Name: Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Erfahren Sie eine markierungsfreie Segmentierungsmethode für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen. Diese Technik nutzt Kollagen-SHG und NAD(P)H-Autofluoreszenz zur Unterteilung in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente.

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Die Autoren möchten NCI R01 CA216248, CA206458 und CA179556 Zuschüsse für die Finanzierung dieser Arbeit anerkennen. Wir möchten auch Dr. Kevin Eliceiri und seiner Imaging-Gruppe für ihre technische Expertise bei der frühen Entwicklung unseres intravitalen Programms danken. Wir danken auch Dr. Ben Cox und anderen Mitgliedern der Eliceiri Fabrication Group am Morgridge Institute for Research für ihr wesentliches technisches Design während der frühen Phasen des MIW. Dr. Ellen Dobson half mit nützlichen Gesprächen über das trainierbare WEKA-Segmentierungstool ImageJ. Darüber hinaus möchten wir uns bei Dr. Melissa Skala und Dr. Alexa Barres-Heaton für den rechtzeitigen Einsatz ihres Mikroskops bedanken. Abschließend möchten wir uns bei Dr. Brigitte Raabe, D.V.M., für all die nachdenklichen Diskussionen und Ratschläge zu unserem Umgang mit und unserer Pflege der Maus bedanken.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die intravitale 4D-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung dynamischer physiologischer Wechselwirkungen im räumlichen und zeitlichen Kontext der nativen Tumormikroumgebung. Dieses Manuskript bietet einen sehr grundlegenden und anpassungsfähigen Betriebsrahmen, um dynamische Zellinteraktionen innerhalb der Tumormasse, des benachbarten Stromas oder in der Nähe des Gefäßnetzwerks zu unterteilen, wobei nur endogene Signale aus der zweiten harmonischen Erzeugung oder der NAD(P)H-Autofluoreszenz verwendet...

Es ist bekannt, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) in der Tumormikroumgebung von mehreren Zelltypen dynamisch abgelagert und ummodelliert wird, um das Fortschreiten der Krankheit weiter zu erleichtern 1,2,3. Diese Matrixveränderungen liefern sowohl mechanische als auch biologische Hinweise, die das Zellverhalten verändern und oft zu einem kontinuierlichen Zyklus der Matrixumgestaltungführen 4. Die Untersuchung des dynamischen, wechselseitigen Zusammenspiels zwischen Tumorzellen und der extrazellulären Matrix erfolgt häufig mittels dreidimensionaler (3D) In-vitro-Kultur oder mikrofluidischer Systeme. Während diese Bottom-up-Ansätze Mechanismen der ECM-Remodellierung 5,6,7, der erhöhten Proliferation 8, des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs 9,10,11,12 und der Tumorzellmigration und -invasion7,13,14,15,16 gezeigt haben lag ihr Fokus in erster Linie auf einigen wenigen Zelltypen (z. B. Tumorzellen oder Fibroblasten) innerhalb einer homogenen 3D-Matrix im Vergleich zur Vielfalt und Heterogenität der Interaktionen innerhalb eines physiologischen Gewebes. Neben In-vitro-Systemen kann auch die Ex-vivo-Tumorhistologie einen Einblick in diese Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionengeben 17. Die Immunhistochemie hat den Vorteil, dass sie mehrere Zelltypen in Bezug auf die räumlich heterogene Zusammensetzung und Architektur der EZM analysieren kann, aber die statischen Endpunkte von fixiertem Gewebe erfassen nicht die dynamische Natur der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der Mikroumgebung. Die intravitale Bildgebung hat die Tür geöffnet, um vielfältige und dynamische Interaktionen im physiologischen Kontext der nativen Tumormikroumgebung zu hinterfragen.
Die Fähigkeiten der intravitalen Tumorbildgebung entwickeln sich rasant weiter. Verbesserungen im Design von Bildgebungsfenstern und chirurgischen Techniken zur Implantation der Fenster haben eine langfristige longitudinale Tumorbildgebung an einer Vielzahl von anatomischen Stellen (d.h. Primärtumor, Lymphknoten, metastasierende Stellen18,19,20) ermöglicht. Darüber hinaus wird die Fähigkeit optischer Instrumente, Daten in mehreren Dimensionen (d. h. spektrale, räumliche Fluoreszenzintensität und Lebensdauer) sowie mit hoher Auflösung und Geschwindigkeit (Videorate) zu visualisieren und zu sammeln, immer zugänglicher. Die verbesserte Technologie bietet die Möglichkeit, schnelle Veränderungen der Zellsignalisierung und der phänotypischen Dynamik in einer physiologischen Umgebung zu untersuchen. Schließlich ermöglichen die Erweiterung optogenetischer Werkzeuge und die breite Palette genetischer Fluoreszenzkonstrukte die Markierung spezifischer Zelltypen, um die Zellmigration in der Tumormikroumgebung oder die Zelllinienverfolgung während der Entwicklung oder des Krankheitsverlaufs zu erfassen21,22. Der Einsatz dieser Werkzeuge in Kombination mit der CRISPR/Cas9-Technologie bietet Forschern die Möglichkeit, zeitnah einzigartige Tiermodelle zu generieren.
Während all diese Fortschritte die intravitale Bildgebung zu einer immer leistungsfähigeren Methode zur Erforschung dynamischer und physiologischer zellulärer Interaktionen machen, besteht immer noch ein wichtiger Bedarf, Strategien zu entwickeln, die diesen biologischen Interaktionen einen räumlichen, zeitlichen und strukturellen Kontext auf Gewebeebene bieten. Derzeit kompensieren viele intravitale Bildgebungsstudien den Mangel an visuellen Landmarken wie Blutgefäßen, indem sie fluoreszierende Farbstoffe in das Gefäßsystem injizieren oder Mausmodelle verwenden, die exogen fluoreszierende Proteine exogen exprimieren, um physikalische Merkmale abzugrenzen. Injizierbare Farbstoffe und Substrate wie fluoreszierendes Dextrans werden breit eingesetzt, um das Gefäßsystem in intravitalen Sammlungen19, 23, 24 erfolgreich zu beschriften. Dieser Ansatz ist jedoch nicht ohne Einschränkungen. Zum einen erfordert es zusätzliche Mausmanipulationen und sein Nutzen beschränkt sich auf kurzfristige Experimente. Für Längsschnittstudien kann fluoreszierendes Dextran problematisch sein, da wir die Ansammlung von Dextran in phagozytären Zellen oder die Diffusion in das umgebende Gewebe im Laufe der Zeit beobachten25. Die exogene fluoreszierende Proteinintegration in das Mausmodell wurde als Alternative zu fluoreszierendem Dextrans vorgestellt, weist jedoch eigene Einschränkungen auf. Die Verfügbarkeit und Vielfalt exogener Fluorophore in Mausmodellen ist immer noch begrenzt und teuer in der Herstellung. Darüber hinaus sind genetische Manipulationen in bestimmten Modellen, wie z. B. PDX-Modellen, nicht wünschenswert oder möglich. Es wurde auch gezeigt, dass das Vorhandensein von fluoreszierenden oder biolumineszierenden Proteinen in Zellen innerhalb der Maus als fremd erkannt wird, und in immunkompetenten Mausmodellen reduziert dies die Menge an Metastasen aufgrund der Reaktion des Immunsystems des Wirts26,27. Schließlich belegen exogene fluoreszierende Proteine oder fluoreszierende Farbstoffe, die für den räumlichen Kontext oder zur Segmentierung nachfolgender Daten verwendet werden, häufig Primbereiche des Lichtspektrums, die sonst zur Untersuchung der physiologischen Wechselwirkungen von Interesse verwendet werden könnten.
Die Verwendung des intrinsischen Signals aus dem ECM oder der endogenen Fluoreszenz von Zellen innerhalb des Gewebes stellt ein potenzielles universelles markierungsfreies Mittel zur Segmentierung intravitaler Daten für eine eingehendere zelluläre und räumliche Analyse dar. Die zweite harmonische Generation (SHG) wird seit langem zur Visualisierung des ECM28 verwendet. Mit der anschließenden Entwicklung wichtiger Werkzeuge zur Charakterisierung der Faserorganisation 29,30,31 ist es möglich, das Zellverhalten relativ zur lokalen ECM-Struktur zu charakterisieren. Darüber hinaus bietet die Autofluoreszenz des endogenen Metaboliten NAD(P)H ein weiteres markierungsfreies Werkzeug, um die Tumormikroumgebung in vivo zu kompartimentieren. NAD(P)H fluoresziert hell in Tumorzellen und kann verwendet werden, um die Grenzen des wachsenden Tumornestes von seinem umgebenden Stroma21,32 zu unterscheiden. Schließlich ist das Gefäßsystem eine wichtige physiologische Struktur in der Tumormikroumgebung und der Ort der wichtigsten zelltypspezifischen Interaktionen33,34,35. Die Anregung von roten Blutkörperchen (RBC) oder Blutplasma wurde verwendet, um das Tumorgefäßsystem sichtbar zu machen, und unter Verwendung der Zwei- oder Drei-Photonen-Anregung (2P; 3P) hat sich die Messung der Blutflussraten als möglicherwiesen 36. Während größere Blutgefäße jedoch leicht durch ihre endogenen Fluoreszenzsignaturen identifizierbar sind, erfordert die Identifizierung subtiler, variabler und weniger fluoreszierender kleiner Blutgefäße mehr Fachwissen. Diese inhärenten Schwierigkeiten behindern eine optimale Bildsegmentierung. Glücklicherweise können diese Quellen der endogenen Fluoreszenz (d. H. Rote Blutkörperchen und Blutplasma) auch durch Fluoreszenzlebensdauerbildgebung37 gemessen werden, die die einzigartigen photophysikalischen Eigenschaften des Gefäßsystems nutzt und eine nützliche Ergänzung der wachsenden intravitalen Toolbox darstellt.
In diesem Protokoll wird ein Workflow zur Segmentierung der vierdimensionalen (4D) intravitalen Bildgebung beschrieben, der explizit intrinsische Signale wie endogene Fluoreszenz und SHG von der Erfassung bis zur Analyse verwendet. Dieses Protokoll ist besonders relevant für Längsschnittstudien durch ein Brustbildgebungsfenster, in dem exogene Fluoreszenz möglicherweise nicht praktikabel oder möglich ist, wie dies bei PDX-Modellen der Fall ist. Die hier beschriebenen Segmentierungsprinzipien sind jedoch weitgehend auf intravitale Anwender anwendbar, die Tumorbiologie, Gewebeentwicklung oder sogar normale Gewebephysiologie untersuchen. Die berichtete Suite von Analyseansätzen wird es den Benutzern ermöglichen, das zelluläre Verhalten zwischen Regionen ausgerichteter oder zufälliger Kollagenfaserkonfigurationen zu unterscheiden, die Anzahl oder das Verhalten von Zellen zu vergleichen, die sich in bestimmten Regionen der Tumormikroumgebung befinden, und das Gefäßsystem der Tumormikroumgebung zuzuordnen, wobei nur markierungsfreie oder intrinsische Signale verwendet werden. Zusammen schaffen diese Methoden einen operativen Rahmen für die Maximierung der Informationstiefe aus der intravitalen 4D-Bildgebung der Brustdrüse bei gleichzeitiger Minimierung des Bedarfs an zusätzlichen exogenen Markierungen.

<table><tbody><tr><td>#1.5 12mm rundes Deckglas</td><td>Warner Instruments</td><td># 64-0712</td><td>MIW Konstruktion</td></tr><tr><td>1,0 mL Spritze für SQ Injektion</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Spritze</td></tr><tr><td>20x Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>421452-988</td><td>Wasserimmersion</td></tr><tr><td>27G Nadel für SQ Injektion</td><td>Covidien</td><td>1188827012</td><td>Nadel</td></tr><tr><td>40x Objektiv</td><td>Nikon</td><td>MRD77410</td><td>Wasserimmersion</td></tr><tr><td>5-0 geflochtenes Seidennaht</td><td>Ethicon</td><td>K870</td><td>Naht für MIW-Implantation</td></tr><tr><td>Künstliches Tränengel</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td>Augengel</td></tr><tr><td>Betadin-Lösung, 5%Fisher</td> <td>Scientific</td><td>NC1558063</td><td>Surgery antiseptischer</td></tr><tr><td>Applikator mit Wattespitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Klebstoff</td><td>Loctite</td><td>1365882</td><td>MIW-Konstruktion</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Dextran</td><td>Sigma</td><td>T1287-50mg</td><td>intravenöse Markierung von</td></tr><tr><td>Gefäßzangen</td><td>Mckesson.com</td><td>Miltex&nbsp;#18-782</td><td>Edelstahl, 4 Zoll, gebogene</td></tr><tr><td>GaAsP Photomultiplier-Röhre</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizdecke</td><td>CARA 72 Heizkissen</td><td>&nbsp; 038056000729</td><td>Temperaturwählbare</td></tr><tr><td>Heizkammer</td><td>Selbstgebaute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstoffröhren-Lebensdauer-Handbuch</td><td>Becker und Hickl</td><td></td><td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td></tr><tr><td>inverse Mikroskopbasis</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-106-01</td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>Liqui-Nox</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-000-125</td><td>MIW Reinigung</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>Analgetikum</td></tr><tr><td>Mikroschlauch</td><td>Scientific Commodities INC.</td><td>&nbsp; BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonen-Scankopf</td><td>Bruker Ultima II</td><td></td><td>Multiphotonen-Scankopf und Bildgebungsplattform</td></tr><tr><td>NADH FLIM-Filter</td><td>Chroma</td><td>284994</td><td>ET 440/80 m-2P</td></tr><tr><td>Nair</td><td>CVS</td><td>339826</td><td>Enthaarungscreme</td></tr><tr><td>Objektivheizung</td><td>Tokai</td><td>Hit STRG-WELSX-SET</td><td></td></tr><tr><td>SHG/FAD-Filter</td><td>Chroma</td><td>320740</td><td>ET450/ 40m-2P</td></tr><tr><td>Sparkle Glasreiniger</td><td>Amazon.com</td><td>B00814ME24</td><td>Glasreiniger für implantierte MIW</td></tr><tr><td>SPC-150 Photonenzählplatine</td><td>Becker und Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP-Leuchte</td><td>FAJ</td><td>B06XV1VQVZ</td><td>Magnetische LED-Schwanenhalsleuchte</td></tr><tr><td>chirurgische Mikroschere</td><td>Excelta</td><td>366</td><td>Edelstahl, 3 Zoll</td></tr><tr><td>Dreifache antibiotische Salbe</td><td>Actavis Pharma</td><td>NDC 0472-0179-34</td><td>Antibiotischer</td></tr><tr><td>TV-Katheter</td><td>Benutzerdefinierte</td><td>BD 30G-Nadel: 305106</td><td>Katheter für TV-Injektion</td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Filter</td><td>Chroma</td><td>320282</td><td>ET585/65m-2P</td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Laser</td><td>Kohärenter Charmeleon</td><td></td><td>Abstimmbares Multiphotonen-Laser-Ultraschallgel</td></tr><tr><td></td><td>Parker</td><td>PKR-03-02</td><td>Wasser-Immersionsgel</td></tr><tr><td>Harnstoff Quarze</td><td>Sigma</td><td>U5128-5G</td><td>Optional: FLIM IRF</td></tr></tbody></table>

ein markierungsfreier segmentierungsansatz für die intravitale bildgebung von brusttumor-mikroumgebungen

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Die Fähigkeit, komplexe und dynamische physiologische Interaktionen zwischen zahlreichen Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb einer lebenden Tumormikroumgebung zu visualisieren, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis von Mechanismen, die das Fortschreiten von Tumoren regulieren. Während dies durch aktuelle intravitale Bildgebungsverfahren erreicht werden kann, bleibt es aufgrund der heterogenen Natur der Gewebe und der Notwendigkeit eines räumlichen Kontexts innerhalb der experimentellen Beobachtung eine Herausforderung. Zu diesem Zweck haben wir einen intravitalen Bildgebungs-Workflow entwickelt, der Kollagen-Bildgebung der zweiten harmonischen Generation, endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD (P) H und Fluoreszenz-Lifetime-Imaging-Mikroskopie (FLIM) kombiniert, um die Tumormikroumgebung nicht-invasiv in grundlegende Domänen des Tumornestes, des umgebenden Stromas oder ECM und des Gefäßsystems zu unterteilen. Dieses nicht-invasive Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess, der von der Aufnahme von Zeitrafferbildern von Brusttumormodellen bis hin zur Nachbearbeitungsanalyse und Bildsegmentierung reicht. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, dass er metabolische Signaturen nutzt, um die sich dynamisch verändernde Mikroumgebung von lebenden Tumoren ohne die Verwendung exogener fluoreszierender Markierungen zu kontextualisieren, was ihn für PDX-Modelle (Human Patient-derived Xenograft) und den zukünftigen klinischen Einsatz, bei dem extrinsische Fluorophore nicht ohne weiteres anwendbar sind, vorteilhaft macht.

Die Installation des MIW und die grundlegende experimentelle Planung sind die ersten Schritte in diesem Prozess. Dieses spezielle MIW-Design und -Protokoll sind für Längsschnittstudienbesser geeignet 19 und wurden sowohl mit aufrechten als auch mit inversen Mikroskopen erfolgreich eingesetzt. In diesem Fall wurde ein inverses Mikroskop verwendet, da dies zu einer größeren Bildstabilität der Brustdrüse mit weniger Atemartefakten geführt hat. In Abbildung 1A stellen wir...

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Die intravitale Bildgebung ermöglicht es uns, physiologische Wechselwirkungen innerhalb der Tumormikroumgebung zu beobachten. Und durch die Verwendung dieser Methode können spezifische dynamische Verhaltensweisen, die beobachtet werden, unter Verwendung lokaler Gewebemerkmale unterteilt werden. Dieses Protokoll verwendet nur ein allgegenwärtiges markierungsfreies Signal von Kollagenfasern oder autofluoreszierenden Metaboliten, um die TME zu segmentieren, wodurch die Anzahl der Manipulationen an der Maus minimiert wird.Diese Methode ist weitgehend auf jedes intravitale System anwendbar, in dem das Verständnis dynamischer Wechselwirkungen in Bezug auf extrazelluläre Matrixstrukturen oder Gefäßstrukturen erforderlich ist. Dave Inman, Senior Research Specialist, und Erica Hoffmann, eine Doktorandin aus dem Labor, werden dieses Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Brustbildfenster-Deckglases, indem Sie ein 1,5 12 Millimeter langes rundes Deckglas 10% Ethanol für 10 Minuten einweichen, dann das Deckglas unter einer Wärmelampe trocknen und das Glas mit Cyanacrylat-Klebstoff am Metall-Brustbild-Fensterrahmen befestigen.Härten Sie den Klebstoff über Nacht aus. Verwenden Sie am nächsten Tag einen mit Aceton getränkten Tupfer, um das zusammengebaute Brustbildgebungsfenster von dem überschüssigen Klebstoff zu reinigen, bevor Sie das Brustbildgebungsfenster mindestens 10 Minuten lang in 70% Ethanol tauchen, um die Reinigung zu unterstützen. Nach dem Trocknen das gereinigte Brustbildfenster in einer sterilen Petrischale aufbewahren.Bevor Sie mit der Operation für die Fensterimplantation beginnen, autoklavieren Sie chirurgische Werkzeuge und desinfizieren Sie Oberflächen mit 70% Ethanol. Bereiten Sie eine desinfizierte Tischplatte für die Operation mit einer wärmenden Decke vor, die mit einem sterilen Feld bedeckt ist. Stellen Sie die Wärmedecke so ein, dass die Temperatur, die oben auf dem sterilen Feld gemessen wird, 40 Grad Celsius beträgt.Verwenden Sie für den chirurgischen Eingriff eine zusätzliche Kältebeleuchtung und Lupen. Tragen Sie eine PSA, die aus einem sterilen Einweg-Laborkittel, chirurgischen Hüllen, Handschuhen, Augenschutz und Gesichtsmaske besteht. Als nächstes entfernen Sie das Fell der betäubten Maus an der vierten Leistenbrust mit einer Enthaarungscreme und spülen Sie die Operationsstelle mit einer sterilen wassergetränkten Gaze ab.Bereiten Sie dann die enthaarte Operationsstelle für die Operation vor, indem Sie die Hautoberfläche mit drei abwechselnden Betadin- und Ethanolpeelings desinisieren. Wenn Sie fertig sind, heben Sie die Haut sanft über die Brustdrüse Nummer vier mit einer Pinzette an. Sobald die Haut von der Körperwand weggezogen ist, entfernen Sie einen Millimeter Abschnitt der Hautschicht an der Spitze der Pinzette mit einer chirurgischen Mikroschere.Ohne die darunter liegende Drüse zu schneiden, erstellen Sie einen 10-Millimeter-Schnitt und lösen Sie dann die Brustdrüse mit der sanften Bewegung der Pinzette aus der Hautschicht. Fügen Sie PBS hinzu, um die freiliegende Drüse abzudecken. Verwenden Sie eine 5-0 Seidengeflechtnaht, um eine Handtuchsaitennaht entlang der Peripherie der Öffnung zu erstellen, und setzen Sie dann eine Kante des Brustbildgebungsfensters ein, so dass die Hautschicht in die Empfangskerbe des Brustbildgebungsfensters eingreift.Während Sie das Epithel am gegenüberliegenden Ende des Brustbildgebungsfensters dehnen, drücken Sie das Brustbildgebungsfenster aus Metall an seinen Platz, so dass die Hautschicht die empfangende Kerbe um den gesamten Umfang des Brustbildgebungsfensters vollständig einrastet. Ziehen Sie dann die Geldbörsenschnur zusammen, um die Hautschicht in die Kerbe zu ziehen, und binden Sie die Schicht ab, um das Fenster zu sichern. Tragen Sie ein topisches Antibiotikum auf die Hautschicht am Brustbildgebungsfenster auf und überwachen Sie die Maus kontinuierlich.Nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, um die sternale Liegefähigkeit aufrechtzuerhalten, legen Sie die implantierte Maus separat auf weicher Bettwäsche mit einem Iglu im Käfig unter, und lassen Sie die Maus 48 Stunden vor der Bildgebung genesen. Verwenden Sie für die Bildgebung ein auf 30 Grad Celsius eingestelltes Zwangsluftsystem. Verwenden Sie eine zusätzliche Objektivheizung, um Drift im Z-Fokus zu vermeiden und das System vor der Bildgebung mindestens eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius ins Gleichgewicht zu bringen.Stellen Sie dann eine Heizkammer auf der Mikroskopstufe auf. Nachdem Sie die Anästhesie mit der Zehenquetschmethode bestätigt haben, fügen Sie der Maus eine Augensalbe hinzu. Um die richtige Hydratation aufrechtzuerhalten, injizieren Sie alle zwei Stunden für die Dauer der Bildgebungssitzung 0,5 Milliliter PBS subkutan.Tragen Sie ein Gel auf Wasserbasis anstelle von Wasser auf das Objektiv auf und reinigen Sie die Außenseite des Brustbildfensterglases mit einem Baumwollapplikator und einem Glasreiniger, bevor Sie die Maus in die vorgewärmte Mikroskopstufe bringen. Nachdem Sie die Maus auf den Mikroskoptisch gelegt haben, drücken Sie den Kragen des Brustbildfensters in ein 14-Millimeter-Aufnahmeloch im Bühneneinsatz, um die Bilder zu stabilisieren und den Isofluranschlauch zu montieren. Bringen Sie dann das Bildgebungsfeld mit dem Mikroskop Okularen und der Hellfeldbeleuchtung in den Fokus und beobachten Sie das Gefäßsystem mit Blutfluss.Überprüfen Sie die Stabilität des Sichtfelds. Wenn Atembewegungsartefakte vorhanden sind, tragen Sie eine sanfte Kompression auf die Rückseite der Drüse mit einem kleinen Schaumstoffblock und einem cinkturartigen Stück Klebeband auf. Überprüfen Sie nach der Komprimierung, ob der Blutfluss im gesamten Sichtfeld aufrechterhalten wird.Sobald die Maus sediert und sicher auf der invertierten Mikroskopstufe positioniert ist, beginnen Sie mit der Suche nach interessanten Regionen. Verwenden Sie eine Lichtquelle, die auf das Brustbildgebungsfenster gerichtet ist, und verwenden Sie das Okular des Mikroskops, um potenzielle Bereiche für die Untersuchung zu identifizieren. Der Fokus sollte darauf liegen, Gefäße und Blutfluss zu sehen.Fügen Sie die XY-Positionen in der Software hinzu und speichern Sie sie. Wenn die entsprechenden Leistungsstufen eingestellt sind, richten Sie den Z-Stack ein und beobachten Sie das Auftreten von reichlich Kollagenfasern bei 20 bis 50 Mikrometern unter der Glasoberfläche des Brustbildgebungsfensters. Kollagen wird weniger verbreitet, wenn das Mikroskop tiefer in den Tumor eindringt.Die Hohlräume in der zweiten harmonischen Generation oder SHG zeigen die Lage der Tumormassen. Stellen Sie die obere Z-Scheibe unter die Schicht der Einzelzellen, wobei die ersten Kollagenfasern bei 50 bis 100 Mikrometern erscheinen. Stellen Sie die untere Z-Scheibe auf 250 Mikrometer ein, wo die Fasern ausblenden und das schlechte Signal dominiert.Wiederholen Sie dann den Vorgang für alle gespeicherten XY-Positionen. Sobald der Z-Stack-Bereich eingestellt ist, erhöhen Sie die Verweilzeit auf acht Mikrosekunden und optimieren Sie die Leistungs- und Detektoreinstellungen. Optimieren Sie die Leistungsstufen, die zur Anregung des Gewebes für jedes Experiment erforderlich sind, und verwenden Sie Leistungen von bis zu 90 Milliwatt bei 750 Nanometern oder 70 Milliwatt bei 890 Nanometern an der hinteren Blende des Objektivs.Beginnen Sie als Nächstes mit 10-Minuten-Intervallen zwischen den Sammelpunkten für die meisten intravitalen Migrationsfilme und passen Sie die Zeitintervalle entsprechend den experimentellen Zielen an. Wenn Anzeichen von Phototoxizität wie Zellblebbing oder schnell zunehmende Autofluoreszenz und übermäßiges Photobleichen beobachtet werden, reduzieren Sie die Laserleistung oder erhöhen Sie die Zeitrafferintervalle, wenn die Bedingungen dies anzeigen. Für die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung oder FLIM von NADPH starten Sie das Vorschauscannen und passen Sie die Laserleistung an, bis das Auslesen des Diskriminators oder CFD mit konstantem Anteil zwischen 10 und dem fünften und 10 bis zum sechsten liegt.Übertreffen von CFD über 10 bis zum sechsten Ergebnis in Photonenstapelung und schlechten Gesamtergebnissen. Sobald das Leistungsniveau eingestellt ist, stellen Sie die Integrationszeit zwischen 90 und 120 Sekunden ein und starten Sie die FLIM-Sammlung, um Photonen aus dem Sichtfeld für die zugewiesene Zeit zu erfassen. Ein typisches Sichtfeld innerhalb eines markierungsfreien Brusttumors zeigte reichlich Kollagenfasern in der Nähe des Fensters und eine Abnahme der Häufigkeit tiefer in den Tumor.Die Verwendung von Fluoreszenzlebensdauer oder NADPH half bei der Identifizierung des Gefäßsystems. Einige dunkle Regionen in den Bildern waren Tumorfalten oder das Aufstoßen benachbarter Tumorlappen. Um das Gefäßsystem zu identifizieren, wurde ein zusammengesetztes Bild mit NDPH FLIM validiert, indem die Projektionen der maximalen Intensität des intravitalen Stapels vor und nach der Injektion von fluoreszierendem Dextran in die Schwanzvene verglichen wurden.Die repräsentative Analyse zeigt die Quantifizierung von vier Mäusen und den Sichtfeldern. Um die Grenzen der markierungsfreien Tumormassen abzugrenzen, wurde die NADPH-Autofluoreszenz verwendet. Die Bilder berichteten über die metabolischen Signaturen der Zellen und die Lage der Blutgefäße.Die AFD-Autofluoreszenz identifizierte auch die Makrophagen. Mit dem Segmentierungsschema wurde der markierungsfreie Tumor in Kompartimente für das Tumornest, das Stroma und die Gefäße unterteilt, wobei nur SHG- und NADPH-Autofluoreszenz verwendet wurden. Zusätzlich können die Stroma- und Kollagenfasern auch in lokale Bereiche der ausgerichteten Fasern eingeteilt werden.Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Protokoll erinnern sollten, ist sicherzustellen, dass die Maus ordnungsgemäß sediert und zurückgehalten wird, damit das Sichtfeld für die Bildgebung stabil bleibt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

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Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

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