Low-Input-Nukleus-Isolierung und Multiplexing mit Barcode-Antikörpern sympathischer Mausganglien für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung

In diesem JoVE-Protokoll verwenden wir die tröpfchenbasierte Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung, um die biologische Architektur von kardialen sympathischen Neuronen in Gesundheit und Krankheit zu charakterisieren. Diese Methode ermöglicht die Sequenzierung einer großen Sammlung neuronaler Proben über einen bestimmten Zeitraum. Durch das Ziehen von Kernen, die mit Hashtag-Oligos barcodiert sind, ermöglicht diese Methode das Multiplexing der Proben.

Diese Methode hat das Potenzial, auf die Sequenzierung von Neuronen der menschlichen Ganglien ausgedehnt zu werden, was aufgrund ihrer großen Zellgröße und der schwierigen gleichzeitigen Entnahme von Proben eine Herausforderung darstellt. Conny van Munsteren, Forschungstechnikerin, und Lieke van Roon, Doktorandinnen aus unserem Labor, demonstrieren Beginnen Sie mit dem Sammeln aller für die Dissektion benötigten Materialien und befestigen Sie dann die Maus auf der Dissektionstafel. Befeuchten Sie die Maus mit 70% Ethanol, um die Ausbreitung des Fells zu minimieren.

Öffnen Sie die Haut der Halsregion, indem Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt machen. Bewegen Sie unter einem Stereomikroskop die subdibulären Drüsen zur Seite und entfernen Sie den Musculus sternalis mastoid, um die gemeinsame Halsschlagader und ihre Verzweigung sowie die oberen zervikalen Ganglien freizulegen und das daran befestigte Gewebe zu entfernen. Sezieren Sie die Verzweigung der rechten und linken Halsschlagader und das daran befestigte Gewebe.

Geben Sie jedes sezierte Stück Gewebe in eine separate 3,5 Zentimeter große Petrischale mit kaltem PBS. Lokalisieren Sie die oberen zervikalen Ganglien, die an der Carotis-Bifurkation befestigt sind. Reinigen Sie die oberen Halsganglien, indem Sie die Arterie und das angeschlossene Gewebe entfernen.

Um die Sternganglien zu sezieren, machen Sie einen Mittellinienschnitt im Bauch, gefolgt von der Öffnung des Zwerchfells und der ventralen Brustwand. Entfernen Sie die Lunge, gefolgt vom Herzen, um den dorsalen Thorax freizulegen. Auf Höhe der ersten Rippe lokalisieren Sie die linke und rechte Sternganglia anterolateral zum Musculus colli longus.

Sezieren Sie beide Sternganglien mit einer Pinzette, indem Sie das umgebende Gewebe entfernen. Übertragen Sie sie auf 3,5 Zentimeter große Petrischalen mit kaltem PBS. Übertragen Sie mit einer Pinzette die oberen zervikalen Ganglien und stellaten Ganglien, um 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu trennen, fügen Sie dann 500 Mikroliter 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie es in einem Schüttelwasserbad.

Lassen Sie die Ganglien sich am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen absetzen. Übertragen Sie den Überstand auf eine 15-Milliliter-Röhre, die fünf Milliliter Ganglienmedium enthält. Zu den Mikrozentrifugenröhrchen 500 Mikroliter Kollagenase-Typ-2-Lösung geben und in einem Schüttelwasserbad inkubieren.

Nach der Inkubation die Ganglien in Kollagenaselösung durch Pipettieren resuspendieren, bis Gewebeklumpen nicht mehr erkannt werden. Übertragen Sie die Zellsuspension auf das zuvor verwendete 15-Milliliter-Röhrchen, das das Ganglienkulturmedium mit Trypsin-EDTA-Suspension enthält. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und verwerfen Sie den Zellüberstand.

Resuspendiert das Pellet in 270 Mikroliter fetalem Rinderserum und überträgt es auf ein 1-Milliliter-Kryo. Um die Zellen zu zählen, mischen Sie 5 Mikroliter der ganglionären Zellsuspension mit fünf Mikrolitern 0,4% trypanblauem Farbstoff. Laden Sie die Mischung in ein Hämozytometer und zählen Sie die Gesamtzahl und die Anzahl der lebenden Zellen unter dem Mikroskop.

Als nächstes fügen Sie 30 Mikroliter Dimethylsulfoxid zu jedem Kryovit hinzu und mischen Sie gut. Die Kryofrüchte in einen Zellgefrierbehälter geben und über Nacht auf minus 80 Grad Celsius stellen. Bereiten Sie 15-Milliliter-Rohre mit einem 30-Mikrometer-Sieb oben drauf vor.

Spülen Sie das Sieb mit 1 Milliliter Ganglienmedium vor. Nehmen Sie die Kryoviale aus flüssigem Stickstoff heraus und tauen Sie sie sofort in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf, bis ein kleines Pellet Eis in der Kryoviale verbleibt. Fügen Sie 1 Milliliter des Ganglienmediums in jedes Kryo hinzu, während Sie die Durchstechflasche vorsichtig schütteln, um die Ganglienzellen wiederherzustellen.

Die Ganglienzellsuspension auf das Sieb laden und mit 4 bis 5 Millilitern Ganglienmedium abspülen. Zentrifen Sie die gespannte Zellsuspension. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern Zellwaschpuffer.

Überführen Sie die Zellsuspension in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Zentrifen Sie die Zellsuspension. Eine Zentrifuge mit schwingendem Eimerrotor ist von nun an unerlässlich.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation 45 Mikroliter des Überstandes, ohne das Zellpellet zu entfernen. Fügen Sie 45 Mikroliter gekühlten Lysepuffer hinzu, vorsichtig durch Pipettieren gemischt, und inkubieren Sie die Zellen für 8 Minuten auf Eis, dann fügen Sie 50 Mikroliter kalten Kernwaschpuffer zu jedem Röhrchen hinzu. Zentrifugieren Sie die Kernsuspension und entfernen Sie 95 Mikroliter des Überstands, ohne das Kernpellet zu stören.

Fügen Sie dem Pellet 45 Mikroliter gekühlten Kernwaschpuffer hinzu, wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand. Zum Kernpellet fügen Sie 50 Mikroliter ST-SB hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, bis die Kerne vollständig resuspendiert sind, dann fügen Sie 5 Mikroliter FC-blockierendes Reagenz hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten auf Eis. Als nächstes fügen Sie 1 Mikroliter einkernigen Hashtag-Antikörper hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten auf Eis.

Nach der Inkubation 100 Mikroliter ST-SB zu jedem Röhrchen hinzufügen. Zentrigieren Sie die Suspension und entfernen Sie 145 Mikroliter des Überstands, ohne das Kernpellet zu stören. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand.

Resuspendiert das Kernpellet in 50 Mikrolitern ST-SB und mischen Sie es schonend. Nehmen Sie 5 Mikroliter der Kernsuspension und mischen Sie sie mit 5 Mikrolitern 0,4% Trypanblau, um die Kerne unter einem Mikroskop zu zählen. Auch hier zentrifugieren Sie die Kernsuspension und resuspendieren Sie das Kernpellet in ST-SB, um eine Zielkernkonzentration von 1.000 bis 3.000 Kernen pro Mikroliter zu erreichen.

Ziehen Sie die Proben, um die gewünschte Anzahl von Zellen zu erreichen. Die Qualitätskontrollanalyse für die Bibliotheksvorbereitung zeigte Hashtag-Oligo-abgeleitete cDNAs, die kleiner als 180 Basenpaare sind. Ein breiter Peak von 300 bis 1.000 Basenpaaren stellte eine hochwertige Genexpressionsbibliothek dar, während ein spezifischer Peak von 194 Basenpaaren den Hashtag Oligo-Bibliothek zeigte.

Die Einzelkern-RNA-Sequenzierungsanalyse ergab, dass 12 Cluster, die von UMAP visualisiert wurden, und Hashtag-Antikörper auf alle Cluster verteilt waren. Die spezifische Kennzeichnung durch Hashtag-Oligos wurde durch den Ausdruck Xist bestätigt. Die Hashtags 1 bis 4 wurden als weiblich bezeichnet, während 5 bis 8 als männliche Proben gekennzeichnet waren.

Die Qualität und Auflösung der Sequenzierungsdaten wurde durch wichtige Transkripte wie TH, DBH und SNAP25 in den Clustern 5 und 7 für sympathische Neuronen, S100B in den Clustern 0 bis 3 für Satellitengliazellen, PECAM 1 in Cluster 4 für Endothelzellen und ACTA2 in Cluster 8 für Stromazellen überprüft. Wenn Sie diese Methode ausprobieren, ist es wichtig, sich an die richtige Vorbereitung zu erinnern, und eine geeignete Ausrüstung wie eine feine Sezierschere, eine scharfe Pinzette und eine Zentrifuge mit einem schwingenden Eimerrotor sind unerlässlich. Der schrittweise Ansatz für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung sympathischer extrinsischer Herzganglien hat das Potenzial für eine breite Anwendung bei der Charakterisierung der Ganglien, die andere verwandte Organe und Gewebe in Gesundheit und Krankheit innervieren.