Bestimmung der Glucankettenlängenverteilung von Glykogen mit der Fluorophor-gestützten Kohlenhydratelektrophorese-Methode (FACE)
31. März 2022
Im vorliegenden Protokoll wird die Fluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE) -Technik verwendet, um die Kettenlängenverteilung (CLD) und die durchschnittliche Kettenlänge (ACL) von Glykogen zu bestimmen.
Diese Methode ermöglicht ein besseres Verständnis der strukturellen Organisationen von Glykogenpartikeln. Es ist ein wichtiges Thema, weil die Population der Glucan-Ketten, die sogenannte Kettenlängenverteilung, die physikalischen chemischen Eigenschaften der Glykogenpartikel bestimmt. Wie z.B. Wasserlöslichkeit.
Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass die Fluoreszenz unabhängig von der Glucan-Kettenlänge konstant ist. Es gibt nur ein APTS-Molekül, das durch Glucan gebunden ist. Somit ist die Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Anzahl der Glucan-Ketten.
Das Gebiet der assistierten Kapillarelektrophorese eignet sich zur Lösung des medizinischen Mechanismus von Glykogenmetabolisierungsenzymen. Zum Beispiel können wir den Grad der Polymerisation von Glucan-Ketten bestimmen, die durch Verzweigen von Enzymen auf akzeptiertes Glucan übertragen werden. Die Reaktion muss unter Bedingungen durchgeführt werden.
Daher müssen Regionen vor Feuchtigkeit geschützt werden. Mischen Sie 200 Mikroliter 0,5-2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes Glykogen mit 200 Mikrolitern 100 Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,8. Fügen Sie 2 Mikroliter Isoamylase und 1,5 Mikroliter Pullulanase hinzu.
Vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mischen. Dann bei 42 Grad Celsius für 16 Stunden in einem 1,5-Milliliter-Rohr inkubieren. Stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie bei 95 Grad Celsius für 5 Minuten inkubieren.
Zentrifugieren Sie bei 16, 100 mal G'für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu pelletieren und zu entfernen. Entfernen Sie die Superwartung mit einer Pipette und übertragen Sie sie auf neue kommentierte Rohre. Nach Zugabe von Harzperlen in ein leeres Mikrofugenröhrchen entsalzen Sie die Überstände, indem Sie das Äquivalent von 100 Mikrolitern eines Anionenkationenaustauschharzes hinzufügen und rühren.
Sammeln Sie die Proben durch Pipettieren und legen Sie sie in neue kommentierte Röhrchen. Gefriertrocknen Sie die Proben. Lagern Sie getrocknete Proben bei Raumtemperatur oder 20 Grad Celsius.
Mischen Sie die getrockneten Proben mit 2 Mikrolitern 1 molaren Natriumcyanoborhydrid und Tetrahydrofuran und 2 Mikrolitern 8 Amino 1-3-6 Pyrentrisulfonsäure. Bei 42 Grad Celsius 16 Stunden im Dunkeln inkubieren. Geben Sie 46 Mikroliter Reinstwasser zu jeder Probe.
Um die Proben 50 Mal zu verdünnen, fügen Sie einen Mikroliter der Probe zu 49 Mikrolitern Reinstwasser in 100-Mikroliter-Mikrofläschchen hinzu. Im Wirbel, um gründlich zu mischen. Legen Sie die Proben für 5 bis 10 Minuten ins Dunkel, während Sie das Gesicht einstellen.
Um eine Elektrophorese mit umgekehrter Polarität durchzuführen, richten Sie die Methode ein und stellen Sie den Einspritzdruck auf 0,5 Pfund Kraft pro Quadratzoll ein. Stellen Sie dann die Polarität für die Trennung in den umgekehrten Modus ein. Verdünnen Sie den N-verknüpften Kohlenhydrat-Trennpuffer in Reinstwasser auf ein Drittel.
Führen Sie die APTS-gekennzeichnete Glucan-Trennung im verdünnten Puffer bei 30 Kilovolt in einer blanken Quarzglaskapillare durch. Richten Sie dann die Injektionszeit ein und starten Sie die Analyse. Exportieren Sie die ASC- und CDF-Dateien, die das Elektropherogrammprofil bzw. die Integrationsdaten enthalten.
Öffnen Sie die ASC-Datei und zeichnen Sie die relative Fluoreszenzeinheit gemäß dem Zeitdiagramm. Öffnen Sie die Datei CDF. Fahren Sie mit einer ersten automatischen Integration fort und passen Sie die folgenden Parameter mit Tal-zu-Tal-Integration und Mindestfläche an.
Überprüfen und korrigieren Sie jedes fehlerhafte Integrationsereignis manuell. Die zwischen 4,13 und 4,67 Minuten beobachteten Fluoreszenzsignale stammten von den nicht reagierenden APTS. Die Aleutenzeit des markierten Maltohexaose DP 6 wurde auf 8,49 Minuten geschätzt.
Die mit APTS gekennzeichneten Glucane aus Rinderglykogen wurden anhand der Aleutenzeit von DP 6 identifiziert. In der Kontrollprobe, in der Glykogen nicht mit abzweigenden Enzymen inkubiert wurde, wurde keine Spur von freiem Maltooligosaccharid nachgewiesen. Das Inset-Panel zeigt eine Trennung von Glucan-Ketten bis zu 44 DP. Die Kettenlängenverteilung wird als Prozentsatz der DP für jede DP angezeigt. Die durchschnittliche Kettenlänge wurde berechnet, indem jeder Prozentsatz der Kette mal den entsprechenden Polymerisationsgrad summiert wurde.
Gesichtsanalysen zeigten, dass die am häufigsten vorkommenden Glucane Maltose- und Kaninchenleber, Maltohexaose in der Auster und Maltoheptaose in der Rinderleber sind. Die Kettenlängenverteilungen von Glykogen, das von Wildtyp- und mutierten Cyanobakterienstämmen gereinigt wurde, wurden mittels Gesichtsanalyse bestimmt. Subtraktive Analysen wurden durchgeführt, indem der Prozentsatz jedes DP des Wildtyps vom Prozentsatz jedes DP der Mutanten subtrahiert wurde.
Die durchschnittlichen Kettenlängenverteilungen von Glykogen aus Wildtypen und Mutanten von Synechocystis wurden entsprechend dem für jede CLD beobachteten maximalen Peak normalisiert. Diese Technik ermöglicht ein besseres Verständnis menschlicher Krankheiten, die mit einem Defekt im Glykogenstoffwechsel verbunden sind, insbesondere der Andersen-Krankheit, reiche Ergebnisse aus der Ansammlung abnormaler Glykogenpartikel in Zellen.
Übersicht
Dieses Protokoll verwendet die Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Technik, um die Kettenlängenverteilung (CLD) und die durchschnittliche Kettenlänge (ACL) von Glykogen zu analysieren. Das Verständnis dieser Parameter ist entscheidend für die Aufklärung der strukturellen Organisation und der Eigenschaften von Glykogenpartikeln.
Wichtige Studienkomponenten
Wissensgebiet
- Biochemie
- Glykogenstoffwechsel
- Elektrophoresetechniken
Hintergrund
- Die Kettenlängenverteilung der Glucanketten beeinflusst die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Glykogens.
- Die Fluoreszenzintensität in dieser Methode ist konstant, was eine genaue Quantifizierung der Glucanketten ermöglicht.
- Das Verständnis der Glykogenstruktur ist wesentlich für die Untersuchung verwandter Stoffwechselstörungen.
- Glykogen-metabolisierende Enzyme spielen eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung des Polymerisationsgrades der Glucanketten.
Zweck der Studie
- Die Kettenlängenverteilung und die durchschnittliche Kettenlänge des Glykogens zu bestimmen.
- Das Verständnis der strukturellen Organisation des Glykogens zu verbessern.
- Die Auswirkungen der Glykogenstruktur auf menschliche Krankheiten, wie Andersen's Krankheit, zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Präparation von Glykogenproben mit spezifischen Enzymen unter kontrollierten Bedingungen.
- Fluorophoren-Markierung von Glucanen für die Elektrophoreseanalyse.
- Elektrophorese mit umgekehrter Polarität zur Trennung der markierten Glucane.
- Datenanalyse durch Integration von Elektropherogrammprofilen.
Hauptergebnisse
- Identifizierung verschiedener Glucane basierend auf ihrem Polymerisationsgrad.
- Bestimmung der Kettenlängenverteilungen für Glykogen aus verschiedenen Quellen.
- Subtraktive Analysen, die Unterschiede zwischen Wildtyp- und Mutantenstämmen aufzeigen.
- Einblicke in die Beziehung zwischen Glykogenstruktur und Stoffwechselstörungen.
Schlussfolgerungen
- Die FACE-Technik bietet eine zuverlässige Methode zur Analyse der Glykogenstruktur.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis von Krankheiten bei, die mit dem Glykogenstoffwechsel in Verbindung stehen.
- Weitere Forschung könnte therapeutische Implikationen für Glykogen-bezogene Störungen untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding glycogen chain length distribution provides critical insights into metabolic disease mechanisms and enzyme function, supporting target validation in glycogen storage disorders. The FACE method enables quantitative assessment of glucan chain populations, which directly influences glycogen solubility and bioavailability—key considerations in preclinical model development. This structural parameter aids in mechanistic de-risking by linking enzyme activity to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies glucan chain length distribution to interrogate therapeutic hypotheses about glycogen branching enzyme function.
- Operational Value: Enables biological de-risking by establishing structure-function relationships between enzyme activity and glycogen particle properties.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating chain length distributions with disease-associated glycogen phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems with quantified chain length distributions for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Generates fluorescence-based readouts proportional to glucan chain count, enabling reliable compound evaluation.
- Reproducibility: Standardized electropherogram integration supports assay scalability and cross-platform consistency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links glycogen structure to human metabolic disorders like Andersen's disease through abnormal chain length distributions.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase enzyme assays to preclinical validation via measurable structural endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying structural deviations in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The FACE method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by providing structural readouts that inform enzyme mechanism and disease relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of glycogen metabolizing enzymes by measuring degree of polymerization changes.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized chain length distribution profiles for compound library evaluation.
- Analytics: Provides electropherogram integration data and chain length percentage outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects enzyme mechanism to preclinical outcomes via disease-relevant glycogen structural alterations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for glycogen structure analysis across multiple disease models and enzyme targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycogen metabolism pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fluorescence intensity proportionality to glucan chain count.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on structural biomarkers.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization through quantitative chain length distribution comparisons between wild-type and mutant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate electrophoresis and fluorophore labeling techniques.
- Depends on capillary electrophoresis instrumentation with reverse polarity capability and detection systems for fluorescent compounds.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, enzyme incubation, and electropherogram integration protocols.
- Involves adaptation considerations for different glycogen sources (e.g., bacterial, mammalian) and enzyme conditions.
- Limited by the need for protected reaction conditions to prevent moisture interference during sample preparation.
