Nachweis der postreplizierenden Lückenakkumulation und -reparatur in menschlichen Zellen mit dem DNA-Faser-Assay

Unser Protokoll eröffnet neue Möglichkeiten, um zu untersuchen, wie die Replikation auf beschädigter DNA abläuft. Die Techniken können die Bildung und Reparatur von einzelsträngigen DNA-Lücken gegenüber der DNA-Läsion nachweisen. Die S1-Nuklease spaltet die einzelsträngige DNA und ermöglicht den Nachweis von postreplizierenden Lücken.

Dieser Ansatz wurde erstmals von Dr. Meneghini und Dr. Cordiero-Stone in den 1970er Jahren in Brasilien verwendet und kürzlich von uns an den DNA-Faser-Assay angepasst. Die Verwendung der hier beschriebenen Technik zur Untersuchung der Bildung und Reparatur von postreplizierenden Lücken kann Einblicke in den Mechanismus der DNA-Reparatur und der Replikationsstressreaktion geben, die die Integrität des Genoms aufrechterhalten. Für beide hier beschriebenen Protokolle, die S1-Faser und die lückenfüllenden Assays, ist es wichtig, alle Kontrollen einzubeziehen, um eine genaue Interpretation der Daten zu gewährleisten.

Das Verfahren wird von Davi J.Martins, einem Doktoranden aus unserem Labor, und Dr. Annabel Quinet, einer Mitarbeiterin, die diese Techniken zuvor bei der Arbeit in unserer Gruppe entwickelt hat, demonstriert. Aspirieren Sie zunächst die Kulturmedien und fügen Sie sofort die Kulturmedien mit 20-Mikromolar IDU-Medien zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für genau 20 Minuten.

Dann waschen Sie die Zellen schnell zweimal mit vorgewärmtem PBS und bestrahlen Sie sie mit 20 Joule pro Quadratmeter UV-C. Verwenden Sie unbehandelte Zellen als Kontrollen. Fügen Sie sofort die Medien mit 200-Mikromolar CldU zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für genau 60 Minuten.

Danach waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS und permeabilisieren Sie sie mit dem CSK 100-Puffer für zwei bis 10 Minuten entsprechend der Zelllinie bei Raumtemperatur. Nach der CSK-Permeabilisierung können die Kerne mit fast keinem Zytoplasma im Vergleich zu denen vor der Permeabilisierung gesehen werden. Gießen Sie PBS vorsichtig an der Seite jedes Brunnens, um die Kerne mit PBS zu waschen.

Dann waschen Sie die Kerne mit S1-Puffer. Inkubieren Sie die Kerne im S1-Puffer mit 20 Einheiten pro Milliliter-S1-Nuklease und ohne die S1-Nuklease für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes aspirieren Sie den S1-Puffer und fügen Sie 0,1% BSA in PBS hinzu.

Kratzen Sie die Kerne und übertragen Sie sie in ein ungefähr annotiertes 1,5-Milliliter-Rohr. Halten Sie die Röhren die ganze Zeit auf Eis. Zentrifugieren Sie die Kerne bei etwa 4.600 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Resuspendieren Sie die Pellets in PBS in einer Konzentration von etwa 1.500 Zellen pro Mikroliter. Legen Sie die Röhrchen auf Eis und fahren Sie sofort mit der DNA-Faservorbereitung fort, indem Sie das Protokoll verteilen. Kommentieren Sie die Objektträger mit einem Kohlestift und legen Sie sie flach auf ein Tablett.

Klopfen Sie auf den Boden des Rohres, um eine Homogenisierung zu gewährleisten, und fügen Sie zwei Mikroliter Zellen auf der Oberseite des entsprechenden Objektträgers hinzu. Fügen Sie sechs Mikroliter des Lysepuffers hinzu und lysieren Sie die Zellen, indem Sie etwa fünfmal auf und ab pipettieren. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um den Tropfen leicht in Richtung des Bodens des Objektträgers zu ziehen, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Kerne zu lysieren.

Neigen Sie die Folie um etwa 20 bis 40 Grad und lassen Sie den Tropfen mit konstant niedriger Geschwindigkeit auf den Boden der Rutsche ausbreiten. Lassen Sie den Schieber bei Raumtemperatur im Dunkeln 10 bis 15 Minuten trocknen. Tauchen Sie sie dann in ein Glas mit der frisch zubereiteten Fixierlösung und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um DNA auf den Objektträgern zu fixieren.

Waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS für fünf Minuten und denaturieren Sie die DNA mit frisch zubereiteter 2,5-Molaren-Cloridsäure für 40 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Dias dreimal mit PBS für fünf Minuten und blockieren Sie mit 5% BSA, das zuvor für 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius erwärmt wurde. Tippen Sie vorsichtig auf das Papier, um die überschüssige Flüssigkeit aus den Objektträgern zu entfernen.

Fügen Sie 30 Mikroliter primäre Antikörper tropfenweise zu den Objektträgern hinzu und legen Sie einen Deckzettel darauf. Inkubieren Sie für 1 bis 1,5 Stunden bei Raumtemperatur in einer dunklen, feuchten Kammer. Legen Sie die Dias für ein bis zwei Minuten in ein Glas mit PBS und entfernen Sie dann vorsichtig die Deckgläser.

Mit PBST dreimal für fünf Minuten in einem Glas waschen und die Dias in PBS legen. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie vorsichtig auf ein Papier klopfen und fügen Sie 30 Mikroliter der sekundären Antikörper zu den Objektträgern tropfenweise hinzu. Legen Sie einen Deckzettel darauf.

45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur in einer dunklen und feuchten Kammer inkubieren. Wiederholen Sie die Schritte zum Waschen der Objektträger und zum Entfernen des überschüssigen PBS erneut und fügen Sie 20 Mikroliter des Montagereagenzes tropfenweise zu den Objektträgern hinzu. Legen Sie einen Deckzettel darauf und vermeiden Sie Blasen.

Legen Sie einen Tropfen Tauchöl in die Nähe der Oberseite des Objektträgers, wo die Zellen lysiert wurden. Verwenden Sie den grünen Kanal und suchen Sie nach den grünen Punkten im Hintergrund, um den Fokus zu finden. Öffnen Sie die Leica Application Suite, klicken Sie auf Acquire und wählen Sie den grünen Kanal aus.

Passen Sie vor der Analyse die Einstellungen des grünen Kanals an. Wechseln Sie dann zum roten Kanal und passen Sie die Einstellungen an. Finden Sie die Hauptkonzentration der Fasern und bewegen Sie sich zu den Rändern, um die gut gespreizten, nicht überlappenden, einzelnen Fasern zu finden.

Verwenden Sie nur einen Kanal, um die Bereiche für die Bilder auszuwählen und mögliche Verzerrungen zu vermeiden. Klicken Sie auf das Symbol Overlay erfassen und passen Sie die Software auf die richtige Mikroskopvergrößerung an. Nehmen Sie etwa 15 bis 20 Bilder pro Folie neben der gesamten Folie am grünen Kanal und dann am roten Kanal auf.

Die beiden Kanäle werden nun zusammengeführt und das erstellte Overlay wird in einen eindeutigen Ordner verschoben. Es ist möglich, die Fasern mit roten und grünen Farben zu sehen. Öffnen Sie die ImageJ-Software, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das fünfte Symbol, wählen Sie die zweite Option aus und wählen Sie dann das Werkzeug Segmentierte Linie aus.

Klicken Sie mit der linken Maustaste, um den genauen Pfad des roten oder grünen Trakts zu zeichnen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Zeichnung zu stoppen. Drücken Sie die M-Taste auf der Tastatur, um die Länge zu messen. Behalten Sie für die S1-Faser die roten und grünen Traktmessungen für jede Faser im Auge und messen Sie rote und grüne Traktlängen von mindestens 150 Fasern aus verschiedenen Bildern.

Eine S1-Faser ist in diesen repräsentativen Bildern zu sehen. Kontrollnaszenter DNA-Trakt ohne die Lücken und unempfindlich gegen Spaltung durch die S1-Nuklease wird hier gezeigt. DNA-Trakt, der positiv auf Lücken ist, die durch die S1-Nuklease gespalten wurden, führte zu einer kürzeren CldU-Traktlänge.

Ein im Textmanuskript ausführlich beschriebenes differentielles Beschriftungsschema kann durchgeführt werden, um lückenfüllende Ereignisse zu kennzeichnen. In diesem Assay, dem sogenannten Gap-Filling Assay, entsprechen längere IDU-Tracks mit mindestens einem CldU-Pflaster oder weniger CldU-Patches einer geringen Lückenfülldichte. Kürzere IDU-Trakte mit mindestens einem CldU-Patch und längere IDU-Trakte mit mehr CldU-Patches entsprechen einer hohen lückenfüllenden Dichte.

Der Permeabilisierungsschritt dieses Protokolls ist entscheidend dafür, dass die S1-Nuklease auf die Lücken einwirkt, die während der Replikation beschädigter DNA gebildet werden. Die S1-Nuklease kann auch im Kometen-Assay-Protokoll verwendet werden, um die Lücken zu erkennen, die während der Replikation beschädigter DNA gebildet werden, die nach der Behandlung bestehen bleibt. Der S1-Faserassay ebnete den Weg für das neue Paradigma, dass postreplizierende Lücken eine Krebsanfälligkeit verursachen können, insbesondere bei Brust- und Eierstockkrebs, die Mutationen in BRCA1- und 2-Genen tragen.