Name: Entfernung einer internen translationalen Startstelle aus der mRNA unter Beibehaltung der Expression des Protein in voller Länge (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Lernen Sie eine effiziente PCR-basierte Genotypisierungsmethode für Punktmutationen in Mausmodellen unter Verwendung von Restriktionsenzymen. Dieses Protokoll ermöglicht kostengünstige und zuverlässige Identifizierung von Gja1-Mutationen.

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Das Projekt wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 und R01HL159983) an RMS unterstützt.

"Alle Tierpflege- und Studienprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des Cedars-Sinai Medical Center und der University of Utah genehmigt. Für die Experimente wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die im Alter von 8-9 Wochen aus kommerziellen Quellen gewonnen wurden (siehe Materialtabelle).
1. Vorbereitung auf Gen-Targeting
<ol><li>Wählen Sie die Leitzielsequenz um die Zielmutationsstelle herum aus, die M213 kodiert, indem Sie den CRISPOR-Webalgorithmus 4,9,10 verwenden (siehe Materialverzeichnis). HINWEIS: Es wurde eine 20-Basen-Führungssequenz (ATTCAGAGCGAGAGACACCA) im gegenüberliegenden Strang der GJA1-Kodierungssequenz mit einem MIT-Score 11 von 62 ausgewählt, bei der sich die potenzielle Spaltungsstelle nach16 Basen stromabwärts des zu mutierenden Codons (ATG) befindet (Abbildung 1; die gesamte crRNA-Sequenz ist in Tabelle 1 dargestellt).</li>
	<li>Synthetisieren Sie die crRNA und tracrRNA, die mit Cas9 als Leit-RNA12 interagieren. HINWEIS: Obwohl der MIT-Score der Leit-RNA 62 beträgt, gibt es nur eine potenzielle Off-Target-Mutation mit vier Mismatches, die mehr als 12 Basen vom PAM entfernt sind. Daher gilt diese Leitfaden-RNA als sicher.</li>
	<li>Entwerfen Sie ein Spenderoligo komplementär zur Leitsequenz, um eine einzelne Aminosäuresubstitution (ATG zu TTA; M213L) mit 60 bzw. 48 Basen-Homologiearmen auf der 5'- bzw. 3'-Seite. HINWEIS: Dieser Spenderoligo beinhaltet eine Punktmutation zur Störung des PAM (AGG zu ACG) durch Einführung einer stillen Mutation (TCC zu TCG; S217S), um eine erneute Bearbeitung nach CRISPR-homologiegerichteter Reparatur (HDR)13 für die Einführung der beabsichtigten Mutationen zu vermeiden (Abbildung 1 und Tabelle 1).</li>
	<li>Verwenden Sie NaCl (200 mM Endkonzentration), um 10 μg Oligos auszufällen, um den Salzübertrag in den pronukleären Mikroinjektionspuffer zu minimieren (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA und 100 mM NaCl ohne Spermin undSpermidin 14). HINWEIS: Waschen Sie das DNA-Pellet nicht mit 70% Ethanol, da das Pellet in der Lösung gelöst werden kann.</li>
	<li>Mischen Sie 50 ng/μL Donor-Oligo, 60 ng/μL crRNA/tracrRNA-Mix (1:1-Molverhältnis) (aus Schritt 1.2) und 50 ng/μL eSpCas9-Protein (siehe Materialtabelle), um eine CRISPR-Mischung im Endvolumen 20 μL herzustellen (Tabelle 2). Verringern Sie die Konzentration des Spenderoligos, wenn eine hohe Toxizität beobachtet wird (z. B. 25 ng/μL).</li>
</ol>2. Induktion des Superovulations, Ernte von Eiern, pronukleare Mikroinjektion von CRISPR-Mischung und Blastozysten-Screening
HINWEIS: Dieses Verfahren folgt einem zuvor veröffentlichten allgemeinen Protokoll14.
<ol><li>Injizieren Sie 5 IE PMSG (Serumgonadotropin der trächtigen Stute) (siehe Materialtabelle) in 100 μL steriles Wasser an 5-10 Mäuse im Alter von 8 Wochen durch einen intraperitonealen Ansatz bei etwa 3:00 p.m. (Tag 1).</li>
	<li>Injizieren Sie 5 IE hCG (humanes Choriongonadotropin) (siehe Materialtabelle) in 100 μL steriles Wasser an die Eizellspenderinnen durch einen intraperitonealen Ansatz 46-48 h nach PMSG-Injektion (Tag 3). Richten Sie eine 1:1-Zucht mit Deckrüden ein.</li>
	<li>Befruchtete Eier in M2-Medium mit Hyaluronidase ernten, dreimal in 100 μL M2-Medium gegen 10:00 Uhr .m waschen und dann in mWM15 oder KSOM16 Medium (Tag 4) aufbewahren (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die CRISPR-Mischung (Schritt 1.3) wird in Embryonen im 1-Zell-Stadium eingeführt, die von den Mäusen durch pronukleäre Mikroinjektion14 in 100 μL M2, bedeckt mit Paraffinöl, in einer Plastikschale auf einem inversen Mikroskop mit kontrastverstärkender Optik am frühen bis späten Nachmittag entnommen wurden (Video 1). HINWEIS: Die pronukleäre Mikroinjektion der CRISPR-Mischung wurde an Embryonen im 1-Zellstadium bei 14-16 h postcoitum durchgeführt (S.c.). Die injizierten Embryonen wurden in einem 5% CO2-Inkubator für einige Stunden kultiviert und bei 18-20 h p.c. chirurgisch in Empfänger-ICR-Mäuse übertragen, die am selben Morgen einen Kopulationstopfen hatten.</li>
	<li>Übertragen Sie 20-30 2-zellige Embryonen in jeden Empfänger, um rekombinante Tiere zu produzieren. HINWEIS: Befolgen Sie das allgemeine Protokoll14 oder kultivieren Sie diese Embryonen 4 Tage lang in mWM- oder KSOM-Medium, um die Effizienz zu validieren und die Toxizität zu untersuchen. Die Toxizität der CRISPR-Mischung ist akzeptabel, wenn mindestens ein Drittel der injizierten Embryonen früh in das vollständig expandierte Blastozystenstadium mit mehreren Rekombinanten unter ihnen gelangt. Gleichzeitig erreichen mehr als 90% der nicht manipulierten Embryonen in einer Parallelkultur das gleiche Blastozystenstadium. Befolgen Sie die Schritte 2.6-2.9 für das Blastzysten-Screening, das nicht unbedingt erforderlich ist, aber durchgeführt werden kann, wenn es vorgezogen wird, um die Erfolgsrate von HDR zu quantifizieren.</li>
	<li>Individuelle Aufnahme von frühen bis vollständig expandierten Blastozysten mit 2 μL Kulturmedium unter Verwendung einer verstopften feinen Pipettenspitze mit einem Mikropipetter in einzelne PCR-Röhrchen (Tag 8; Video 2).</li>
	<li>Lyseblastozysten in 8 μL Aufschlussmischung (wie Schritt 3.2; siehe Materialtabelle) und bei 75 °C für 10 min, 95 °C für 5 min verarbeiten, dann zur Lagerung auf 4 °C abkühlen. Verwenden Sie 2 μL des Lysats als Vorlage für die PCR in einer insgesamt 15 μL PCR-Mischung (Schritt 3).</li>
	<li>Untersuchen Sie die Wirksamkeit der HDR durch Agarosegelelektrophorese17 der PCR-Proben nach Restriktionsaufschluss mit NlaIII (Schritt 3-5).</li>
	<li>Bestätigen Sie den Status der gezielten Rekombination, indem Sie das 668 bp Amplicon17 bei den Gründern und nachfolgenden Nachkommen sequenzieren, um die Integrität der Mutation zu bestätigen.</li>
</ol>3. DNA-Extraktion
HINWEIS: Mäuse am postnatalen Tag 10 wurden für dieses Experiment aufgrund des plötzlichen Todes der GJA1-20k Knock-out-Maus etwa 2-4 Wochen nach der Geburt4 verwendet. Ein allgemeineres Protokoll kann auch nach dem zuvor veröffentlichten Bericht18 angewendet werden.
<ol><li>Schneiden Sie 1-3 mm der Zehen- oder Schwanzspitze mit einer sauberen Schere ab und geben Sie sie in einen 0,2 ml 8-Streifen-PCR-Schlauch. Um eine Kontamination zwischen den Zehen- oder Schwanzproben zu vermeiden, verwenden Sie eine vorgereinigte Schere oder eine Klinge pro Maus oder reinigen Sie vor jeder Probe mit 70% Ethanol oder 10% Bleichmittel. Wenn der Schwanz nach der Probenahme blutet, üben Sie kurzen Druck mit Gaze aus, um die Blutung zu stoppen. Lagern Sie die Schwanzproben bei -20 °C bis zur Extraktion für bis zu etwa eine Woche.</li>
	<li>Fügen Sie eine Gewebelyselösung (siehe Materialtabelle) in eine 100 μL/Tube und mischen Sie gut, gefolgt von einem Spin-Down mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.200 x g für 10 s bei Raumtemperatur). Stellen Sie sicher, dass die Schwanzproben in die Lösung eingetaucht sind.</li>
	<li>Stellen Sie die Rohre auf einen Thermocycler ein, der nach dem folgenden Programm eingestellt ist; 75 °C für 10 min (Gewebelyse), 95 °C für 5 min (Inaktivierung) und 4 °C (Halten). Lagern Sie das Gewebelysat bei 4 °C bis zu einer Woche, wenn PCRs nicht sofort durchgeführt werden können.</li>
</ol>4. DNA-Amplifikation durch PCR
<ol><li>Es wird eine PCR-Lösung mit 5 μL nukleasefreiemH2O, 0,75 μL 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimern und 7,5 μL PCR-Mastermix (siehe Materialtabelle) pro Probe in ein neues PCR-Röhrchen (siehe Tabelle 1 für Primersequenzen) hergestellt. Wenn es mehrere Proben gibt, skalieren Sie den Inhalt auf aliquot 14 μL pro Röhrchen.</li>
	<li>1 μL des Gewebelysats in die in Schritt 3.1 hergestellte PCR-Lösung geben. Achten Sie darauf, den Schwanz nicht zu berühren.</li>
	<li>Gut mischen und mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.200 x g für 10 s bei Raumtemperatur) nach unten drehen.</li>
	<li>Stellen Sie die Rohre auf einen Thermocycler, der vom unten genannten Programm eingestellt wurde. Lagern Sie die PCR-Produkte bei 4 °C für 1-2 Monate oder ~1 Jahr bei -20 °C. HINWEIS: 95 °C für 3 min (Schritt 1, Erstdenaturierung), 95 °C für 15 s (Schritt 2, Denaturierung), 60 °C für 15 s (Schritt 2, Glühen), 72 °C für 45 s (Schritt 2, Verlängerung), Wiederholungsschritt 2 für 35 Zyklen, 72 °C für 10 min (Schritt 3, Endverlängerung) und 4 °C (Schritt 4, Halten).</li>
</ol>5. Inkubation mit Restriktionsenzym
<ol><li>Bereiten Sie die Enzymlösung vor, die 7 μL nukleasefreiesH2O, 2 μL 10x CutSmart-Puffer und 1 μL NlaIII-Restriktionsenzym enthält (siehe Materialtabelle). Wenn es mehrere Proben gibt, multiplizieren Sie jeden Inhalt zu der Mischung und aliquot 10 μL pro Röhrchen.</li>
	<li>10 μL PCR-Produkt, das in Schritt 3 erhalten wurde, pro Röhrchen in die Enzymlösung geben.</li>
	<li>Gut mischen und mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.200 x g für 10 s bei Raumtemperatur) nach unten drehen.</li>
	<li>Stellen Sie die Rohre auf einen Thermocycler oder Wärmeblock, der vom unten genannten Programm eingestellt wurde. Lagern Sie das Produkt nach der Inkubation bei 4 °C für 1-2 Monate oder ~1 Jahr bei -20 °C. HINWEIS: 37 °C für 16 h (mindestens 2 h; kurze Inkubationszeit kann zu unzureichender Spaltung führen) und 4 °C für das Halten.</li>
</ol>6. DNA-Bandennachweis
<ol><li>Bereiten Sie ein 1,5% iges Agarosegel mit DNA-Gel-Färbung für die Elektrophorese vor.<ol>
<li>Fügen Sie 0,75 g Agarose in 50 ml 1x TAE-Puffer hinzu, gefolgt von Mischung und Hitze in der Mikrowelle, bis sich Agarose vollständig auflöst. Nach dem Abkühlen 5 μL DNA-Fleck hinzufügen und vorsichtig mischen.</li>
		<li>Gießen Sie in die Gelform (25 ml pro Form) und lassen Sie das Gel erstarren. Um eine bessere Auflösung und Trennung zu erhalten, erhöhen Sie die Agarosekonzentration bei Bedarf auf 2,5% -4%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden Sie 10 μL verdautes PCR-Produkt in die Vertiefung. Mischen Sie bei Bedarf 6x Ladepuffer.</li>
	<li>Lassen Sie das Gel mit 100 V für 35 Minuten laufen. HINWEIS: Diese Parameter müssen möglicherweise optimiert werden.</li>
	<li>Bild unter UV-Licht (302 nm Wellenlänge).</li>
</ol>

<ol><li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ein genmodifiziertes Mausmodell ist ein gängiger Ansatz zum Verständnis der Genfunktion. Da jedoch die intern übersetzte Isoform GJA1-20k aus derselben Gja1-mRNA wie die Cx43 in voller Länge übersetzt wird, wurde eine kreative Strategie entwickelt, um die Cx43-Expression in voller Länge beizubehalten und dennoch die GJA1-20k-Expression zu unterdrücken. Der Ansatz basiert auf einer Mutation des internen Startcodons von GJA1-20k. Mit einer Einzelpunktmutation wurde M213 auf L auf Gja1 mRNA umgestellt, wodurch es g...

Das Connexin 43 (Cx43) in voller Länge und die abgeschnittene Isoform N-Terminus, GJA1-20k, kodiert durch dieselbe GJA1-mRNA, verwenden jedoch unterschiedliche Start-Codons1, um die Translation zu initiieren. Die Cx43-Translation erfolgt beim ersten AUG-Startcodon, während die GJA1-20k-Translation am AUG bei Rest 213 beginnt. Es wurde zuvor festgestellt, dass GJA1-20k eine wesentliche Rolle für den Cx43-Transport in voller Länge, die Stabilisierung von Aktin und die Regulation der mitochondrialen Morphologie in vitro 1,2,3 spielt.
Um die Rolle von GJA1-20k in vivo zu verstehen, wurde ein GJA1-20k "Knock-out" -Mausmodell generiert, das die Fähigkeit beibehielt, Cx43 in voller Länge zu erstellen. Der Ansatz bestand darin, das CRISPR-Cas9-System zu verwenden, um den einzelnen Rückstand bei 213 von einem Methionin (M) zu einem Leucin (L) (Gja1M213L/M213L)4 zu ersetzen. Eine interne M-zu-L-Mutation verringert die Wahrscheinlichkeit einer internen Translation dramatisch, behält jedoch die Translation und Funktion des Proteins 4 in voller Längebei. Da der Wildtyp (WT) und das mutierte Allel identische Größen und nahezu identische mRNA-Produkte aufweisen, gibt es erhebliche Schwierigkeiten, den Genotyp in den Mäusen zu bestätigen. Die DNA-Sequenzierung kann die Mutation identifizieren, ist aber für den routinemäßigen Gebrauch zu teuer und zeitaufwendig. Im Allgemeinen haben sich mehrere schnellere Genotypisierungsmethoden etabliert, wie z. B. die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die Minisequenzierungs-Ligation, die hochauflösende Schmelzanalyse und das refraktäre Mutationssystem PCR (ARMS-PCR) 5,6,7,8. Diese alternativen Methoden erfordern jedoch mehrere Schritte, einzigartige Ressourcen und / oder mehrere spezifische Primer-Sets, die unspezifische PCR-Produkte induzieren können.
Dieses Protokoll führt einen detaillierten Gen-Targeting- und Editing-Ansatz von CRISPR-Cas9 ein, um eine einzelne Aminosäuremutation zu erzeugen, und eine schnelle Genotypisierung wird vorgestellt, um die Mutation zu bestätigen. Die Identifizierung des Genotyps beinhaltet die kreative Verwendung von Restriktionsenzymen, bei denen nur ein einziger Satz von Primern verwendet wird, um das Zielgen zu identifizieren. Die Leser werden auf Referenz 4 verwiesen, um die tiefgreifende elektrophysiologische Wirkung des plötzlichen Herztodes zu beobachten, der durch eine Gja1M213L/M213L-Substitutionsmutation mit einem Rückstand verursacht wird, die immer noch ein Protein in voller Länge erzeugt, aber keine kleinere intern übersetzte Trunkierungsisoform erzeugt. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, dass andere Mäusemodelle eine Punktmutation verwenden, um die interne Translation einer Isoform von Interesse zu verringern und gleichzeitig die Expression des endogenen Protein in voller Länge beizubehalten.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL 8-Streifen-PCR-Röhrchen</td><td>Thomas Scientific</td><td>1148A28</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Für nukleäre Mikroinjektionspuffer</td></tr><tr><td>10x CutSmart-Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Aufschlusspuffer für NlaIII</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7,5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>Für vorkernige Mikroinjektionspuffer</td></tr><tr><td>50x TAE Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>24710-030</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Modell # 9902</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>Mausstamm</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Bildgebungssystem</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Zur Aufnahme von Gelbildern mit 302 nm UV-Licht</td></tr><tr><td>eSpCas9 Protein</td><td>MilliporeSigma</td><td>ESPCAS9PRO-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Gel Lading Farbstoff Lila (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>Ladepuffer für die Elektrophorese</td></tr><tr><td>Handschuhe hCG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(humanes Choriongonadotropin)</td><td>MilliporeSigma</td><td>23-073-425G</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3884-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Zur Analyse von Gelbildern</td></tr><tr><td>Inverses Stereomikroskop mit PlasDIC</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert A1</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Maus-Genotypisierungskits</td><td>Roche Diagnostics</td><td>KK7352</td><td>Für Gewebe- oder Zelllyse, DNA-Extraktion und PCR-Mastermix</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>LifeGlobal</td><td>ZEKS-050</td><td>Embryokulturmedium</td></tr><tr><td>Lab coart</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>MilliporeSigma</td><td>MR015D</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td>Zum Verdau von PCR-Produkt</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Zum Verdünnen von Reagenzien</td></tr><tr><td>Paraffinöl</td><td>Nacalai USA</td><td>2613785</td><td></td></tr><tr><td>Plugged 20 &mu; L feine Pipettenspitze</td><td>FisherScientific</td><td>02-707-171</td><td>Zur Aufnahme von Blastozyten</td></tr><tr><td>PMSG (trächtige Stute' s Serum Gonadotropin)</td><td>ProSpec-Tany</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td>Für pronukleäre Mikroinjektionspuffer</td></tr><tr><td>SYBR safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Zum Nachweis von Banden in Gel</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002000-120</td><td>Guid RNA</td></tr></tbody></table>

entfernung einer internen translationalen startstelle aus der mrna unter beibehaltung der expression des protein in voller länge

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Das Gen-Editing-System CRISPR-Cas9, das auf Genomreparaturmechanismen basiert, ermöglicht die schnellere und einfachere Generierung genmodifizierter Mausmodelle im Vergleich zur traditionellen homologen Rekombination. Das CRISPR-Cas9-System ist besonders attraktiv, wenn eine Einzelpunktmutation gewünscht wird. Das Gap-Junction-Protein, Connexin 43 (Cx43), wird vom Gen Gja1 kodiert, das ein einzelnes kodierendes Exon hat und nicht gespleißt werden kann. Gja1 produziert jedoch nicht nur Cx43-Protein in voller Länge, sondern bis zu sechs N-terminus-abgeschnittene Isoformen durch einen Prozess, der als interne Translation bekannt ist, das Ergebnis der ribosomalen Translationsinitiierung an internen AUG-Startstellen (Methionin). GJA1-20k ist die am häufigsten erzeugte abgeschnittene Isoform von Cx43, die am AUG-Codon an Position 213 der Gja1-mRNA initiiert wurde. Da der Rest 213 am Ende der letzten Transmembrandomäne von Cx43 auftritt, ist GJA1-20k effektiv der 20 kDa C-Terminus-Schwanz von Cx43 als unabhängiges Protein. Frühere Forscher identifizierten in Zellen, dass eine entscheidende Rolle von GJA1-20k darin besteht, den Handel von Cx43-Gap-Junction-Hemikanälen in voller Länge zur Plasmamembran zu erleichtern. Um dieses Phänomen in vivo zu untersuchen, wurde eine mutierte Maus mit einer Gja1-Punktmutation erzeugt, die das ATG (Methionin) am Rest 213 durch TTA (Leucin, M213L-Mutation) ersetzt. Das Ergebnis von M213L ist, dass Gja1 mRNA und Cx43 in voller Länge immer noch erzeugt werden, die Translation von Gja1-20k jedoch signifikant reduziert ist. Dieser Bericht konzentriert sich auf die Auswahl der Restriktionsenzymstelle, um ein mit einer Aminosäure mutiertes (Gja1 M213L/ M213L) Mausmodell zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt genetisch veränderte Mäuse durch das CRISPR-Cas9-System und die schnelle Genotypisierung durch Kombination von PCR- und Restriktionsenzymbehandlungen.

Das CRISPR/Cas9-Gen-Editing-System erzeugt eine ATG-zu-TTA-Mutation und eine stille TCC-zu-TCG-Mutation bei 56.264.279 bis 56.264.281 und bei 56.264.291 bis 56.264.293 auf Mauschromosom 10 bzw. bei 869 bis 871 bzw. 881 bis 883 auf Gja1-mRNA. Diese Mutation führt zu einer Mutation von Methionin 213 zu Leucin (M213L) auf dem GJA1-Protein, und die TTC-zu-TTG-Mutation stört eine nahe gelegene PAM-Sequenz, um eine unerwünschte Genedition zu vermeiden (Abbildung 1). Die Details der Mutation sind i...

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzelne M213L-Mutation in Gja1, die die Connexin43-Generation in voller Länge beibehält, aber die Translation der kleineren GJA1-20k-intern übersetzten Isoform verhindert.

Entfernung einer internen translationalen Startstelle aus der mRNA unter Beibehaltung der Expression des Protein in voller Länge

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

Die Schwierigkeit bei der Substitution einzelner Rückstände besteht darin, Tiere trotz des Unterschieds in den einzelnen Rückständen effizient zu genotypisieren. Die spezielle Verwendung eines Restriktionsenzyms fügt der typischen PCR-basierten Genotypisierung nur einen einzigen, schnellen und kostengünstigen Schritt hinzu. Dieses Protokoll kann auf jedes andere Mausmodell mit einem Mutationspunkt angewendet werden, wenn die Zielsequenz von einem Restriktionsenzym erkannt wird, was normalerweise der Fall ist.Schneiden Sie mit einer sauberen Schere ein bis drei Millimeter der Heckspitze ab und geben Sie sie in eine 0,2-Milliliter-Acht-Streifen-PCR-Röhre. Nachdem Sie die im Manuskript beschriebene Schwanzprobe enthalten haben, lagern Sie sie bis zur Extraktion bis zu etwa einer Woche bei T-minus 20 Grad Celsius. Fügen Sie 100 Mikroliter Gewebelyselösung pro Röhrchen hinzu und mischen Sie gut, gefolgt von einem Spin-Down mit einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.200 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur.Stellen Sie sicher, dass die Schwanzproben in die Lösung eingetaucht sind. Stellen Sie die Röhrchen auf einen Thermocycler-Satz ein, indem Sie die Parameter für die Gewebelyse, Inaktivierung und das Halten programmieren. Lagern Sie das Gewebelysat bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche, wenn die PCR nicht sofort durchgeführt werden kann.Bereiten Sie eine PCR-Lösung vor, die fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser, 0,75 Mikroliter 10-Mikromolare Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 7,5 Mikroliter PCR-Master-Mix pro Probe zu einem neuen PCR-Röhrchen enthält. Geben Sie einen Mikroliter des zuvor hergestellten Gewebelysats in die PCR-Lösung. Mischen Sie die PCR-Lösung gut und drehen Sie sie mit einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.200 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur herunter.Stellen Sie die Rohre auf einen programmierten Thermocycler. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, lagern Sie die PCR-Produkte bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Monate oder etwa ein Jahr bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie die Enzymlösung vor, die sieben Mikroliter nukleasefreies Wasser, zwei Mikroliter CutSmart-Puffer mit 10-facher Stärke und einen Mikroliter NlaIII-Restriktionsenzym enthält.Wenn es mehrere Proben gibt, multiplizieren Sie jeden Inhalt zu der Mischung und aliquot 10 Mikroliter pro Röhrchen. Fügen Sie 10 Mikroliter PCR-Produkt, das zuvor erhalten wurde, der Enzymlösung pro Röhrchen hinzu. Gut mischen und mit der Tisch-Minizentrifuge nach unten drehen, wie zuvor gezeigt.Stellen Sie die Rohre auf einen programmierten Thermocycler oder Wärmeblock ein. Lagern Sie das Produkt nach der Inkubation unter kalten Bedingungen. Fügen Sie 0,75 Gramm Agarose in 50 Milliliter eindichten TAE-Puffer hinzu.Rühren und erhitzen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis sie sich vollständig auflöst. Nach dem Abkühlen fünf Mikroliter DNA-Flecken hinzufügen und vorsichtig mischen. Gießen Sie 25 Milliliter des Agarosegels in die Gelform und lassen Sie das Gel erstarren.Laden Sie 10 Mikroliter verdautes PCR-Produkt in die Vertiefung. Lassen Sie das Gel mit 100 Volt für 35 Minuten laufen. Stellen Sie sich das Agarosegel unter ultraviolettem Licht vor.Die Agaroseelektrophorese, die mit dem verdauten PCR-Produkt durchgeführt wurde, führte zu mehreren Banden unterschiedlicher Größe in jedem Genotyp, mit zwei Banden im Wildtyp, drei in Heterozygoten und einer bei Homozygoten. Die Testinjektion mit Blastozystenanalyse führte zu einer Erfolgsquote von 76,9% bei der Injektion von 50 Nanogramm pro Mikroliter der Spenderoligos und einer Erfolgsrate von 25% bei der Injektion von 25 Nanogramm pro Mikroliter derselben Spenderoligos. Schließlich wurden durch die Injektion von 50 Nanogramm pro Mikroliter der Spenderoligos mit Ethanolfällung Grundtiere mit einer Erfolgsquote von 50% erzielt.Die Reinigung von Oligospendern durch Ethanolfällung senkte die Toxizität und behielt gleichzeitig eine hohe Effizienz bei der Genombearbeitung bei. Eine sorgfältige Handhabung und die Zugabe einer geringen Menge an Reagenzien ist sehr wichtig. Stellen Sie sicher, dass sie korrekt hinzugefügt und gut gemischt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Eine Technik zur translationalen Pause Sites auf mRNA zu identifizieren beschrieben wird. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide ansammeln auf Ribosomen während der in vitro Translation einer Ziel-mRNA, durch die Größe Analyse der naszierenden Ketten mit Hilfe eines denaturierenden Gelelektrophorese gefolgt basiert.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

Wir beschreiben hier eine Technik, die inzwischen routinemäßig eingesetzt wird, um stabil gebundene Ribosomen entstehenden Kette Komplexen (RNC) zu isolieren. Diese Technik nutzt die Entdeckung, dass ein 17 Aminosäuren langes SecM "Verhaftung Sequenz" können Translationselongation in einem prokaryotischen aufzuhalten...

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen,...

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

Viele mRNAs mitochondriale Proteine ​​kodieren, sind mit der äußeren Mitochondrien-Membran verbunden. Wir beschreiben eine subzellulärer Fraktionierung Verfahren auf Isolierung von Hefe-Mitochondrien mit den zugehörigen mRNAs und Ribosomen ab. Dieses Protokoll kann auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, um die Mechanismen der mRNA-Lokalisierung und Übersetzung lokalisiert in der Nähe der Mitochondrien zeigen angewendet werden.

Isolierung von mRNAs Verbunden mit Hefe-Mitochondrien Study Mechanismen der lokalisierten Übersetzung

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Toeprinting zielt darauf ab, die Möglichkeit der in-vitro- Messung transkribierte RNA zu Form Übersetzung Einleitung komplexe mit Ribosomen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Toeprinting Säugetieren RNA und kann zur GAP-abhängige und IRES-driven Übersetzung zu studieren.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Die direkte Lieferung von vormontierten Cas9/Guide-RNA-Ribonukleoprotein-Komplexen ist ein schnelles und effizientes Mittel zur Genombearbeitung in hämatopoetischen Zellen. Hier nutzen wir diesen Ansatz, um einen RUNX1 intronic Schalldämpfer zu löschen und die Transkriptionsreaktionen in OCI-AML3-Leukämischen Zellen zu untersuchen.

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

Dieses Verfahren beschreibt, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren und wird durch Transfektion mit dem Gene Pulser MXCell Elektroporation Systems.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Hier zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid mit Standard-Reagenzien einzuführen.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Lernen Sie eine effiziente PCR-basierte Genotypisierungsmethode für Punktmutationen in Mausmodellen unter Verwendung von Restriktionsenzymen. Dieses Protokoll ermöglicht kostengünstige und zuverlässige Identifizierung von Gja1-Mutationen.

Entfernung einer internen translationalen Startstelle aus der mRNA unter Beibehaltung der Expression des Protein in voller Länge (Video) | JoVE Journal

Entfernung einer internen translationalen Startstelle aus der mRNA unter Beibehaltung der Expression des Protein in voller Länge

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