Kryokonservierung Verfahren für Human Blastozysten

Hier präsentieren wir ein Time-Lapse morphometrische-Protokoll, um die Intensität der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion während Previtrification Interventionen und Post-wärmende Erholung folgen. Die Anwendung des Protokolls ist möglich in in-vitro- Befruchtung Labors mit Zeitraffer Mikroskopen ausgestattet und wird bei der Entwicklung einer optimalen Blastozyste-Verglasung-Methode empfohlen.

Morphometrische Protokoll für die objektive Beurteilung der Blastozyste Verhalten während der Verglasung und wärmenden Schritte

Blastozystenbiopsie und Vitrifikation sind erforderlich, um Präimplantations-Gentests effizient durchzuführen. Ein Ansatz, der die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida und die Rückgewinnung von 7-8 Trophektodermzellen in Tag 5-7 nach der Besamung einschließt, begrenzt sowohl die Anzahl der erforderlichen Manipulationen als auch die Exposition des Embryos gegenüber suboptimalen Umweltbedingungen.

Menschliche Blastozysten Biopsie und Vitrifikation

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Erstellung eines einfachen und effizienten In-vitro-Modells für die Embryoimplantation zur Bewertung der relevanten Moleküle, die den Einnistungsprozess des Embryos beeinflussen.

Etablierung eines Embryoimplantationsmodells in vitro

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven.  Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Die Microarray-Technologie ermöglicht die quantitative Messung und Erstellung von Genexpressionsprofilen von Transkripten auf genomweiter Basis. Aus diesem Grund bietet dieses Protokoll ein optimiertes technisches Verfahren in einem zweifarbigen, maßgeschneiderten Rinderarray unter Verwendung von Rinderembryonen am Tag 7, um die Machbarkeit der Verwendung einer geringen Menge an Gesamt-RNA zu demonstrieren.

Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Cortisol-Reaktivität in einer anfälligen jugendlichen mexikanischen amerikanischen Probe mit einer modifizierten Version des Trier Social Stress Test (TSST) hervorrief. Speichelproben wurden zu Beginn, 15, 30 und 45 min nach dem TSST-Beginn gesammelt. Zukünftige Forschung könnte diese modifizierte TSST mit anfälliger Jugend nutzen.

Ein Modified Trier Social Stress Test für anfällige mexikanische amerikanische Jugendliche

Erfahren Sie, wie menschliche Blastoide mit 70-80% Effizienz generiert werden, um frühe Embryonalentwicklung und Implantation zu modellieren. Diese Methode nutzt naive hPSCs und sequenzielle Medienwechsel für präklinische Anwendungen.

Protokoll für menschliche Blastoide, die die Entwicklung und Implantation von Blastozysten modellieren

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