Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Wir haben eine einfache Methode entwickelt, um eine robuste und progressive Glaukomdegeneration zu induzieren, die auf einer temporären Erhöhung des Augeninnendrucks basiert. Dies stellt eine einzigartige Gelegenheit dar, Schlüsselpunkte der Pathophysiologie des Glaukoms zu untersuchen. Dabei handelt es sich um ein leicht zu erlernendes, nicht-invasives, kostengünstiges und hochgradig reproduzierbares Modell, das eine In-vivo-Funktionsanalyse und kurzfristige Versuchspläne mit einer reduzierten Anzahl von Tieren für jedes Experiment ermöglicht.

Die Netzhaut und der Sehnerv sind bewertbare Teile des zentralen Nervensystems, so dass die Modellierung der fortschreitenden Beeinträchtigung dieser Strukturen wertvolle Einblicke in andere neurodegenerative Erkrankungen liefern kann. Um den Augeninnendruck (IOD) sowohl der experimentellen als auch der kontralateralen Kontrollaugen zu messen, wird die anästhesierte Ratte in ventraler Dekubitusposition auf die Tischplatte gelegt, so dass die Hornhautoberfläche für die Spitze des Tonometers leicht zugänglich ist. Positionieren Sie die Tonometerspitze so, dass sie die zentrale Hornhautzone senkrecht leicht berührt.

Erfassen Sie dann die Messung, indem Sie die Messtaste drücken. Als nächstes wird die Ratte in eine leichte seitliche Dekubitusposition unter ein Stereomikroskop gelegt und das Versuchsauger bei 40-facher Vergrößerung untersucht. Halten Sie während des Eingriffs das kontralaterale Kontrollauge befeuchtet, indem Sie einen Tropfen Carmellose-Natrium oder Natriumhyaluronat einträufeln.

Schieben Sie dann mit einer gebogenen Pinzette den experimentellen Augapfel vorsichtig nach vorne, um das Gefäßsystem um den 360-Grad-Limbus herum freizulegen. Dann mit der anderen Hand mit einem Augenkauter mit niedriger Temperatur die Gefäße rund um die Hornhaut vorsichtig veröden. Achten Sie darauf, die Hornhautperipherie nicht zu verätzen.

Bestätigen Sie den Erfolg des chirurgischen Eingriffs, indem Sie das Auftreten kleiner kreisförmiger Kauterisierungsspuren am Sklerallimbus, die Verödung des limbalen Gefäßsystems und die Pupillenerweiterung im operierten Auge beobachten. Überprüfen Sie nach der Operation den unmittelbaren postoperativen Augeninnendruck in beiden Augen, wie bereits gezeigt. Tragen Sie dann einen Tropfen ophthalmisches Prednisolonacetat auf die vordere Oberfläche des experimentellen Auges auf.

Ersetzen Sie es nach 40 Sekunden durch eine ophthalmische antibiotische Salbe. Wenden Sie eine tägliche klinische Nachsorge des experimentellen Auges mit topischen Medikamenten an, die aus einem nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikament und einer antibiotischen Salbe bestehen. Für die Analyse der optomotorischen Reaktion wird die Ratte zur Gewöhnung auf eine Plattform gesetzt, die mit vier Computermonitoren in einem Viereck aufgebaut ist.

Halten Sie den roten Fadenkreuz-Cursor auf dem Videobild zwischen den Augen der sich frei bewegenden Ratte, da er die Mitte des virtuellen Zylinders anzeigt. Beobachten Sie die optomotorische Reaktion, die aus einer reflexiven Verfolgung des Kopfes und Halses der Ratte besteht, die durch die rotierenden Abstufungen hervorgerufen wird. Führen Sie zunächst einen Stimulus mit niedriger Ortsfrequenz ein und erhöhen Sie dann die Frequenz schrittweise, bis die Verfolgungsbewegung nicht mehr bemerkt wird.

Um das Musterelektroretinogramm aufzuzeichnen, wird nach der Anästhesie der Ratte die aktive Elektrode vorsichtig an der temporalen Peripherie der Hornhaut eingeführt. Zusätzlich wird die Referenzelektrode in das subkutane Gewebe des ipsilateralen Schläfenkanthus und die Bodenelektrode in eine der Hintergliedmaßen eingeführt. Positionieren Sie dann die Ratte 20 Zentimeter vom Stimulusbildschirm entfernt, überwachen Sie die Signalbasislinie und starten Sie die Erfassung, indem Sie die Analysetaste am Erfassungssystem drücken.

Nachdem Sie die Netzhaut isoliert haben, übertragen Sie sie in eine 24-Well-Kulturplatte mit einem Milliliter PBS, wobei die innere Netzhaut nach oben zeigt. Permeabilisieren Sie das Gewebe durch Waschen mit einem 0,5%igen nichtionischen Tensid, das in PBS verdünnt ist. Inkubieren Sie dann das Gewebe und die Blockierungslösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln.

Während der Inkubation Brn-3a-Primärantikörperlösung herstellen und bei vier Grad Celsius lagern. Nach der Gewebeblockierung wird die Netzhaut in 200 Mikrolitern primärer Antikörperlösung bei vier Grad Celsius für 72 Stunden mit leichtem Schütteln inkubiert. Als nächstes waschen Sie das Taschentuch mit PBS.

Inkubieren Sie das Gewebe in 200 Mikrolitern der sekundären Antikörperlösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur und dann 10 Minuten lang mit nuklearer Gegenfärbungslösung für die Fluoreszenznuklei-Färbung. Nach drei PBS-Wäschen übertragen Sie die Netzhaut mit zwei kleinen Bürsten auf einen Objektträger aus Glas, wobei die Glaskörperseite nach oben gerichtet bleibt. Positionieren Sie den dorsalen Netzhautquadranten nach oben auf dem Objektträger.

Zum Schluss tragen Sie 200 Mikroliter Antifade-Eindeckmittel auf ein Deckglas auf und legen es zur mikroskopischen Analyse auf die flach aufliegende Netzhaut. Untersuchen Sie unter einem konfokalen Epifluoreszenzmikroskop mit einem 40-fachen Vergrößerungsobjektiv die flachen Halterungen, um die retinalen Ganglienzellen zu schätzen. Entfernen Sie nach der Enukleation des Augapfels das proximale Segment des intraorbitalen Teils des Sehnervs, einschließlich eines Teils des intraokularen Anteils.

Geben Sie die Proben dann sofort in Fläschchen oder Röhrchen, die 200 bis 300 Mikroliter kaltes Fixiermittel enthalten. Waschen Sie das Gewebe nach zwei Stunden mit kaltem 100 Mikromol Natriumcacodylat-Puffer. Dann fixieren Sie das Gewebe eine Stunde lang in 1%igem Osmiumtetroxid und fünf nanomolaren Kalziumchloriden bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln.

Waschen Sie die Sehnervenfragmente nach drei Wäschen mit kaltem Natriumcacodylatpuffer vor der Inkubation über Nacht mit kaltem destilliertem Wasser und 1%igem Urinalacetat bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag, nach drei Wäschen mit Wasser, dehydrieren Sie das Gewebe schrittweise in steigenden Acetonkonzentrationen. Führen Sie dann drei Runden mit Einbettungs- und Epoxidharzacetonlösungen durch, bevor Sie das Gewebe 24 Stunden lang in reines Epoxidharz einbetten.

Am nächsten Tag werden die Proben aus dem Probenträger entnommen und für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius in Einbettformen überführt. Nach der Polymerisation werden mit einem Ultramikrotom transversale halbdünne Schnitte der Sehnervenfragmente geschnitten. Sammeln Sie dann die Schnitte und übertragen Sie sie auf einen Objektträger.

Färben Sie die Schnitte mit Toluidinblau und fotografieren Sie sie mit einem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Für die Ultrastrukturanalyse werden ultradünne Querschnitte durchgeführt und auf einem Kupfergitter gesammelt. Anschließend färben Sie die Abschnitte mit Urinalacetat und Bleicitrat für die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung.

Die Vollkreiskauterisation induzierte unmittelbar nach der Operation eine Erhöhung des Augeninnendrucks im Vergleich zu Kontrollaugen. Der Peak für den postoperativen IOD wurde am ersten Tag beobachtet und sank am sechsten Tag allmählich auf die Ausgangswerte. Darüber hinaus wurde die Netzhautfunktion sowohl verhaltensbezogen als auch elektrophysiologisch mittels optomotorischem Reflex bzw. Musterelektroretinogramm bewertet.

Nach der Operation zeigten beide Parameter zwei unterschiedliche Phasen der Beeinträchtigung: die akute Phase der okulären Hypertonie am dritten Tag und eine sekundäre Degenerationsphase am 30. Tag. Im Vergleich zu Kontrollsehnerven nahmen die axonalen Zahlen und die halbdünnen transversalen Sehnervenabschnitte nach der Operation progressiv ab. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Sehnerven aus dem Kontrollauge zeigten dicht gepackte myelinisierte Fasern, die durch dünne Gliazellfortsätze getrennt sind, und deutliche axonale Mikrotubuli und Neurofilamente.

Im Gegensatz dazu wurden nach drei Tagen okulärer Hypertonie einige degenerierte Fasern, zytoplasmatische Vakuolisierung in Gliazellprozessen und kondensiertes Chromatin in Gliazellkernen beobachtet. Nach sieben Tagen kam es zu einer Zunahme degenerierter axonaler Fasern und hypertoner Gliazellfortsätze. Und nach 14 Tagen wurde eine weitere Störung der Sehnervenfasern beobachtet, die mit der Invasion von Gliazellfortsätzen zwischen den Axonen verbunden war.

Darüber hinaus nahm die Dichte der retinalen Ganglienzellen mit der Zeit vor allem in den dorsalen und temporalen retinalen Quadranten ab. Versuchen Sie bei der Durchführung dieses Eingriffs, die limbalen Gefäße vorsichtig mit einer Kauterspitze zu berühren, um die Nabelschnurperipherie zu schonen und sicherzustellen, dass kontinuierliche Kauterisierungsspuren rund um den Skleralimbus beobachtet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Vielzahl von Methoden angewendet werden, wie z. B. die funktionelle biochemische und immunhistochemische Bewertung von Augenstrukturen und andere Methoden, die die Glaukom-Physiopathologie anerkennen können.