Effiziente SARS-CoV-2 quantitative Reverse Transkriptase PCR Speicheldiagnostikstrategie unter Verwendung von Open-Source-Pipettierrobotern

Wir haben einen kostengünstigen, speichelbasierten COVID-19-Diagnosetest und -workflow entwickelt, der für groß angelegte Community-Screening-Anwendungen einfach zu implementieren und zu skalieren ist. Hier verwenden wir Open-Source-Liquid-Handling-Roboter, Standard-Thermocycler und Software, um direkte Speicheltests ohne Extraktions- oder Stabilisierungspuffer durchzuführen und gleichzeitig genaue Diagnoseergebnisse zu liefern. Aufgrund der einfachen automatisierten parallelen Workflows kann das System so skaliert werden, dass täglich Tausende von Tests mit minimalem Ausrüstungs-, Platz- und Personalbedarf durchgeführt werden können.

Neben Kylie King werden Rachel Ham, unsere klinische Laborleiterin, und Austin Smothers, unsere Bildungskoordinatorin, helfen, das Verfahren zu demonstrieren Beginnen Sie mit der Dekontamination der Außenseite der Speichelsammelröhrchen mit 70% Ethanol und der Übergabe an das Labor zum Testen. Zeichnen Sie die Probenankunft auf, indem Sie jeden Proben-Barcode in die tägliche Aufnahmetabelle scannen. Behandeln Sie die Scanproben 30 Minuten lang in einem 95 Grad Celsius-Ofen und entfernen Sie die Proben dann mit hitzebeständigen Handschuhen.

Öffnen Sie die täglichen Probenladetabellen für jeden Probenladeroboter an der Probenzuordnungsstation. Weisen Sie dann jeder 384-Bohrlochplatte 188 Proben zu. Etikettenablagen mit Plattenname, Datum und Viertelnummer.

Scannen Sie die Proben der Reihe nach in die Probenladetabelle. Stellen Sie an der Probenladestation zwei komplette Sätze von acht 3D-gedruckten Racks auf, die der Deckplatzierung im Roboter entsprechen. Lösen Sie die Kappe der Quarter-One-Tubes und legen Sie sie in 3D-gedruckte Racks, beginnend mit der Position A1 im ersten Rack.

Füllen Sie jedes Rack von links nach rechts und von oben nach unten. Setzen Sie dieses Lademuster in Rack zwei fort und fahren Sie dann mit den Racks vier und fünf fort. Platzieren Sie geladene Viertel-Eins-Probenregale auf Decks eins, zwei, vier, fünf, sieben, acht, 10, 11.

Platzieren Sie P20-Tipps auf den Decks drei und neun. Um den Rüstvorgang zu vereinfachen, laden Sie Materialien von hinten nach vorne in den Roboter. Die Master-Mixplatten werden auf einem speziellen Roboter produziert und bei vier Grad Celsius gelagert.

Eine Platte wird jeweils verwendet und ist mit dem Plattennamen beschriftet, und eine scharfe Klinge wird verwendet, um eine Linie in der Folie um die Steuerbrunnen zu schneiden. Legen Sie die Master-Mixplatte auf Deck sechs und ziehen Sie die Folienabdeckung ab, wobei das kleine Rechteck, das die Steuerschächte bedeckt, zurückbleibt. Entdecken Sie die Tip-Boxen und schließen Sie den Roboter.

Initialisieren Sie das benutzerdefinierte Python-Betriebsprotokoll, indem Sie auf Start run through the robot desktop application klicken. Jedes Viertel benötigt 24,5 Minuten, um auf die Platte geladen zu werden. Legen Sie einen Timer als Erinnerung fest.

Während der Roboter läuft, öffnen Sie die Kappe und laden Sie viertel zwei Probenröhrchen in den zweiten Satz 3D-gedruckter Racks. Wenn der Roboter pausiert, entfernen Sie die Quarter-One-Racks und ersetzen Sie sie durch die Quarter-Two-Racks, und klicken Sie dann in der Desktop-Anwendung auf Resume Run. Fassen Sie die ersten Probenröhrchen zusammen und lagern Sie sie in einem Kühlschrank mit vier Grad Celsius, während Sie auf die Ergebnisse warten.

Wiederholen Sie diesen Ladevorgang für die Quartale drei und vier. Überführen Sie die beladene Platte in eine Biosicherheitswerkbank. Um die Kontamination zu minimieren, halten Sie die Platte während des Transfers bedeckt.

Sammeln Sie alle Wiederholungsproben und weisen Sie sie als letzte Proben im vierten Quartal zu. Nummerieren Sie die Proben, scannen Sie die Barcodes und geben Sie den ursprünglichen Probenort und das Ergebnis in die Probenladetabelle ein. Überführen Sie die Wiederholungsproben in die Biosicherheitskabine.

Laden Sie die Wiederholungsprobenröhrchen nicht in die Roboterladegestelle. Pipettieren Sie zwei Mikroliter jeder Wiederholungsprobe zu den richtigen Vertiefungen. Verwenden Sie die dafür vorgesehene Pipette zum Hinzufügen von Patientenproben.

Halten Sie die Kontrollbrunnen mit Folie bedeckt, während Sie Proben hinzufügen, um die Kontamination zu minimieren. Ziehen Sie die Folienabdeckung über den Kontrollvertiefungen mit einer Pinzette ab. Pipette zwei Mikroliter bestätigter positiver Patientenproben in die Vertiefungen M23 und M24.

Pipettieren Sie zwei Mikroliter nukleasefreies Wasser zu den Brunnen N23 bis N24 und zwei Mikroliter von 200 Kopien pro Mikroliter gemischter positiver Kontrolle zu den Brunnen O23 bis O24. Lassen Sie die Vertiefungen P23 bis P24 leer, um die Qualität der Master-Mix-Chargen zu überwachen. Decken Sie die Platte mit einer optisch klaren Abdichtung ab und verwenden Sie die Applikatorwalze, um die Dichtung an allen Vertiefungen festzuhalten.

Wirbeln Sie die Platte bei 2, 500 U / min für 30 Sekunden, um gründlich zu mischen, und zentrigrieren Sie dann die Platte bei 500 mal G für eine Minute. Wählen Sie das Protokollprogramm in der Thermocycler-Software aus und speichern Sie das Protokoll für zukünftige Platten. Legen Sie die versiegelte Platte in den Thermocycler und führen Sie das Protokoll aus.

Exportieren Sie CT-Werte, und kopieren Sie die Werte in die Beispiel-Ladetabelle. Überprüfen Sie bei der Positivkontrolle, ob mindestens eine Positivkontrollquelle CT-Werte zwischen 22 und 28 für P1- und N1-Sonden erzeugt. Alternativ erzeugen die bekannten positiven Probenvertiefungen P1- und N1-CT-Werte von weniger als 33 auf den Sonden P1 und N1.

Überprüfen Sie bei der Negativkontrolle, ob in keiner der beiden Negativkontrollquellen N1- oder P1-CT-Werte vorhanden sind. Vergewissern Sie sich, dass CT-Werte gültige Verstärkungskurven aufweisen, bevor Sie die Platte ungültig machen. Wenn P1 ein Ergebnis von CT kleiner als 33 ergibt, betrachten Sie den Brunnen als gültig und fahren Sie fort, um von N1 zu resultieren. Wenn P1 ein Ergebnis von CT erzeugt, das größer oder gleich 33 oder kein CT-Wert ist, betrachten Sie den Well als ungültig.

Wenn N1 ein Ergebnis von CT weniger als 33 erzeugt, beurteilen Sie den Brunnen als ja. Wenn N1 keinen CT-Wert erzeugt, bewerten Sie den Brunnen als nein. Wenn N1 einen CT-Wert größer oder gleich 33 erzeugt, bewerten Sie den Brunnen als keinen Stern.

Vergewissern Sie sich, dass alle N1-CT-Werte einer realen Verstärkungskurve zugeordnet sind. Wenn ein CT-Wert für N1 keine Verstärkungskurve hat, ist der Brunnen nein. Identifizieren Sie die wiederholten Proben, kennzeichnen Sie sie mit einer internen Stichprobennummer und einem Probentyp und geben Sie sie an den Ladeworkflow zurück.

Die repräsentativen Bilder zeigen den RTQ PCR-Nachweis von N1 oder SARS CoV-2 synthetischer RNA und P1 oder HSRPP30 synthetischer DNA. Standardkurven wurden mit Standardabweichungen gezeichnet, um den Bereich der genauen Detektion mit dieser Sondenprimerkombination zu bestimmen. Die mittleren CT-Werte, die in den jeweiligen Verdünnungen erhalten wurden, wurden gegen die geschätzte Menge an synthetischer RNA und synthetischer DNA aufgetragen.

In beiden Fällen zeigten die linearen Kurven gute Korrelationskoeffizienten über einen weiten Bereich von Genkopienkonzentrationen. N1-CT-Werte, die aus einzigartigen Proben sowohl unter Verwendung der Roboter- als auch der manuellen Probenbeladung erhalten wurden, wurden transponiert, um die Inter-Assay-Variabilität zwischen der manuellen und der Roboterbeladung zu bestimmen. Die lineare Beziehung zwischen den manuellen und automatisierten Methoden führte zu einem hohen Korrelationskoeffizienten, der darauf hindeutet, dass beide Methoden funktional gleichwertig sind.

Die Intra-Assay-Variabilität wurde auch unter Verwendung transponierter replizierter N1-CT-Werte bestimmt, die sowohl aus dem Roboter als auch aus der manuellen Probenbeladung erhalten wurden. Hier wird die Bewertung von Wärmebehandlungsmethoden zur Viskositätsreduktion im Speichel gezeigt. SARS CoV-2 negativer Speichel wurde aus einer einzigen Quelle gesammelt und Aliquots wurden entweder für null Minuten, 30 Minuten oder 60 Minuten bei 95 Grad Celsius wärmebehandelt.

P1-CT-Werte aus technischen Replikaten jeder Bedingung wurden aufgetragen, um die Variabilität zwischen den Behandlungsmethoden zu bestimmen. Sowohl 30-minütige als auch 60-minütige Wärmebehandlungsmethoden führten zu einer signifikant verringerten Probenvariabilität im Vergleich zu keiner Behandlungskontrolle. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen 30-minütigen und 60-minütigen Behandlungen.

Daher wurde die 30-minütige Wärmebehandlungsmethode implementiert, um die Bearbeitungszeit zu reduzieren. Verwenden Sie die richtige aseptische Technik, um die Kontamination der Prüfplatten zu minimieren, insbesondere beim Laden manueller Proben und Kontrollen. Vermeiden Sie es, den Teller mit den Händen oder Ärmeln zu überqueren.

Nachdem klinische Ergebnisse vorliegen, können Proben in biogefährlichen Abfällen entsorgt oder für weitere Analysen aufbewahrt werden, z. B. für die Sequenzierung des gesamten Genoms, um bestimmte Stämme zu bestimmen. Diese Technik ermöglicht breit angelegte Community-Tests, die es uns ermöglichen, die Auswirkungen der Testabdeckung und die nicht-symptomatische Ausbreitung von Covid 19 zu untersuchen.