Entfernung einer internen translationalen Startstelle aus der mRNA unter Beibehaltung der Expression des Protein in voller Länge
16. März 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzelne M213L-Mutation in Gja1, die die Connexin43-Generation in voller Länge beibehält, aber die Translation der kleineren GJA1-20k-intern übersetzten Isoform verhindert.
Die Schwierigkeit bei der Substitution einzelner Rückstände besteht darin, Tiere trotz des Unterschieds in den einzelnen Rückständen effizient zu genotypisieren. Die spezielle Verwendung eines Restriktionsenzyms fügt der typischen PCR-basierten Genotypisierung nur einen einzigen, schnellen und kostengünstigen Schritt hinzu. Dieses Protokoll kann auf jedes andere Mausmodell mit einem Mutationspunkt angewendet werden, wenn die Zielsequenz von einem Restriktionsenzym erkannt wird, was normalerweise der Fall ist.
Schneiden Sie mit einer sauberen Schere ein bis drei Millimeter der Heckspitze ab und geben Sie sie in eine 0,2-Milliliter-Acht-Streifen-PCR-Röhre. Nachdem Sie die im Manuskript beschriebene Schwanzprobe enthalten haben, lagern Sie sie bis zur Extraktion bis zu etwa einer Woche bei T-minus 20 Grad Celsius. Fügen Sie 100 Mikroliter Gewebelyselösung pro Röhrchen hinzu und mischen Sie gut, gefolgt von einem Spin-Down mit einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.200 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur.
Stellen Sie sicher, dass die Schwanzproben in die Lösung eingetaucht sind. Stellen Sie die Röhrchen auf einen Thermocycler-Satz ein, indem Sie die Parameter für die Gewebelyse, Inaktivierung und das Halten programmieren. Lagern Sie das Gewebelysat bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche, wenn die PCR nicht sofort durchgeführt werden kann.
Bereiten Sie eine PCR-Lösung vor, die fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser, 0,75 Mikroliter 10-Mikromolare Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 7,5 Mikroliter PCR-Master-Mix pro Probe zu einem neuen PCR-Röhrchen enthält. Geben Sie einen Mikroliter des zuvor hergestellten Gewebelysats in die PCR-Lösung. Mischen Sie die PCR-Lösung gut und drehen Sie sie mit einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.200 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur herunter.
Stellen Sie die Rohre auf einen programmierten Thermocycler. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, lagern Sie die PCR-Produkte bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Monate oder etwa ein Jahr bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie die Enzymlösung vor, die sieben Mikroliter nukleasefreies Wasser, zwei Mikroliter CutSmart-Puffer mit 10-facher Stärke und einen Mikroliter NlaIII-Restriktionsenzym enthält.
Wenn es mehrere Proben gibt, multiplizieren Sie jeden Inhalt zu der Mischung und aliquot 10 Mikroliter pro Röhrchen. Fügen Sie 10 Mikroliter PCR-Produkt, das zuvor erhalten wurde, der Enzymlösung pro Röhrchen hinzu. Gut mischen und mit der Tisch-Minizentrifuge nach unten drehen, wie zuvor gezeigt.
Stellen Sie die Rohre auf einen programmierten Thermocycler oder Wärmeblock ein. Lagern Sie das Produkt nach der Inkubation unter kalten Bedingungen. Fügen Sie 0,75 Gramm Agarose in 50 Milliliter eindichten TAE-Puffer hinzu.
Rühren und erhitzen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis sie sich vollständig auflöst. Nach dem Abkühlen fünf Mikroliter DNA-Flecken hinzufügen und vorsichtig mischen. Gießen Sie 25 Milliliter des Agarosegels in die Gelform und lassen Sie das Gel erstarren.
Laden Sie 10 Mikroliter verdautes PCR-Produkt in die Vertiefung. Lassen Sie das Gel mit 100 Volt für 35 Minuten laufen. Stellen Sie sich das Agarosegel unter ultraviolettem Licht vor.
Die Agaroseelektrophorese, die mit dem verdauten PCR-Produkt durchgeführt wurde, führte zu mehreren Banden unterschiedlicher Größe in jedem Genotyp, mit zwei Banden im Wildtyp, drei in Heterozygoten und einer bei Homozygoten. Die Testinjektion mit Blastozystenanalyse führte zu einer Erfolgsquote von 76,9% bei der Injektion von 50 Nanogramm pro Mikroliter der Spenderoligos und einer Erfolgsrate von 25% bei der Injektion von 25 Nanogramm pro Mikroliter derselben Spenderoligos. Schließlich wurden durch die Injektion von 50 Nanogramm pro Mikroliter der Spenderoligos mit Ethanolfällung Grundtiere mit einer Erfolgsquote von 50% erzielt.
Die Reinigung von Oligospendern durch Ethanolfällung senkte die Toxizität und behielt gleichzeitig eine hohe Effizienz bei der Genombearbeitung bei. Eine sorgfältige Handhabung und die Zugabe einer geringen Menge an Reagenzien ist sehr wichtig. Stellen Sie sicher, dass sie korrekt hinzugefügt und gut gemischt werden.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Genotypisierung von Tieren mit einer einzelnen M213L-Mutation im Gja1-Gen, die zur Produktion des vollständigen Connexin43 führt, während die Translation des kleineren GJA1-20k-Isoforms verhindert wird. Die Methode betont die Effizienz und Kosteneffektivität des Einsatzes von Restriktionsenzymen in Kombination mit der PCR-basierten Genotypisierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Genetik
- Molekularbiologie
- Tiermodelle
Hintergrund
- Bedeutung der Identifizierung genetischer Mutationen
- Herausforderungen durch Austausch einzelner Aminosäuren
- Anwendung von Restriktionsenzymen in der Genotypisierung
Verwendete Methoden
- PCR-basierte Genotypisierung
- Mausmodelle mit Punktmutationen
- Agarosegelelektrophorese zur DNA-Analyse
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung von Genotypen mit unterschiedlichen Bandenmustern
- Hohe Erfolgsraten bei der Erzeugung von Founder-Tieren
- Bestätigte Effizienz der beschriebenen Methoden für die genetische Analyse
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert ein effizientes Protokoll zur Genotypisierung von Mutationen in Mausmodellen.
- Sie leistet einen wertvollen Beitrag zu Methoden der genetischen Forschung in der Entwicklungsbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Genotypisierung von Punktmutationen in Mausmodellen und unterstützt Target-Validierungsstudien, bei denen die isoformspezifische Proteinausprägung aufgeklärt werden muss. Durch die Eliminierung störender, abgekürzter Isoformen bei gleichzeitiger Erhaltung der Funktion des vollständigen Proteins verbessert es die mechanistische Ent-Risikobewertung in der frühen Entdeckung. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit für therapeutische Hypothesen, die die Biologie von Connexin 43 und verwandte Gap-Junction-Wege betreffen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem der funktionelle Beitrag von vollständigem Cx43 von N-terminal gekürzten Isoformen isoliert wird.
- Operationaler Wert: Bietet ein skalierbares Genotypisierungsverfahren, um wildtypische, heterozygote und homozygote mutante Allele in großen Kohorten zu unterscheiden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem geklärt wird, ob beobachtete Phänotypen auf dem Verlust des vollständigen Proteins oder auf isoformspezifischen Mechanismen beruhen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt DNA-Proben mit Restriktionsfragmentmustern, die für Hochdurchsatz-Screening-Workflows geeignet sind.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die allelespezifische Quantifizierung mittels PCR-Restriktionslängenpolymorphismus-Analyse.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert die Genotypisierung zwischen Laboren durch einen kostengünstigen, einzelnen Enzymzusatz zu bestehenden PCR-Protokollen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Ermöglicht präklinische Modelle, bei denen der Cx43-Transport und die Bildung von Nexus-Kontakten bei kardialen, neuronalen oder onkologischen Erkrankungen eine Rolle spielen.
- Translationale Kohärenz: Verbindet molekularen Genotyp mit phänotypischem Outcome, indem die Expression des vollständigen Cx43 aufrechterhalten und gleichzeitig GJA1-20k reduziert wird.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie die Korrelation von Isoform-Expressionsmengen mit funktionellen in-vivo-Analysen ermöglicht.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein, insbesondere wenn isoformspezifische Proteinfunktionen aufgeklärt werden müssen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem genetische Modelle bereitgestellt werden, die zwischen der Funktion des vollständigen Proteins und der Aktivität verkürzter Isoformen unterscheiden können.
- Screening: Stellt genomische DNA bereit, die sofort für Nachweisverfahren geeignet ist, beispielsweise für die Validierung von CRISPR oder das Management von Zuchtlinien.
- Analysen: Bietet klare, einfach auswertbare Bandenmuster im Agarosegel, die eine schnelle Genotypzuordnung ohne Sequenzierung ermöglichen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht präklinische Studien, bei denen die Membranlokalisation von Cx43 und die interzelluläre Kommunikation entscheidende Wirkmechanismen darstellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anwendbar für jede Punktmutation, bei der ein Restriktionsschnittstelle eingeführt oder unterbrochen werden kann, und bietet somit eine wiederverwendbare Plattform für Genotypisierung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten bei der Target-Validierung, indem isoformspezifische Beiträge isoliert werden.
- Operationaler Wert: Erhöht die Durchsatzkapazität und senkt die Kosten pro Probe durch einen einzigen, nach der PCR durchgeführten Restriktionsverdau.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungssicherheit in der Leitungsoptimierung, indem Genotyp-Phänotyp-Beziehungen geklärt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Kandidaten, die auf Cx43-abhängigen Signalwegen zielen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Molekularbiologie bei der PCR-Primer-Design und der Auswahl von Restriktionsenzymen.
- Setzt Zugang zu Thermocyclern, Agarose-Gelelektrophorese-Systemen und UV-Bildgebungsausrüstung voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Gewebe-Lyse und der PCR-Bedingungen über verschiedene Anwender hinweg, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
- Die Anpassung an alternative Modellsysteme hängt vom Sequenzkontext und der Verträglichkeit mit Restriktionsenzymen ab.
- Auf Mutationen beschränkt, die eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle verändern oder erzeugen; stille Mutationen erfordern möglicherweise alternative Strategien.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
