Entwicklung und Funktionalisierung eines elektrolytgesteuerten Graphen-Feldeffekttransistors für den Biomarker-Nachweis
1. Februar 2022
Das vorliegende Protokoll demonstriert die Entwicklung eines elektrolytgesteuerten Graphen-Feldeffekttransistors (EGGFET) Biosensors und seine Anwendung beim Nachweis von Biomarker-Immunglobulin G (IgG).
Die Methode entfernt effektiv PMMA-Rückstände unter Beibehaltung des zugrunde liegenden Graphengitters. Das funktionelle Gerät zeigt konsistente Ergebnisse beim Nachweis von IgG-Antikörpern im Blutserum. Außerdem stellt das Protokoll die Implementierung von CVD-Graphen in einem kennzeichnungsfreien Echtzeit-Biosensorgerät sicher.
Die Schritte sind ziemlich einfach und können mit minimalem Training durchgeführt werden. Das Gerät bietet eine hohe Selektivität, hohe Empfindlichkeit und Echtzeiterkennung gegenüber anderen Biosensorgeräten Beginnen Sie mit dem Schneiden der Graphenschicht auf einem Kupfersubstrat in zwei Hälften mit einem Skalpell. Tragen Sie hitzebeständiges Klebeband auf, um die vier Ecken des Graphenquadrats auf einer Spinnerdichtung zu befestigen.
Drehen Sie die quadratische Schicht des Graphens mit einer dünnen Schicht von 100 bis 200 Nanometern PMMA 495K A4, die sich 10 Sekunden lang mit 500 Umdrehungen pro Minute und dann 50 Sekunden lang mit 2.000 Umdrehungen pro Minute dreht. Dann backen Sie die Probe bei 150 Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie die Rückseite des Graphens mit Sauerstoffplasma bei 30 Watt mit einem Ratenfluss von 15 Standardkubikzentimetern pro Minute für fünf Minuten.
Schneiden Sie das plasmabehandelte Graphenquadrat für die Geräteherstellung in eine Breite von einem Zentimeter und einer Höhe von zwei Zentimetern. Schneiden Sie das vorgereinigte Kieselsäuresubstrat in kleine Stücke mit einer Breite von etwa vier Zentimetern und einer Höhe von zwei Zentimetern. Ätzen Sie das Kupfer mit dem Graphenätzmittel Eisenchlorid ohne Verdünnung ab.
Schwimmen Sie die Probe mit der Kupferseite nach unten und der PMMA-Seite nach oben auf dem flüssigen Etchant. Nach dem Kupferätzen heben Sie den Graphenfilm langsam mit dem plasmabehandelten Substrat an. Trocknen Sie den übertragenen Graphenfilm zwei Stunden lang an der Luft und backen Sie ihn dann auf einer heißen Platte.
Um PMMA zu entfernen, beginnen Sie damit, die Probe mit Acetondampf bei 70 Grad Celsius aufzuwärmen, indem Sie die Probe vier Minuten lang etwa zwei Zentimeter über dem Acetondampf mit der PMMA-Seite nach unten halten. Tauchen Sie die Probe dann fünf Minuten lang in Aceton ein. Waschen Sie die Probe vorsichtig mit entionisiertem Wasser.
Zum Schluss die Probe vorsichtig mit Stickstoff einblasen. Waschen Sie das Substrat mit dem übertragenen Graphen mit Aceton, Isopropylalkohol und deionisiertem Wasser. Dann das Substrat auf einer heißen Platte bei 75 Grad Celsius für 30 Minuten backen.
Deponieren Sie mit einem Elektronenstrahlverdampfer Nickel und Gold mit einer Dicke von 5 bzw. 45 Nanometern auf der Graphenprobe. Wenden Sie das erste Photolithographieverfahren mit Maske A für die Strukturierung der Elektroden an. Drehen Sie den positiven Fotolack AZ 5214E mit 2.000 Umdrehungen pro Minute für 45 Sekunden auf die Probe und härten Sie die Probe bei 120 Grad Celsius für eine Minute aus.
Legen Sie die Probe in das ultraviolette Hochwasserexpositionssystem und belichten Sie sie für etwa 10 Sekunden unter 200 Millijoule pro Quadratzentimeter. Entwickeln Sie die Probe mit einem Fotolackentwickler AZ 300 MIF für ca. zwei Minuten und spülen Sie sie dann mit deionisiertem Wasser ab. Tauchen Sie die Probe in ein Goldätzmittel, um die Goldschicht für 10 Sekunden zu ätzen, spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab und entfernen Sie die verbleibende Fotolackschicht, indem Sie 10 Minuten lang in Aceton eintauchen.
Waschen Sie die Probe mit Aceton, Isopropylalkohol und deionisiertem Wasser und backen Sie anschließend 30 Minuten lang auf einer heißen Platte bei 75 Grad Celsius. Wenden Sie dann den zweiten Photolithographieprozess mit Maske B an, um die Graphenkanäle zu strukturieren. Tauchen Sie die Probe bei 60 Grad Celsius in Nickelätzmittel, um die Nickelschicht 10 Sekunden lang zu ätzen.
Mit entionisiertem Wasser abspülen und mit Stickstoff föhnen. Legen Sie die Probe in den Plasma-Asher und entfernen Sie das exponierte Graphen mit Sauerstoffplasma. Entfernen Sie später die Fotolackschicht, indem Sie 10 Minuten lang in Aceton eintauchen.
Waschen Sie die Probe mit Aceton, IPA und entionisiertem Wasser und backen Sie sie 30 Minuten lang auf einer heißen Platte bei 75 Grad Celsius. Wenden Sie den dritten Photolithographieprozess mit Maske C an, um die Passivierungsfotolackschicht zu strukturieren, um das darunter liegende Graphen auf dem Substrat zu schützen. Verwenden Sie die gleichen Prozessparameter wie zuvor erwähnt, einschließlich des Spinnens mit positivem Fotolack, der Aushärtung der Probe und der Entwicklung mit dem Entwickler von Fotolacken.
Tauchen Sie die Probe später 10 Sekunden lang bei 60 Grad Celsius in Nickelätzmittel ein, um die verbleibende Nickelschicht zu entfernen, und spülen Sie sie dann mit deionisiertem Wasser ab und föhnen Sie sie mit Stickstoff. Zum Schluss backen Sie die Probe auf einer heißen Platte bei 120 Grad Celsius für 30 Minuten. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen das übertragene CVD-Graphen, das durch Raman- und Rasterkraftmikroskopie gekennzeichnet ist.
Der G-Peak und die zweidimensionalen Peaks des Raman-Bildes geben umfassende Informationen über die Existenz und die Qualität des übertragenen Monolayer-Graphens. Die Abbildung zeigt einen EEG-FET-Biosensor, der mit einer Standard-Silber-in-Silberchlorid-Referenzelektrode und einer Polydimethylsiloxan-Vertiefung zur Aufnahme der Probe integriert ist. Darüber hinaus zeigt die vergrößerte Ansicht des Graphenkanals die Verbindung zur Quellelektrode zum Boden, zum Abfluss und zu den Gate-Elektroden zur Quelle.
PBASE, ein weit verbreitetes Funktionalisierungsreagenz für Graphen, kann auf der Graphenoberfläche durch eine Pi-Pi-Wechselwirkung absorbiert werden, ohne die elektrischen Eigenschaften von Graphen zu schädigen. Ein 5-prime-aminomodifiziertes IgG-Aptamer wird mit PBASE durch die Amidbindungsverbindungen zwischen dem reaktiven und dem Hydroxy-6-Zimt-Ester in PBASE und der Amingruppe am 5-Prime-Ende des IgG-Aptamers konjugiert. Die Inkubation von Rinderserumalbumin wurde verwendet, um die verbleibenden unkonjugierten Stellen nach dem Spülen des Geräts mit einstufigem PBS zu blockieren Die Abbildung zeigt die IgG-Detektion unter verschiedenen Elektrolytbedingungen.
Die Qualität des Graphens ist der Schlüssel zur besten Leistung dieses Geräts. Beim Plasmaätzen muss also sichergestellt werden, dass das Plasma die nützlichen Bereiche des Graphens nicht schädigt. Außerdem müssen die PMMA-Rückstände vollständig gereinigt werden, um eine saubere Graphenoberfläche zu erhalten.
Das funktionelle Gerät zeigt konsistente Ergebnisse beim Nachweis menschlicher IgG-Antikörper, so dass das Verfahren als Referenz verwendet werden kann, um Geräte mit anderen Nanomaterialien zu bauen, um Schnittstelleninteraktionen und Biosensorik zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert die Entwicklung eines elektrolytgesteuerten Graphen-Feldeffekttransistors (EGGFET) Biosensors für die Detektion von Immunglobulin G (IgG) Biomarkern. Die Methode gewährleistet hohe Selektivität und Sensitivität bei gleichzeitiger Ermöglichung von Echtzeit-Detektion ohne Markierung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biotechnologie
- Elektronik
Hintergrund
- Graphen ist ein vielversprechendes Material für Biosensoranwendungen.
- Elektrolytgesteuerte Transistoren können die Leistung von Biosensoren verbessern.
- Immunglobulin G (IgG) ist ein wichtiger Biomarker bei verschiedenen Krankheiten.
- Echtzeitdetektion ist für effektive Diagnostik unerlässlich.
Zweck der Studie
- Einen Biosensor unter Verwendung der EGGFET-Technologie zu entwickeln.
- Die Anwendung des Biosensors in der IgG-Detektion zu demonstrieren.
- Ein einfaches Protokoll für Forscher bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Ausschneiden von Graphenschichten auf einem Kupfersubstrat.
- Aufbringen von hitzebeständigem Klebeband zur Sicherung des Graphens.
- Nutzung von CVD-Graphen für die Geräteherstellung.
- Testen des Geräts mit Blutserumproben zur IgG-Detektion.
Hauptergebnisse
- Das Gerät zeigt konsistente Ergebnisse bei der Detektion von IgG-Antikörpern.
- Hohe Selektivität und Sensitivität wurden erreicht.
- Echtzeit-Detektionsfähigkeiten wurden bestätigt.
- Die Methode entfernt effektiv PMMA-Rückstände, ohne das Graphen zu beschädigen.
Schlussfolgerungen
- Der EGGFET Biosensor ist ein vielversprechendes Werkzeug für die Biomarkerdetektion.
- Er bietet Vorteile gegenüber traditionellen Biosensormethoden.
- Die einfache Implementierung macht ihn für Forscher zugänglich.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables the development of a label-free, real-time biosensor for detecting immunoglobulin G (IgG) biomarkers using electrolyte-gated graphene field-effect transistors (EGGFETs). The method supports early-stage target validation by providing a sensitive, reproducible platform for monitoring biomolecular interactions in complex biological matrices such as blood serum. By ensuring clean graphene transfer and effective functionalization, the approach enhances predictive confidence in biomarker detection assays, facilitating go/no-go decisions in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of IgG biomarker interactions with high sensitivity and selectivity in native biological samples.
- Operational Value: Provides a label-free detection method that reduces assay complexity and eliminates the need for fluorescent or enzymatic tags.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing real-time monitoring of binding kinetics and affinity under physiological electrolyte conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, real-time electrical readouts that enable dose-response analysis and binding specificity screening.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized graphene transfer and PMMA residue removal, minimizing batch-to-batch variability.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple biomarker targets via adaptable surface functionalization with aptamers or antibodies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling IgG detection in disease-relevant sample types like human blood serum.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates reliable biomarker signal data that inform preclinical candidate selection and assay qualification.
- Disease-Relevant System: Demonstrates functionality in clinically relevant matrices, supporting extrapolation to diagnostic and therapeutic monitoring applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening of biomolecular interactions by detecting target binding in real time without labels.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs suitable for hit confirmation and selectivity profiling in antibody or aptamer-based assays.
- Analytics: Generates electrical signal measurements (e.g., conductance shifts) that allow comparison of binding responses across conditions and analytes.
- Translational Research: Supports continuity into preclinical work by validating biomarker detection in native biological fluids.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform adaptable to various biomarkers through modular surface functionalization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through sensitive, label-free detection of IgG in complex samples.
- Operational Value: Improves reproducibility via controlled graphene transfer and effective cleaning protocols that preserve lattice integrity.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions by delivering real-time binding data early in discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of biomarker targets based on quantifiable, reproducible assay performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, photolithography, and graphene handling for successful device production.
- Depends on access to electron beam evaporators, plasma etchers, and spin coaters for electrode deposition and patterning.
- Necessitates standardization of functionalization and blocking steps (e.g., PBASE-IgG aptamer conjugation, BSA blocking) across users and labs.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other biomarkers or nanomaterial interfaces.
- Includes practical limitations such as the need for careful plasma etching to avoid damaging graphene and thorough PMMA removal to ensure signal fidelity.
