Name: Isolierung und Screening aus der Bodenbiodiversität auf Pilze, die am Abbau widerspenstiger Materialien beteiligt sind (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und das Screening von Bodenpilzen zur Bioremediation widerständiger Materialien wie Kohlenwasserstoffe und Kunststoffe. Diese Methode identifiziert Pilzstämme mit hohem Abbau-Potenzial für Umweltsanierungen.

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Wir danken der Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) der Universität Pavia und Professor Solveig Tosi für die Bereitstellung dieser Arbeit.

1. Auswahl von Pilzstämmen, die in der Lage sind, widerspenstige Materialien aus dem Boden abzubauen
<ol><li>Herstellung von antibiotischer Lösung.<ol>
<li>Penicillin (50 mg / L), Streptomycin (40 mg / L), Chlortetracyclin (40 mg / L), Neomycin (100 mg / L) und Chloramphenicol (100 mg / L) in 250 ml deionisiertes steriles Wasser.</li>
		<li>Bevor Sie Chloramphenicol in die antibiotische Lösung geben, lösen Sie es in 3 ml ≥99% Ethanol auf.</li>
		<li>Legen Sie die antibiotische Lösung für 10 min auf einen Magnetrührer (keine Hitze) mit einem magnetischen Rührstab in die Lösung. Lagern Sie es bei 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbereitung von Wachstumsmedien.<ol>
<li>Geben Sie 1 g handelsübliche Huminsäure, 3,26 g Bushnell-Haas-Brühe (BH) und 15 g Agar in 1 l entionisiertes Wasser und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 ° C (Huminsäureagar).</li>
		<li>Den Huminsäure-Agar unter einem Laminar-Flow-Gehäuse in Petrischalen auffüllen.</li>
		<li>Geben Sie 4 g Lignocellulose, 3,26 g BH und 15 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 ° C (Lignocellulose-Agar).</li>
		<li>Den Lignocellulose-Agar unter einem Laminar-Flow-Schrank in Petrischalen auffüllen.</li>
		<li>Nachdem die Medien in den Petrischalen erstarrt sind, geben Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank 1 ml der antibiotischen Lösung mit einer sterilen Spritze mit einem 0,2-μm-Filter auf die vorbereiteten Platten, um sie zu sterilisieren.</li>
		<li>Verteilen Sie die antibiotische Lösung mit einem sterilen Einweg-L-förmigen Zellstreuer gleichmäßig auf den Plattenoberflächen und lassen Sie sie unter dem Laminar-Flow-Gehäuse an der Luft trocknen.</li>
		<li>20 g Malzextraktbrühe und 15 g Agar in 1 L entionisiertes Wasser geben und 20 min bei 121 °C (Malzextraktagar - MEA) autoklavieren.</li>
		<li>Die MEA unter einem Laminar-Flow-Schrank in Petrischalen auffüllen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bodenproben und Bodenverdünnungen.<ol>
<li>Probieren Sie den interessierenden Boden in einer Tiefe von 10 cm, entfernen Sie Pflanzen, Gras und abgestorbene Blätter aus der obersten Schicht und legen Sie ihn in sterile Polyethylenbeutel.</li>
		<li>Nachdem Sie das Labor erreicht haben, sieben Sie den Boden mit einem 2-mm-Netz und entfernen Sie alle Wurzeln und Pflanzenreste.</li>
		<li>Wenn es nicht möglich ist, sofort mit der nachgelagerten Analyse fortzufahren, lagern Sie die gesiebten Bodenproben bei 4 °C.</li>
		<li>Arbeiten Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank und geben Sie 1 g des gesiebten Bodens in ein steriles 15-ml-Rohr mit 10 ml sterilem deionisiertem Wasser (1 x 10-1 Verdünnung). Schütteln Sie das Rohr horizontal für 30 min.</li>
		<li>Nehmen Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank, bevor sich die Suspension setzt, 1 ml der 1 x 10-1-Verdünnung mit einer sterilen Pipette und geben Sie sie in einen 9 ml deionisierten Wasserrohling (1 x 10-2-Verdünnung). Wirbeln Sie es gründlich ein.</li>
		<li>Bevor sich die Suspension absetzt, nehmen Sie 1 ml der 1 x 10-2 Verdünnung mit einer sterilen Pipette und geben Sie sie in einen 9 ml deionisierten Wasserrohling (1 x 10-3 Verdünnung). Wirbeln Sie es gründlich ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Beschichtung von Bodenverdünnungen auf selektiven Medien.<ol>
<li>In einem Laminar-Flow-Schrank werden 100 μL der 1 x 10-3-Verdünnung mit einer Mikropipette mit steriler Stelle gesammelt und auf eine Humus-Agar-Petrischale übertragen. Tun Sie dies für mindestens 4 oder 5 Petrischale.</li>
		<li>Verteilen Sie die Verdünnung gleichmäßig auf der Petrischalenoberfläche mit einem sterilen Einweg-L-förmigen Zellstreuer.</li>
		<li>Lassen Sie es 10-15 min unter dem Laminar-Flow-Schrank an der Luft trocknen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1.-1.4.3. Verwendung von Lignocellulose-Petrischale.</li>
		<li>Bei 25 °C im Dunkeln maximal 15 Tage inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung von Pilzkolonien, die von selektiven Medien zu Wachstumsmedien gezüchtet werden.<ol>
<li>Ab 3 Tagen nach der Zubereitung überprüfen Sie die vorbereiteten selektiven Medien-Petrischalen täglich für maximal 15 Tage auf das Wachstum von Pilzkolonien.</li>
		<li>Überprüfen Sie alle vorhandenen Pilzkolonien auf Ähnlichkeiten. Bereiten Sie bei Bedarf einen Objektträger vor, der unter einem Lichtmikroskop beobachtet werden soll. HINWEIS: Das Ziel ist es, die höchste Anzahl von Pilzkolonien zu isolieren, aber es ist notwendig, zu vermeiden, dass immer derselbe Pilzstamm von verschiedenen Platten isoliert wird, daher ist diese Überprüfung sehr wichtig. Suchen Sie nach Kolonien mit unterschiedlicher Makro- und Mikromorphologie.</li>
		<li>Isolieren Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank oder an einem Bunsenbrenner jeden ausgewählten Pilzstamm, indem Sie vorsichtig einen kleinen Teil des Myzels mit einer sterilen Impfnadel aus der Kolonie entfernen und in eine neue MEA-Petrischale überführen. HINWEIS: In dieser Phase ist es sehr wichtig, empfindlich und präzise zu sein, da ein hohes Risiko einer Kontamination durch die anderen Pilzkolonien besteht, die in der ursprünglichen Petrischale vorhanden sind. Wenn mehr als ein Pilzstamm auf der geimpften MEA-Platte wächst, wiederholen Sie Schritt 1.5.3.</li>
		<li>7 Tage bei 25 °C im Dunkeln inkubieren. Dies sind die Pilzstämme, die weiter auf bestimmte widerspenstige Substanzen getestet werden sollen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Wachstumstests an widerspenstigen Stoffen
<ol><li>Wachstumstest auf Petrolatum.<ol>
<li>20 ml flüssiges BH (3,26 g/L BH) in 50 ml Fläschchen geben und durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min sterilisieren.</li>
		<li>Geben Sie 7 ml deionisiertes Wasser in 15 ml Glasfläschchen und fügen Sie einige Stücke zerbrochener Glasabdeckungen in jede Durchstechflasche hinzu.</li>
		<li>Sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min.</li>
		<li>Unter dem Laminar-Flow-Kabinett 1 ml Vaseline mit einer sterilen Pipette in jede 50 ml BH-Durchstechflasche geben. Bewahren Sie einige Fläschchen mit nur BH als Negativkontrolle auf.</li>
		<li>Unter dem Laminar-Flow-Gehäuse wird das Myzel auf der Oberfläche des Mediums mit den ausgewählten Pilzstämmen (vorbereitet in Schritt 1.5.3.) mit einer sterilen Nadel von den MEA-Platten entfernt und mit den zerbrochenen Deckgläsern auf 15 ml Glasfläschchen übertragen.</li>
		<li>Agitieren Sie jedes Fläschchen auf einem Wirbelmischer für 2 min, so dass die gebrochenen Deckgläser den Würfel der Pilzkolonie schneiden können, wodurch eine Pilzsuspension entsteht.</li>
		<li>Beimpfen Sie jede Petrolatum-Durchstechflasche mit 200 μL Pilzspension. Machen Sie zwei Replikate für jeden Pilzstamm.</li>
		<li>Für die Negativkontrolle geben Sie 200 μL Pilzsuspension in Durchstechflaschen mit nur flüssigem BH. Bewahren Sie außerdem ein paar Fläschchen mit Petrolatum ohne Pilzimpfung auf, um nach einer Kontamination im Medium zu suchen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Fläschchen bei 25 °C im Dunkeln und überprüfen Sie sie nach 15 Tagen und 30 Tagen nach dem Impfstoff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachstumstest an gebrauchtem Motoröl.<ol>
<li>Geben Sie 3,26 g BH und 15 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 °C (BHA).</li>
		<li>Die BHA unter einem Laminar-Flow-Schrank in Petrischalen auffüllen.</li>
		<li>Wenn es erstarrt ist, übertragen Sie 500 μL gebrauchtes Motoröl auf die BHA Petrischalen und verteilen Sie es gleichmäßig auf den Plattenoberflächen mit einem sterilen Einweg-L-förmigen Zellstreuer.</li>
		<li>Jede verbrauchte Maschinenöl-BHA-Platte wird mit jedem Pilzstamm beimpft und das Myzel aus den in Schritt 1.5.3 hergestellten Platten gesammelt. Arbeiten Sie an einem Bunsenbrenner oder unter einer Laminar-Flow-Haube, um eine Kontamination zu vermeiden. Machen Sie zwei Replikate für jeden Pilzstamm.</li>
		<li>Für die Negativkontrolle impfen Sie die Petrischalen nur mit BHA. Bewahren Sie außerdem ein paar gebrauchte Motoröl-BHA-Petrischalen ohne Pilzimpfung auf, um nach Verunreinigungen im Medium zu suchen.</li>
		<li>Die Petrischalen bei 25 °C im Dunkeln ausbrüten und nach 15 Tagen und 30 Tagen ab dem Impfstoff überprüfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachstumstest an Kunststoffen.<ol>
<li>200 μL Pilzsuspension (Schritte 2.1.5.-2.1.6.) in eine 96-Mikrowellenplatte übertragen. Machen Sie drei Repliken der Pilzstamm-Kunststoff-Kombination.</li>
		<li>Zu jeder Vertiefung mit der Pilzsuspension fügen Sie 10 mg einer anderen Art von Kunststoffpulver hinzu (Polyethylenterephthalat - PET, Polyvinylchlorid - PVC, Polyethylen hoher Dichte - HDPE, Polystyrol - PS, Polyurethan - PUR).</li>
		<li>Für die Negativkontrolle, anstatt das Kunststoffpulver hinzuzufügen, fügen Sie 200 μL sterilisierte BH-Lösung in die Vertiefung mit der Pilzsuspension hinzu. Darüber hinaus füllen Sie für jede Art von Kunststoffpulver eine Vertiefung mit 200 μL sterilisierter BH-Lösung und 10 mg jedes Kunststoffstaubs, um auf Verunreinigungen des Mediums zu prüfen.</li>
		<li>Die Mikrotiterplatten bei 25 °C im Dunkeln inkubieren und nach 15 Tagen und 30 Tagen ab dem Inokulum überprüfen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Qualitative enzymatische Tests
<ol><li>Qualitativer ligninolytischer Enzym kolorimetrischer Test.<ol>
<li>27 g Kartoffeldextrosebrühe (PD) und 15 g Agar in 1 L entionisiertes Wasser geben und 20 min bei 121 °C (PDA) autoklavieren.</li>
		<li>Wenn das Medium etwas abgekühlt ist, aber immer noch flüssig ist, fügen Sie Gallussäure (5 g / L) unter einer laminaren Flow-Haube hinzu und füllen Sie das Medium in Petrischalen auf.</li>
		<li>Die PDA + Gallussäureplatten werden mit jedem Pilzstamm beimpft und das Myzel aus den in Schritt 1.5.3 hergestellten Platten gesammelt. Arbeiten Sie an einem Bunsenbrenner oder unter einer Laminar-Flow-Haube, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
		<li>Als Negativkontrollen Petrischalen nur mit PDA (keine Gallussäure) zubereiten und mit den Pilzstämmen (eine für jeden Pilzstamm) sowie einer Petrischale mit PDA + Gallussäure und ohne Pilzimpfung impfen.</li>
		<li>Brüten Sie die Petrischalen bei 25 °C im Dunkeln aus und überprüfen Sie sie nach 7 Tagen ab dem Impfstoff.</li>
	</ol></li>
	<li>Qualitativer kolorimetrischer Laccase-Test.<ol>
<li>Geben Sie 27 g PD und 15 g Agar in 1 L entionisiertes Wasser und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 °C (PDA).</li>
		<li>Wenn das Medium etwas abgekühlt ist, aber immer noch flüssig ist, Guaiacol (400 μL/L) unter eine laminare Haube geben und in Petrischalen geben.</li>
		<li>Die PDA + Guaiacolplatten werden mit jedem Pilzstamm beimpft und das Myzel aus den in Schritt 1.5.3 hergestellten Platten gesammelt. Arbeiten Sie an einem Bunsenbrenner oder unter einer Laminar-Flow-Haube, um Verunreinigungen zu vermeiden.</li>
		<li>Als Negativkontrollen Petrischalen nur mit PDA (kein Guaiacol) zubereiten und mit den Pilzstämmen (einer für jeden Pilzstamm) sowie einer Petrischale mit PDA + Guaiacol und ohne Pilzimpfung impfen.</li>
		<li>Brüten Sie die Petrischalen bei 25 °C im Dunkeln aus und überprüfen Sie sie nach 7 Tagen ab dem Impfstoff.</li>
	</ol></li>
	<li>Qualitativer Proteasentest.<ol>
<li>Das YES-Medium wird durch Zugabe von K2 HPO 4 (1 g/L),KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO 4·7H2O(0,5 g/L), MnCl 2·4H 2 O (0,001 g/L), CuCl 2·2H2 O(1,4 x 10-5 g/L), ZnCl 2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl 2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) und Gelatine/Pepton (0,02 g/L) zu entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Legen Sie das JA-Medium für 10 min auf einen Magnetrührer (keine Hitze) mit einem magnetischen Rührstab im Medium.</li>
		<li>Wenn sich alle Salze in das Medium aufgelöst haben, geben Sie 5 ml der Lösung in 20 ml sterile Glasdurchstechflaschen und autoklavieren Sie sie für 20 min bei 121 ° C.</li>
		<li>Für die Negativkontrolle bereiten Sie etwa 20 ml sterile Glasfläschchen mit 5 ml BH-Lösung vor und autoklavieren Sie sie für 20 min bei 121 °C.</li>
		<li>Übertragen Sie in einem Laminar-Flow-Kabinett 200 μL Pilzsuspension (Schritte 2.1.5.-2.1.6.) für jeden Stamm auf die YES medium sterilisierten Durchstechflaschen (mindestens 2 Replikate pro Pilzstamm). Fügen Sie für jeden Pilzstamm 200 μL derselben Pilzsuspension zu BH-sterilisierten Fläschchen hinzu, um eine Negativkontrolle zu erhalten.</li>
		<li>Die Fläschchen 21 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrüten und alle 7 Tage kontrollieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Qualitativer Esterase-Test.<ol>
<li>Bereiten Sie das Tween 80-Medium vor, indem Sie Pepton (10 g / L), NaCl (5 g / L), CaCl2 (0,1 g / L) und 10 ml Tween 80 bis 1 L deionisiertes Wasser hinzufügen.</li>
		<li>Legen Sie das Tween 80 Medium für 10 min auf einen Magnetrührer (keine Hitze) mit einem Magnetrührstab im Medium.</li>
		<li>Wenn alles im Medium geschmolzen ist, übertragen Sie 5 ml der Lösung in 20 ml sterile Glasfläschchen und autoklavieren Sie sie für 20 min bei 121 ° C.</li>
		<li>Für die Negativkontrolle bereiten Sie etwa 20 ml sterile Glasfläschchen mit 5 ml BH-Lösung vor und autoklavieren Sie sie für 20 min bei 121 °C.</li>
		<li>Übertragen Sie in einem Laminar-Flow-Schrank 200 μL Pilzsuspension (Schritte 2.1.5.-2.1.6.) für jeden Stamm auf die Tween 80 mittelsterilisierten Durchstechflaschen (mindestens 2 Wiederholungen pro Pilzstamm). Fügen Sie für jeden Pilzstamm 200 μL derselben Pilzsuspension zu BH-sterilisierten Durchstechflaschen zur Negativkontrolle hinzu.</li>
		<li>Die Fläschchen 21 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrüten und alle 7 Tage kontrollieren.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die reiche Artenvielfalt des Bodens ist eine reichhaltige Quelle von Pilzen, die zahlreiche metabolische Fähigkeiten besitzen, von denen einige potenzielle Kandidaten für die Bioremediation sein könnten. Selektive Medientests (Abschnitt 1 des Protokolls) sind einfach durchzuführende und wirksame Methoden zur Isolierung von Pilzen, die auf natürlichen komplexen Polymeren als einzige Kohlenstoffquelle wachsen können. Pilze können extrazelluläre, unspezifische Hydrolasen und Oxidoreduktasen30 wie die...

Der Boden ist ein grundlegender Bestandteil des Lebens auf der Erde und die Grundlage vieler Ökosysteme. Die Mineralien, organischen Stoffe und Mikroorganismen im Boden können als ein System betrachtet werden, wobei enge Assoziationen und Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Die Wechselwirkungen dieser Verbindungen haben einen wichtigen Einfluss auf terrestrische Prozesse, die Umweltqualität und die Gesundheit des Ökosystems1. Die Bodenverschmutzung stellt weltweit ernste Umweltprobleme dar. Die wahllose, langfristige und übermäßige Anwendung von widerspenstigen und toxischen Substanzen wie Pestiziden, Erdölprodukten, Kunststoffen und anderen Chemikalien hat schwerwiegende Auswirkungen auf die Bodenökologie und kann infolgedessen die Mikrobiota des Bodens verändern. Mikrobielle Gemeinschaften in Böden bestehen aus einer Vielzahl von Organismen in verschiedenen physiologischen Zuständen, wobei die Mehrheit Bakterien und Pilze sind. Viele der Schadstoffe in Böden haben eine mittel- bis langfristige Stabilität, und ihre Persistenz kann zur Entwicklung adaptiver Mechanismen führen, die es den Mikroorganismen ermöglichen, widerspenstige Substanzen als Nährstoffe zu verwenden 2,3. Diese Mikroorganismen können daher für Bioremediationstechniken in Betracht gezogen werden.
Bioremediation versucht, die Auswirkungen der Umweltverschmutzung zu mildern, indem Mikroorganismen und ihre Enzyme für den Abbau oder die Umwandlung von Abfällen in weniger toxische oder ungiftige Verbindungen verwendet werden. Verschiedene Arten von Archaeen, Bakterien, Algen und Pilzen besitzen diese Bioremediationsfähigkeit4. Aufgrund ihrer besonderen biologisch abbaubaren Wirkung sind Pilze besonders vielversprechende Organismen für die Bioremediation. Sie können verschiedene Substrate mit ihrem Hyphennetzwerk angreifen, wodurch sie effizienter in die Bodenmatrix eindringen können als andere Mikroorganismen. Darüber hinaus können sie unzugängliche Zwischenräume erreichen, an denen Verunreinigungen schwer zu entfernen sind5, und sie können auch niedrige Feuchtigkeitswerteüberleben 6. Darüber hinaus synthetisieren Pilze verschiedene Kassetten unspezifischer Enzyme, in der Regel, um natürliche widerspenstige Substanzen wie Cellulose, Lignin und Huminsäuren abzubauen. Diejenigen, denen das Zielsubstrat fehlt, können am Abbau einer Vielzahl von widerspenstigen Schadstoffen wie Kohlenwasserstoffen, Kunststoffen und Pestiziden beteiligt sein 7,8,9,10. Obwohl bereits viele Pilzarten als Bioremediationsmittel gemeldet wurden, steigt das Interesse an der Erforschung von Arten, die noch nicht untersucht wurden, um Kandidaten für die Bioremediation von widerspenstigen kontaminierenden Substanzen auszuwählen. Die Arten, von denen bereits bekannt ist, dass sie Bioremediationseigenschaften haben, gehören zu den Stämmen Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 und Mucoromycota. Zum Beispiel sind die Gattungen Penicillium und Aspergillus bekanntermaßen am Abbau von aliphatischen Kohlenwasserstoffen 13, verschiedenen Kunststoffpolymeren16,17,18, Schwermetallen 19 und Farbstoffen20 beteiligt. In ähnlicher Weise haben Studien, die an Basidiomycetes-Pilzen wie Phanerochaete Chrysosporium und Trametes versicolor durchgeführt wurden, ihre Beteiligung an der Oxidation von widerspenstigen Materialien wie aromatischen Kohlenwasserstoffen13 und Kunststoffen21 gezeigt. Ein weiteres Beispiel für Pilze, die an den biologischen Abbauprozessen beteiligt sind, sind die Zygomyceten Rhizopus spp., Mucor spp. und Cunninghamella spp.22,23. Insbesondere Cunninghamella ist in der Lage, aromatische Kohlenwasserstoffe zu oxidieren und gilt als Modellorganismus für die Untersuchung der Entgiftung von Produkten aus einer breiten Palette von Xenobiotika13.
Es gibt mehrere Pilzenzyme, die an den wichtigsten Abbauprozessen von widerspenstigen Materialienbeteiligt sind 24,25, wie Esterase, Laccase, Peroxidase und Protease. Laccasen sind kupferhaltige Oxidasen, die in der Zelle produziert und anschließend sezerniert werden, die die Oxidation einer Vielzahl von phenolischen und aromatischen Verbindungen ermöglichen. Sie können Ortho- und Paradiphenole, die aminogruppenhaltigen Phenole, Lignin und die Arylgruppen-haltigen Diamine26 abbauen. Peroxidasen verwenden Wasserstoffperoxid als Mediator, um Lignin und andere aromatische Verbindungen abzubauen. Es gibt viele verschiedene Peroxidasen, aber diejenigen mit dem größten Potenzial, toxische Substanzen abzubauen, sind Ligninperoxidase und Manganperoxidase27.
Esterasen und Proteasen gehören zur Gruppe der extra- oder ektozellulären Enzyme, die außerhalb ihrer Ursprungszellen wirken, aber dennoch an sie gebunden sind. Diese Enzyme können die Hydrolyse großer widerspenstiger Moleküle in kleinere katalysieren. Aufgrund ihrer geringen Substratspezifität können diese Enzyme eine Schlüsselrolle bei der Bioremediation verschiedener Schadstoffe wie Textilfarbstoffe, Abwässer aus der Zellstoff- und Papierindustrie und Ledergerbung, Erdölprodukte, Kunststoffe und Pestizidespielen 28,29,30.
Eine Reihe von Screening-Methoden zur Auswahl für bioremediative Pilzstämme wurde bereits veröffentlicht. Zum Beispiel wurde Agarmedium auf Strohbasis verwendet, um nach Weißfäulepilzen mit hohem Potenzial im Abbau polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) zu suchen31; und kleine Stücke von verrottendem Holz wurden auf Malzextraktagar (MEA) gelegt, um holzverrottende Pilze32 zu isolieren. Die meisten der bereits vorgeschlagenen Methoden wählen jedoch sehr spezifische Pilze für ihre interessierende Aktivität aus. Diese Forschung schlägt einen breiteren Ansatz für die Auswahl von Bodenpilzen mit einem breiteren Wirkungsspektrum vor. Die Methode beruht auf der anfänglichen Beschichtung von seriellen Verdünnungen von Bodenproben auf ein Medium, das mit Huminsäuren oder Lignocellulose, gemischt mit Antibiotika, modifiziert ist, um Pilze auszuwählen, die diese natürlichen widerspenstigen Substanzen abbauen können. Huminsäuren und Lignocellulose sind in der Tat Substanzen, die extrem resistent gegen biologischen Abbau sind, da sie sehr komplexe molekulare Strukturen haben, und dies ermöglicht es ihnen, ausgezeichnete Indikatoren für die Abbaufähigkeit der getesteten Pilzezu sein 33,34. Anschließend werden die in den ersten Tests ausgewählten Pilze untersucht, um diejenigen zu identifizieren, die das Potenzial haben, bestimmte Schadstoffe wie Petrolatum, gebrauchtes Motoröl und Kunststoffe abzubauen. Schließlich werden qualitative enzymatische Tests durchgeführt, um Pilzstämme nachzuweisen, die in der Lage sind, Enzyme zu produzieren, die an den biologischen Abbauprozessen widerspenstiger Substanzen beteiligt sind. Zu diesem Zweck werden Protease- und Esterasetests durchgeführt, während Gallussäure und Guajakol als Indikatoren für die Produktion von Laccase- und anderen ligninolytischen Enzymenverwendet werden 35,36. Diese Substrate werden verwendet, weil eine starke Korrelation zwischen der Fähigkeit von Pilzen, sie zu ihrer braunen Form zu oxidieren, und dem Besitz der ligninolytischen Fähigkeit37,38,39 gefunden wurde.
Durch diese Protokolle ist es möglich, Pilzstämme mit hohem Abbaupotenzial und einem breiten Wirkungsspektrum direkt aus Bodenproben zu isolieren. Die Isolierung dieser Pilzstämme könnte dazu beitragen, neue Kandidaten für die Bioremediation zu finden.

<table><tbody><tr><td>96 Mikrotiterplatte</td><td>Greiner bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>84609.05</td><td></td></tr><tr><td>Bushnell-Haas Bouillon</td><td>Fluka</td><td>B5051</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Eurobio</td><td>GABCRL006Z</td><td></td></tr><tr><td>Chlortetracyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Y0001451</tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3279</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0,2 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>Gallussäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Biosigma</td><td>VBS634</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen 15 mL</td><td>SciLabware</td><td>P35467</td><td></td></tr><tr><td>Guajakol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen hoher Dichte (HDPE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434272</td><td></td></tr><tr><td>Huminsäuren</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>53680</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lignocellulose</td> <td>//</td><td></td> <td>Sterilisierte Bioethanol-Produktionsabfälle</td></tr><tr><td>L-förmiger Zellstreuer</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21133</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>A.C.E.F</td><td>8235</td><td></td></tr><tr><td>Malzextrakt Bouillon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette 1000 &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0401000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1504489</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenterephthalat (PET)</td><td>Goodfellow</td><td>ES306031</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum (Paraffinflüssigkeit)</td><td>A.C.E.F</td><td></td><td></td></tr> 009661 <tr><td>Kartoffel-Dextrose-Brühe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6685</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331651</td><td></td></tr><tr><td>Polyurethan (PUR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF20677923</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylchlorid ( PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81388</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Falkenröhrchen</td><td>Greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Glasfläschchen 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860051</td><td></td></tr><tr><td>Sterilpunkt 1000&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172511</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Punkt 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172311</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Polyethylenbeutel</td><td>WHIRL-PAK</td><td>B01018</td><td></td></tr><tr><td>sterile Spritze</td><td>Rays</td><td>5523CM25</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-6501</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Gebrauchtes Motoröl</td> <td>/</td><td></td> <td>/komplexe Mischung aus Kohlenwasserstoffen, Motoradditiven und Metallen, bereitgestellt von einem italienischen Privatunternehmen</td></tr><tr><td>Fläschchen 50 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33108-U</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und screening aus der bodenbiodiversität auf pilze, die am abbau widerspenstiger materialien beteiligt sind

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

Umweltverschmutzung ist ein zunehmendes Problem, und die Identifizierung von Pilzen, die am Bioremediationsprozess beteiligt sind, ist eine wesentliche Aufgabe. Der Boden beherbergt eine unglaubliche Vielfalt an mikrobiellem Leben und kann eine gute Quelle für diese bioremediativen Pilze sein. Diese Arbeit zielt darauf ab, nach Bodenpilzen mit Bioremediationspotenzial zu suchen, indem verschiedene Screening-Tests verwendet werden. Als Wachstumstests wurden mineralische Kulturmedien verwendet, die mit widerspenstigen Substanzen als einzige Kohlenstoffquelle ergänzt wurden. Zunächst wurden Bodenverdünnungen auf Petrischalen mit mineralischem Medium plattiert, das mit Huminsäuren oder Lignocellulose versetzt war. Die wachsenden Pilzkolonien wurden isoliert und auf verschiedenen Substraten getestet, wie komplexen Mischungen von Kohlenwasserstoffen (Petrolatum und gebrauchtes Motorenöl) und Pulvern verschiedener Kunststoffpolymere (PET, PP, PS, PUR, PVC). Qualitative enzymatische Tests wurden mit den Wachstumstests verbunden, um die Produktion von Esterasen, Laccases, Peroxidasen und Proteasen zu untersuchen. Diese Enzyme sind an den Hauptabbauprozessen von widerspenstigem Material beteiligt, und ihre konstitutive Sekretion durch die untersuchten Pilzstämme könnte das Potenzial haben, für die Bioremediation genutzt zu werden. Mehr als 100 Stämme wurden isoliert und getestet, und es wurden mehrere Isolate mit gutem Bioremediationspotenzial gefunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebenen Screening-Tests eine einfache und kostengünstige Methode sind, um Pilzstämme mit Bioremediationspotenzial aus dem Boden zu identifizieren. Darüber hinaus ist es möglich, die Screening-Tests für verschiedene Schadstoffe je nach Bedarf anzupassen, indem anderen widerspenstigen Substanzen Minimalkulturmedien zugesetzt werden.

Die selektiven Medienmethoden (Abschnitt 1 des Protokolls) ermöglichten es, die reiche Biodiversität des Bodens zu untersuchen und die Pilze mit hohem Bioremediationspotenzial auszuwählen. Mit den Huminsäure- und Lignocellulosemedien wurden mehr als 100 Pilzstämme isoliert. Diese Pilze produzierten Enzyme, die am biologischen Abbau von natürlichen widerspenstigen Materialien beteiligt sind, die eine chemische Struktur haben, die vielen Schadstoffen ähnelt. Die mit den selektiven Medien isolierten Pilzstämme mussten jedoc...

Hier stellen wir ein Protokoll für das Screening der Bodenbiodiversität vor, um nach Pilzstämmen zu suchen, die am Abbau von widerspenstigen Materialien beteiligt sind. Zuerst werden Pilzstämme, die auf Huminsäuren oder Lignocellulose wachsen können, isoliert. Ihre Aktivität wird dann sowohl in enzymatischen Assays als auch an Schadstoffen wie Kohlenwasserstoffen und Kunststoffen getestet.

Isolierung und Screening aus der Bodenbiodiversität auf Pilze, die am Abbau widerspenstiger Materialien beteiligt sind

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es Pilzstämme mit hohem Abbaupotenzial direkt aus Bodenproben isoliert, um als Kandidaten für Bioremediationszwecke in Betracht gezogen zu werden. Dieses Protokoll ist ein kostengünstiges Screening, um Pilze mit Bioremediationspotenzial zu finden. Darüber hinaus liefert es Ergebnisse, die leicht zu interpretieren sind.Da diese Technik den Umgang mit Mikroorganismen beinhaltet, ist es sehr wichtig, in der Sterilität mit einem Laminar-Flow-Schrank oder einem Bunsenbrenner zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Probieren Sie zunächst den Boden von Interesse ab und sieben Sie den Boden mit einem Zwei-Millimeter-Netz, um Wurzeln und Pflanzenreste zu entfernen. Unter einem Laminar-Flow-Schrank ein Gramm der gesiebten Erde in ein steriles 15-Milliliter-Rohr geben.Fügen Sie dann 10 Milliliter steriles entionisiertes Wasser hinzu, um eine Verdünnung von 10 bis minus eins zu erhalten. Schütteln Sie das Röhrchen horizontal für 30 Minuten. Bevor sich die Suspension beruhigt, nehmen Sie einen Milliliter von 10 bis minus eins Verdünnung mit einer sterilen Pipette und übertragen Sie ihn auf einen Neun-Milliliter deionisierten Wasserrohling, um 10 bis minus zwei Verdünnung zu machen.Wirbeln Sie die Aufhängung gründlich aus. In ähnlicher Weise machen Sie eine 10 bis minus drei Verdünnung von einem 10 zum minus zwei Verdünnungsrohr. Um Bodenverdünnungen auf selektiven Medien zu plattieren, sammeln Sie 100 Mikroliter der 10 bis minus drei Verdünnung mit einer Mikropipette mit steriler Stelle und geben Sie sie auf eine Humin-Agar-Petrischale.Verteilen Sie die Verdünnung gleichmäßig auf der Schalenoberfläche mit einem sterilen, Einweg-L-förmigen Zellstreuer. Bereiten Sie vier bis fünf solcher Gerichte zu. Bereiten Sie in ähnlicher Weise Lignocellulosegerichte aus einem 10- bis zum minus drei-Verdünnungsröhrchen zu.Lassen Sie das Geschirr 10 bis 15 Minuten an der Luft trocknen, bevor Sie 15 Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Überprüfen Sie alle vorhandenen Pilzkolonien auf Ähnlichkeiten. Bereiten Sie bei Bedarf einen Objektträger vor, der unter einem Lichtmikroskop beobachtet werden soll.Isolieren Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank oder an einem Bunsenbrenner jeden ausgewählten Pilzstamm, indem Sie vorsichtig einen kleinen Teil des Myzels mit einer sterilen Impfnadel aus der Kolonie entfernen. Übertragen Sie die isolierte Kolonie in eine neue Malzextrakt-Agar- oder MEA-Schale. Übertragen Sie 20 Milliliter Bushnell Haas oder BH Medium in 50-Milliliter-Glasfläschchen.Geben Sie sieben Milliliter deionisiertes Wasser in 15-Milliliter-Fläschchen und fügen Sie Stücke von Glasscherben in jede Durchstechflasche ein. Sterilisieren Sie die Fläschchen durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten. Um das Wachstum auf Petrolatum zu testen, fügen Sie jedem 50-Milliliter-BH-Fläschchen mit einer sterilen Pipette unter dem Laminar-Flow-Kabinett einen Milliliter Vaseline hinzu.Bewahren Sie einige Fläschchen mit nur BH als Negativkontrolle auf. Entfernen Sie das Myzel auf der Oberfläche des Mediums mit dem gewählten Pilzstamm mit einer sterilen Nadel von der MEA-Platte und geben Sie es mit den zerbrochenen Deckblättern in ein 15-Milliliter-Glasfläschchen. Agitieren Sie die Durchstechflasche zwei Minuten lang auf einem Wirbelmischer, so dass die gebrochenen Deckblätter den Würfel der Pilzkolonie schneiden und eine Suspension erzeugen.Beimpfen Sie jede Petrolatum-Durchstechflasche mit 200 Mikroliter Suspension. Machen Sie zwei Replikate für jeden Pilzstamm. Für die Negativkontrolle fügen Sie 200 Mikroliter Pilzsuspension in die Durchstechflasche hinzu, die nur BH-Medium enthält.Bewahren Sie die Durchstechflasche auch mit Petrolatum ohne Pilzimpfung auf, um nach einer Kontamination im Medium zu suchen. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 25 Grad Celsius im Dunkeln und beobachten Sie sie nach 15 und 30 Tagen ab dem Inokulum. Um das Wachstum an gebrauchtem Motoröl zu testen, geben Sie 500 Mikroliter gebrauchtes Motoröl auf die BHA-Petrischale und verteilen Sie das Öl gleichmäßig.Dann impfen Sie die Platte mit Pilzstamm, indem Sie das Myzel von MEA-Platten sammeln. Um das Wachstum auf Kunststoffen zu testen, übertragen Sie 200 Mikroliter Pilzsuspension in eine 96-Mikrowellenplatte. Machen Sie drei Repliken der Pilzstamm-Kunststoff-Kombination.Fügen Sie 10 Milligramm eines anderen Kunststoffpulvers zu jeder Vertiefung mit der Pilzsuspension hinzu. Für die Negativkontrolle fügen Sie 200 Mikroliter BH-Medium in die Vertiefung mit der Pilzsuspension hinzu. Darüber hinaus füllen Sie für jedes Kunststoffpulver eine Vertiefung mit 200 Mikrolitern BH-Lösung und 10 Milligramm jedes Kunststoffstaubs, um nach Verunreinigungen zu suchen.Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln und beobachten Sie sie nach 15 und 30 Tagen. Für den qualitativen kalorimetrischen Laccase-Test bereiten Sie einen Liter Kartoffeldextrose-Agar oder PDA vor und autoklavieren Sie für 20 Minuten. Nach dem Autoklavieren, wenn das Medium abgekühlt ist, aber noch flüssig ist, fügen Sie 400 Mikroliter Guaiacol unter eine laminare Haube und schichten Sie es in Petrischalen auf.Beimpfen Sie die PDA-Guaiacolplatte mit Pilzstamm, indem Sie das Myzel von der MEA-Platte sammeln. Für Negativkontrollen bereiten Sie PDA-Platten mit jedem Pilzstamm und eine Platte mit PDA und Guaiacol vor. Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln und beobachten Sie sie nach sieben Tagen.Für den qualitativen Esterase-Test bereiten Sie einen Liter Tween 80 Medium vor. Legen Sie dann das Medium auf einen Magnetrührer ohne Erwärmung mit einem Rührstab im Inneren des Mediums. Nach 10 Minuten, wenn alles geschmolzen ist, geben Sie fünf Milliliter des Mediums in 20-Milliliter sterile Fläschchen und Autoklaven.Fügen Sie 200 Mikroliter Pilzsuspension zu der Tween 80 medium sterilisierten Durchstechflasche hinzu. Für die Negativkontrolle fügen Sie fünf Milliliter autoklaviertes BH-Medium in eine 20-Milliliter-Durchstechflasche hinzu. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Pilzsuspension in die Durchstechflasche ein.Inkubieren Sie die Fläschchen bei 25 Grad Celsius im Dunkeln für 21 Tage und beobachten Sie sie alle sieben Tage. Der Prozentsatz der Pilzstämme, die auf Petrolatum, gebrauchtem Motoröl und Kunststoffpulvern als einzige Kohlenstoffquelle mit unterschiedlichem Erfolg wachsen können, wurde bewertet. Die Fähigkeit von Pilzen, Petrolatum zu nutzen, wurde als Unterschied im Koloniewachstum zwischen kontrolliertem BH und enthaltendem Petrolatum bewertet.Fast 75% der getesteten Stämme waren in der Lage, Petrolatum als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, und 21% zeigten ein maximales Wachstum. Das Wachstum für Platten, die nur BHA und in Gegenwart von Motoröl enthielten, wurde ebenfalls überwacht. Fast 90% der Sorten wuchsen mit gebrauchtem Motoröl, wobei 39% ein maximales Wachstum zeigten.Die Bildung eines rot-bräunlichen Halos um die Pilzkolonie deutete auf eine höhere Produktion von Laccasen und anderen ligninolytischen Enzymen hin. Etwa 60% der Pilze waren in der Lage, Laccases zu produzieren. Darüber hinaus erzeugten 17% der Stämme einen intensiven dunklen Heiligenschein um die Kolonie im Guaiacol-Medium.Die Esterases-Aktivität wurde durch die Bildung eines weißen Niederschlags in Tween 80 Medium bewertet. Fast 60% der Stämme zeigten eine Esteraseaktivität und 13% zeigten eine höhere Niederschlagsbildung. Dieses Protokoll kann so angepasst werden, dass es nach Pilzen sucht, die in der Lage sind, Schadstoffe abzubauen, indem die widerspenstige Substanz von Interesse zu einem minimalen Kulturmedium hinzugefügt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Villela, H. D. M. et al. Prospektion mikrobieller Stämme für Bioremediation und Probiotikaentwicklung für die Forschung und Erhaltung von Metaorganismen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video demonstriert die Isolierung schadstoffabbauender Meeresbakterien durch serielle Verdünnung, Kolonieauswahl und Wachstum in einem EE2-haltigen Medium. Indem EE2 als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird, identifiziert das Protokoll Bakterienstämme, die in der Lage sind, diesen Umweltschadstoff zu...

Screening mariner Bakterien zur Isolierung schadstoffabbauender Stämme

Kunststoff-Folien mit der Bezeichnung "biologisch abbaubar" sind im Handel erhältlich für die landwirtschaftliche Nutzung als Mulch. Bodenbearbeitung stellt eine attraktive Methode zur Verfügung, aber Abbau unter Feldbedingungen ist wenig bekannt. Der Zweck dieser Studie war es, Methoden zur Isolierung von Mutterboden Pilze und Bakterien, die Plastik Mulchfolien nach Feld Bestattung kolonisieren zu entwickeln.

Isolation der Native Soil Mikroorganismen mit Potenzial für den Abbau von biologisch abbaubaren Kunststoff Mulch Films in der Landwirtschaft eingesetzt

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.

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Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.

Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur

Die Isolierung von schwermetallbeständigen Mikroben aus geothermischen Quellen ist ein heißes Thema für die Entwicklung von Bioremediations- und Umweltüberwachungsbiosystemen. Diese Studie bietet einen methodischen Ansatz zur Isolierung und Identifizierung von schwermetalltoleranten Bakterien aus heißen Quellen.

Bioprospektion extremophiler Mikroorganismen zur Bekämpfung der Umweltverschmutzung

Der vorliegende Artikel zielt darauf ab, detaillierte und adäquate Protokolle für die Isolierung pflanzenassoziierter endophytischer Pilze, die Langzeitkonservierung von Isolaten, die morphologische Charakterisierung und die Gesamt-DNA-Extraktion für die anschließende molekulare Identifizierung und metagenomische Analyse bereitzustellen.

Isolierung, Charakterisierung und Gesamt-DNA-Extraktion zur Identifizierung endophytischer Pilze in mykoheterotrophen Pflanzen

Dieses Protokoll beschreibt das Design und die Verwendung eines Isolationschips (iChip) für die In-situ-Kultivierung von widerspenstigen Bodenmikroben in ihrer natürlichen Umgebung. Sie beschreibt auch die in situ Kultivierung von antimikrobiell produzierenden Bodenbakterien. Das Protokoll kann angepasst werden, um Bakterien aus verschiedenen Nischen mit anderen wünschenswerten Eigenschaften zurückzugewinnen.

In situ Isolierung und Kultivierung von widerspenstigen Bodenbakterien mit Hilfe eines Isolation Chips (iChip)

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von intakten Protoplasten aus Geweben des 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis. Da die isolierten Protoplasten intakt bleiben für mindestens 96h und sind aus Sämlingen statt einer Monate alten reifen Pflanzen isoliert, beschleunigt dieses Verfahren Assays erfordert intakte Protoplasten.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Lernen Sie die Isolierung und das Screening von Bodenpilzen zur Bioremediation widerständiger Materialien wie Kohlenwasserstoffe und Kunststoffe. Diese Methode identifiziert Pilzstämme mit hohem Abbau-Potenzial für Umweltsanierungen.

Isolierung und Screening aus der Bodenbiodiversität auf Pilze, die am Abbau widerspenstiger Materialien beteiligt sind

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