Name: Markierungsfreie nichtlineare Optik zur Untersuchung von Tubulin-abhängigen Defekten im zentralen Myelin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie markierungsfreie nichtlineare Optik mikrotubulusbeladene Oligodendrozyten in Tubulinopathie-Modellen sichtbar macht. Diese Methode liefert neue Einblicke in die Mikrotubulusdynamik und neurologische Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: infraestructura 226450 an VP-CIO, infraestructura 255277 an V.P. und FORDECYT-PRONACES/194171/2020 an V.H. Wir danken für die Unterstützung von Juvenal Hernández Guevara als CIO bei der Videoproduktion.

Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Gesetzen und Kodizes durchgeführt, die im siebten Titel der Verordnung des Allgemeinen Gesundheitsgesetzes über die Gesundheitsforschung der mexikanischen Regierung (NOM-062-ZOO-1999) genehmigt wurden, und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens der Nationalen Gesundheitsinstitute für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und wurden vom institutionellen Ausschuss für Bioethik in der Forschung der Universidad de Guanajuato und der Benemérita Universidad Autónoma de Guanajuato genehmigt. Puebla.
1. Mikroskop-Einstellungen
<ol><li>Schalten Sie das Mikroskopiesystem ein.</li>
	<li>Schalten Sie den gepulsten Laser ein, um sicherzustellen, dass er nach der Probenextraktion und -vorbereitung mit einem optimalen und konstanten Leistungsniveau lasieren kann.</li>
	<li>Stellen Sie den Laser auf 810 nm ein. Zur Untersuchung von Tisular-Mikrotubuli werden 10%-20% der verfügbaren Laserleistung verwendet, was im beschriebenen System 13-26 mW entspricht, gemessen an der hinteren Brennebene des Objektivs.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop Köhler-ausgerichtet ist (Ergänzungsdatei 1) mit dem Objektiv, das für die SHG-Bildgebung verwendet wird. HINWEIS: Dies ist wichtig, da in der kommerziellen Einrichtung, die in dieser Arbeit verwendet wird, die Detektion im Übertragungsmodus und durch den Kondensator durchgeführt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie unerwünschte Filter aus dem optischen Erkennungspfad (Abbildung 1A).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Kondensatormembran vollständig geöffnet ist, um sicherzustellen, dass kein Licht unnötig auf diesem Niveau gestoppt wird.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 25x/0,8-faches Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur (NA) und einem kleinen Tropfen Immersionsöl im Objektiv vor. HINWEIS: Dieses Objektiv wurde verwendet, um am besten mit dem Kondensator NA übereinzustimmen, der 0,55 betrug (idealerweise NAcond≥ NAobj).</li>
</ol>2. Vorkontrollen des Mikroskops
HINWEIS: Führen Sie die vorbereitenden Mikroskopkontrollen einmal durch, es sei denn, der Aufbau wurde geändert.
<ol><li>Stellen Sie trockene Maisstärke zwischen Objektträgern mit SHG-Parametern dar, um SHG-Bilder zu erzeugen, die die Polarisationsrichtung des Lasers anzeigen. Befolgen Sie die in Ergänzungsdatei 2 beschriebenen Schritte, mit Ausnahme der Laserleistung, die bei Maisstärke weniger als 5% beträgt.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Bild von spärlichen Maisstärkekörnern und markieren Sie die Ausrichtung der SHG-Läppchen in der x-y-Ebene. Diese Ausrichtung entspricht der Laserorientierung (Abbildung 2A).</li>
	<li>Nehmen Sie zur Kontrolle ein weiteres Bild derselben Probe auf, indem Sie eine Halbwellenplatte (Position in Abbildung 1A) in den optischen Pfad einfügen, um die Schwingungsrichtung des Lasers zu ändern. Das resultierende Bild zeigt gedrehte SHG-Signalläppchen (Abbildung 2B, C).</li>
	<li>Wenn Sie einen anderen Bandpassfilter für das SHG verwenden, stellen Sie sicher, dass es optimale Übertragungseigenschaften aufweist, indem Sie die Bilder (Abbildung 2D, E) und die Signalintensitäten Pixel für Pixel entlang einer Zeilenabtastung vergleichen (Abbildung 2F).</li>
</ol>3. Gewebeentnahme
HINWEIS: Verwenden Sie immer saubere Werkzeuge, um die chirurgischen Eingriffe durchzuführen.
<ol><li>Verwenden Sie 6-12 Monate alte Taiep-Ratten und altersangepasste Sprague-Dawley-Kontrollen (WT).</li>
	<li>Betäuben Sie die Tiere mit einer i.p. Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (0,125 mg/kg und 5 mg/kg), verdünnt in einer 0,9%igen sterilen NaCl-Lösung.<ol><li>Überprüfen Sie die Schmerzreflexe und fahren Sie nur fort, wenn sie fehlen.</li>
	</ol></li>
	<li>Opfere das Tier durch Enthauptung.</li>
	<li>Sobald der Kopf isoliert ist, öffnen Sie die Knochen des Schädelgewölbes vorsichtig entlang der Mittellinie, beginnend mit dem kaudalsten Punkt oben in Richtung Nase, von den Augenhöhlen in Richtung der Mittellinie und dann vom kaudalsten Punkt bis unter das Gehirn und das Kleinhirn. HINWEIS: Knochenschneider und Rongeurs ermöglichen eine ordnungsgemäße Entfernung der Kopfknochen, ohne die Gehirnstrukturen zu beschädigen.</li>
	<li>Lösen Sie das Gehirn und das Kleinhirn vom Knochen. Die beiden Hemisphären konnten getrennt werden. Wenn die Hemisphären geteilt sind, verwenden Sie eine Hälfte für die SHG-Bildgebung und fixieren Sie die andere Hälfte in 3,7% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 20 Minuten in einer chemischen Haube für das anschließende Schneiden und Färben.</li>
</ol>4. Vibratom-Schnitte
<ol><li>Bereiten Sie eine Vibratom-Pufferschale vor, die mit warmer (37 °C) Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gefüllt ist.</li>
	<li>Befestigen Sie das Gehirn mit Cyanacrylatkleber über ein Stück Klebeband an der Probenplatte. Der kaudalste Teil / die kaudalste Region berührt den Klebstoff, so dass die verwendbaren koronalen Abschnitte aus dem gegenüberliegenden, rostralen Teil geschnitten werden können.<ol><li>Lassen Sie ~10 s für die Polymerisation des Klebstoffs zu, um eine effektive Bindung der Probe zu erhalten. HINWEIS: Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn das Gehirn so ausgerichtet ist, dass die Klinge "von oben nach unten" und nicht "von einer Seite zur anderen" schneidet (Abbildung 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Übertragen Sie die Probenplatte auf ihre magnetische Halterung in der Pufferschale.</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Schneiden von 300-500 μm-Abschnitten, bis die produzierten Scheiben die gesamte Oberfläche des Gehirns umfassen.</li>
	<li>Reduzieren Sie an dieser Stelle die Dicke des Abschnitts auf 160 μm.</li>
	<li>Sobald ein vollständiger 160-μm-Schnitt auf Höhe des Corpus callosum geschnitten wurde, wird er mit einer modifizierten Pasteur-Glaspipette mit einer großen, geflammten Öffnung zurückgewonnen (Abbildung 1C).</li>
	<li>Übertragen Sie es in eine saubere Petrischale mit neuem warmen HBSS oder direkt auf den Glasträger für die Mikroskopie (Deckglas oder Glasbodenschale). HINWEIS: Unter den beschriebenen Versuchsbedingungen ist das Hinzufügen eines Deckglases über der Probe schädlich für die Bildgebung.</li>
</ol>5. Übertragung auf das Mikroskop
<ol><li>Wenn sich das Mikroskop in einem anderen Raum befindet, bereiten Sie eine isolierte Box mit erwärmten Gelpackungen vor, um die Gewebeschnitte unter Beibehaltung der Temperatur zu übertragen. Die Box dient auch dazu, die Abschnitte warm zu halten, bis sie abgebildet sind.</li>
	<li>Legen Sie die Probe unter das Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sie durch direkte Beobachtung durch das Okular mit Durchlicht richtig unter dem Objektiv positioniert ist. HINWEIS: Ziel ist es, die vorhergesagten emittierenden Strukturen mit der Schwingungsrichtung des Lasers in Einklang zu bringen, um das emittierte (und damit detektierte) SHG-Signal zu maximieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das überschüssige HBSS, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm die gesamte Probe bedeckt. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfilm alle paar Minuten, um eine übermäßige Verdunstung und Trocknung der Probe zu vermeiden. HINWEIS: Unter den beschriebenen Bedingungen wird ein Abschnitt nicht länger als 20 Minuten verwendet. Das Trocknen der Probe verursacht drastische künstliche Effekte (ergänzende Abbildung 1A). Anstatt mehr HBSS hinzuzufügen, wird ein regelmäßiges Einweichen des Abschnitts in warmem, frischem Medium empfohlen, wenn längere Bildgebungszeiten erforderlich sind. Die Verwendung von Perfusionskammern und Klebstoff oder niedrigschmelzender Agarose zur Immobilisierung des Gewebes wird auch empfohlen, wenn längere Experimente durchgeführt werden sollen.</li>
	<li>Bereiten Sie den Mikroskoptisch für die nicht gescannte Bildgebung vor, die das Schließen aller Türen der dunklen Inkubationskammer oder das Abdecken der Inkubationskammer mit einem schwarzen Nylon-Polyurethan-beschichteten Gewebe umfassen kann.</li>
</ol>6. Bildgebung
<ol><li>Wählen Sie den Bildgebungsmodus "nicht gescannt" entlang des Übertragungspfads. Auf diese Weise wird die Erfassung des schwachen SH-Signals von Tubulin optimiert.</li>
	<li>Wählen Sie das Ziel LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA aus.</li>
	<li>Stellen Sie eine Laserleistung zwischen 13 mW und 26 mW ein, mit einer Pixelverweilzeit von 12,6 μs. Nehmen Sie Bilder mit einer Größe von nicht mehr als 512 x 512 Pixeln mit einer Geschwindigkeit von 5 und einem Durchschnitt von 2 auf, was einer durchschnittlichen Aufnahmezeit von etwa 15 s entspricht. HINWEIS: Die Verwendung höherer Laserleistungen und/oder längerer Verweilzeiten kann die Probe beschädigen (ergänzende Abbildung 1B).</li>
	<li>Nehmen Sie zunächst Bilder mit einem 485-nm-Kurzpassfilter (SP485) auf und fügen Sie in einem zweiten Schritt einen scharfen 405-nm-Bandpassfilter (BP405; Abbildung 3). Befolgen Sie die in Ergänzungsdatei 2 beschriebenen Schritte. HINWEIS: Pseudo-Hellfeld-Bilder können durch den gleichen Detektor mit dem verbleibenden Laserlicht einer sichtbaren Linie aufgenommen werden (405 nm oder 488 nm Laser funktionieren am besten).</li>
</ol>7. Verarbeitung des Kleinhirns
<ol><li>Schneiden Sie zuerst das Kleinhirn mit einem Skalpell in zwei Hemisphären und kleben Sie sie dann mit dem mittleren Teil (dem flachen Teil, der nach dem Schneiden erhalten wird) auf die Vibratomstütze.</li>
	<li>Schnitt und Bild des Kleinhirns auf die gleiche Weise, wie es für das Gehirn beschrieben wurde (160 μm Schnitte, gleiche Vibratomeinstellungen, gleiche Klinge, gleiche Mikroskopeinstellungen usw.). HINWEIS: Aufgrund der Anatomie des Kleinhirns ist seine Ausrichtung zum Zeitpunkt des Schneidens nicht kritisch. In den meisten Schichten, die von der Oberfläche entfernt erzeugt werden, werden Folien gut in die weiße Substanz geschnitten.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die SHG-Mikroskopie ist Teil einer Gruppe nichtlinearer optischer Techniken, zu denen die Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie, die Mikroskopie der dritten harmonischen Generation und die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie gehören, die dazu beigetragen haben, das Anwendungsspektrum der konventionellen optischen Mikroskopie auf die Biowissenschaften auszudehnen20.
Insbesondere beziehen sich die Hauptstärken und Schwächen der SHG-Mikroskopie auf die gleiche Beding...

Die optische Bildgebung von Zytoskelettstrukturen in Geweben und Organpräparaten ist keine leichte Aufgabe. Zytoskelettfilamente sind allgegenwärtig, so dass, wenn eine generische Färbung durchgeführt wird, zum Beispiel gegen Alpha-Tubulin oder Beta-Aktin oder möglicherweise Keratin in einer Epithelprobe, das Signal wahrscheinlich ziemlich homogen über die gesamte Probe verteilt wird. Um die Färbung auf eine aussagekräftigere Teilmenge zellulärer Komponenten zu beschränken, kann man entweder transgene Mäuse mit gezielter Expression1 verwenden oder isoformspezifische Antikörper verwenden. Während nur sehr wenige der letzteren auf dem Markt sind (und nur sehr wenige existieren 2,3,4), könnte ein transgenes Tiermodell verfügbar sein. Es muss jedoch vom Labor erworben und ordnungsgemäß untergebracht werden, mit allen Kosten, die mit dem Prozess verbunden sind. Bestimmte Antikörper oder Chemikalien, z. B. Fluorophor-konjugierte Arzneimittel wie Phalloidin oder Paclitaxel, können teilweise oder vollständig mit der Anwendung in lebenden Zellen oder Geweben unvereinbar sein, so dass ihre Anwendbarkeit auf Studien an festen Proben beschränkt ist.
Im Falle von Tubulin muss ein weiterer Aspekt berücksichtigt werden, nämlich die Empfindlichkeit des Polymers gegenüber der Fixierung. Die konventionelle chemische Fixierung mit Formaldehyd ist dafür bekannt, dass sie nicht ausreicht, um die Integrität von Mikrotubuli optimal zu erhalten5. Darüber hinaus bestätigt ein kürzlich veröffentlichter Bericht, dass die Formaldehydvernetzung subtile Veränderungen in der Ultrastruktur des Mikrotubuli induziert, ähnlich wie bei der Bindung einiger Medikamente oder physiologischer Moleküle wie GTP6.
Die direkte Visualisierung von Mikrotubuli in ungefärbten, nicht fixierten Proben ist daher oft wünschenswert. Um dies zu erreichen, ist die Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation (SHG)7, die auf der Fähigkeit von Bündeln paralleler Mikrotubuli basiert, als Harmonophore zu fungieren und frequenzverdoppeltes Licht zu emittieren, wenn sie mit einem intensiven, gepulsten Infrarotlaser richtig beleuchtet werden. Obwohl ein stärkeres und stabileres Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen und Myosin erzeugt werden kann, die die einzigen beiden anderen biologischen Materialien sind, von denen bekannt ist, dass sie zur Frequenzverdopplung fähig sind, wurde das Signal von Tubulin bisher hauptsächlich verwendet, um mitotische Spindelumlagerungen 8,9,10 und axonale MikrotubuliMorphologie 11,12,13 zu untersuchen.
In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige Anwendung der SHG-Mikroskopie als diagnostisches Werkzeug vor, um Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), die von Tubulin-beta-4-A (TUBB4A)-Tubulinopathie betroffen sind, von ihren gesunden Gegenstückenzu unterscheiden 14. Einige der Mutationen, die in dieser überwiegend neuralen Isoform von Tubulin auftreten, wie diejenigen, die Hypomyelinisierung und Atrophie der Basalganglien und des Kleinhirns (H-ABC) verursachen, induzieren eine Überfüllung der Mikrotubuli in den Oligodendrozyten15,16; Die Veränderungen des Zytoskeletts sind wiederum mit nachgeschalteten Effekten wie Dysmyelinisierung verbunden, mit einer tiefgreifenden Beeinträchtigung der motorischen und sensorischen Bahnen16,17,18,19. Das in dieser Arbeit verwendete Taiep-Mausmodell zeigt einen abnormalen Mikrotubuli-Gehalt in den Oligodendrozyten und rekapituliert die meisten sensomotorischen Symptome von H-ABC-Patienten17. Das Protokoll erklärt, wie Strukturen wie das Corpus callosum und das Kleinhirn, die normalerweise stark myelinisiert sind und die sowohl bei menschlichen Patienten als auch bei der Taiep-Ratte 19 stark betroffen sind, abgebildet werden können, um die Unterschiede in den SH-Signalen zwischen gesundem und mutiertem Gewebe hervorzuheben.

<table><tbody><tr><td>405/10 nm BrightLine(R) Singleband-Bandpassfilter&nbsp;</td><td>Semrock</td><td>Artikel-Nr.: FF01-405/10-25</td><td>32 mm Durchmesser, mit Gehäusering</td></tr><tr><td>Schwarzes Nylon, Polyurethan-beschichtetes Gewebe</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td><td>5' x 9' (1,5 m x 2,7 m) x 0,005" (0,12 mm) Dicke&nbsp;</td></tr><tr><td>Klingen für Vibratome</td><td>jede Werbung; z.B. Wilkinson Schwert</td><td></td><td>&nbsp; Klassische doppelschneidige Rasierklingen aus Edelstahl</td></tr><tr><td>Zellkulturschalen, 35 mm</td><td>jede Werbung; z.B. Falke</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>Inverses Mikroskop, verwendetes Objektiv ist LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Kühler</td><td>jeder Werbespot</td><td></td><td>Jede isolierte Styroporbox könnte funktionieren, um die Probe bei etwa 37 μg zu halten; C</td></tr><tr><td>Mais Stach</td><td>z.B. Maizena</td><td></td><td>Aus dem Supermarkt</td></tr><tr><td>Deckgläser #1.5</td><td>jeder Werbespot</td><td></td><td>Rechteckig</td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Kleber</td><td>z.B. Loctite</td><td></td><td>Um das Gehirn auf das Kreppband zu kleben</td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>11412-11</td><td>Zur Manipulation von Gewebeschnitten durch Handhabung von den Hirnhäuten</td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>14370-22</td><td>Um die Haut zu schneiden&nbsp;</td></tr><tr><td>Feine Schere mit gebogener Spitze</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>14061-09</td><td>Entlang der Mittellinie schneiden</td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Zum Verdünnen 1:10 in PBS</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>16000-14</td><td>Um den Knochen zu schneiden</td></tr><tr><td>Gel-Packungen</td><td>jeder Werbespot</td><td></td><td>Vorgewärmt auf 37 Grad; C, um die Temperatur im Kühler zu halten</td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipette, modifiziert</td><td>jeder Werbespot</td><td></td><td>Um den Gewebeschnitt zu übertragen</td></tr><tr><td>Hanks&Prime; Ausgewogene Salzlösung (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td>Kann aus Pulvern hergestellt werden</td></tr><tr><td>Kelly-Hämostatika</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>13018-14</td><td>Um den Knochen zu trennen&nbsp;</td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>jeder Werbespot</td><td></td><td>Zum Schutz der Oberfläche der Probenplatte</td></tr><tr><td>NDD-Modul, Typ C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1410-101</td><td>Um das Signal zu erkennen und den Lichtverlust zu reduzieren. Aufnahme des Filtersets 000000-1935-163 mit dem SP485</td></tr><tr><td>Versetzte Knochenzange</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>16101-10</td><td>Um den Knochen zu schneiden</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td>Kann aus Pulvern oder Tabs zubereitet werden</td></tr><tr><td>Gepulster Laser</td><td>Kohärent</td><td>Chamäleon Vision II</td><td>680&ndash; 1080 nm abstimmbarer Laser</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>jeder Werbespot</td><td></td><td>Gerade Klinge mit scharfer Spitze</td></tr><tr><td>Zange mit Standardmuster</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>15018-10</td><td>Zum Schneiden von Hirnhäuten, die sowohl mit der durch Vibratomusschneiden gewonnenen Scheibe als auch mit der auf die Probenplatte geklebten Scheibe verbunden bleiben.</td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>jede Werbung; z.B. Leica</td><td>VT1200</td><td></td></tr></tbody></table>

markierungsfreie nichtlineare optik zur untersuchung von tubulin-abhängigen defekten im zentralen myelin

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

Die zufriedenstellende Visualisierung von Zytoskelettkomponenten im Gehirn ist eine Herausforderung. Die ubiquitäre Verteilung der Netzwerke von Mikrotubuli, Mikrofilamenten und intermediären Filamenten in allen neuronalen Geweben, zusammen mit der Variabilität der Ergebnisse von fluoreszierenden Proteinfusionsstrategien und ihrer begrenzten Anwendbarkeit auf dynamische Studien von Antikörpern und Medikamenten als Chromophorvehikel, machen klassische optische Ansätze nicht so effektiv wie für andere Proteine. Wenn Tubulin untersucht werden muss, ist die markierungsfreie Erzeugung von zweiten Oberschwingungen aufgrund der nicht-zentrosymmetrischen Organisation des Moleküls eine sehr geeignete Option. Diese Technik kann, wenn sie mit der Mikroskopie konjugiert wird, die volumetrische Verteilung paralleler Bündel von Mikrotubuli in biologischen Proben qualitativ beschreiben, mit dem zusätzlichen Vorteil, mit frischem Gewebe zu arbeiten, das nicht fixiert und nicht permeabilisiert ist. Diese Arbeit beschreibt, wie Tubulin mit einem kommerziellen Mikroskopieaufbau der zweiten harmonischen Generation abgebildet werden kann, um Mikrotubuli in den mit Tubulin angereicherten Strukturen der Oligodendrozyten hervorzuheben, wie bei der Hypomyelinisierung mit Atrophie der Basalganglien und der Tbulinopathie des Kleinhirns (H-ABC), einer kürzlich beschriebenen Myelinerkrankung.

Die mit dieser Methodik erhaltenen Bilder weisen aufgrund der sehr begrenzten Anzahl von Harmonophoren, die in biologischen Geweben vorhanden sind, ein intrinsisch niedriges Hintergrundniveau auf, was einer der wesentlichen Vorteile der Methode ist.
Wenn die Fasern des Corpus callosum abgebildet werden, finden sich im Taiep-Gehirn durchweg faserartige Kurzstrukturen und abgerundete Elemente (Abbildung 3B), während das Corpus callosum des Kontrollgehirns ein viel heterogeneres und isot...

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Mikrotubuli-beladenen Oligodendrozyten in einem Modell der Tubulinopathie durch einen einfachen, innovativen Mikroskopieansatz der zweiten harmonischen Generation vor.

Markierungsfreie nichtlineare Optik zur Untersuchung von Tubulin-abhängigen Defekten im zentralen Myelin

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

Die Second-Harmonic Generation Imaging von biologischen Proben ist eine optische Technik, die die Visualisierung von nicht-zentrosymmetrischen Molekülen und ihren Anordnungen ermöglicht, ohne dass eine Markierung oder ein Farbstoff erforderlich ist. Die mit dieser Methode erzeugten Bilder haben einen geringen Hintergrund, da nur sehr wenige biologische Moleküle als harmonische Kraft wirken können. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Technik zur diagnostischen Bildgebung von Tubulin beta-4A im Taiep-Tiermodell.Tubulinopathien sind kürzlich beschriebene Krankheiten. Aus diesem Grund gibt es nur eine begrenzte Menge an Informationen über die grundlegenden Mechanismen, die der Pathophysiologie auf zellulärer Ebene zugrunde liegen. Schalten Sie zunächst den Pulslaser ein, um sicherzustellen, dass er mit einem optimalen und konstanten Leistungsniveau lasen kann.Für die Untersuchung von Tisular-Mikrotubuli werden 10 bis 20% der verfügbaren Laserleistung verwendet, was im beschriebenen System 13 bis 26 Milliwatt entspricht, gemessen an der hinteren Brennebene des Objektivs. Drehen Sie den Laser vor der Bildgebung auf 810 Nanometer. Stellen Sie dann sicher, dass das Mikroskop auf das Objektiv ausgerichtet ist, das für die Second-Harmonic Generation (SHG-Bildgebung) verwendet wird.Entfernen Sie unerwünschte Filter aus dem optischen Erfassungspfad und stellen Sie sicher, dass die Kondensatormembran vollständig geöffnet ist und kein Licht unnötig angehalten wird. Bereiten Sie ein Ölimmersionsobjektiv mit 25x x 0,8 numerischer Apertur mit einem kleinen Tropfen Immersionsöl im Objektiv vor. Befolgen Sie die in der Tabelle aufgeführten Schritte, mit Ausnahme der Laserleistung, die bei Maisstärke weniger als 5% beträgt.Stellen Sie sich trockene Maisstärke zwischen Glasobjektträgern vor. mit SHG-Parametern zur Erzeugung von SHG-Bildern zeigen sie die Polarisationsrichtung des Lasers an. Nehmen Sie ein Bild von spärlichen Maisstärkekörnern auf und markieren Sie die Orientierung der SHG-Läppchen in der XY-Ebene, die der Laserpolarisationsorientierung entspricht.Nehmen Sie zur Kontrolle ein weiteres Bild derselben Probe auf, bei der eine Halbwellenplatte in den optischen Pfad eingeführt wird, um die Schwingungsrichtung des Lasers zu ändern. Das resultierende Bild zeigt gedrehte SHG-Signalläppchen. Wenn Sie einen anderen Bandpassfilter für das SHG verwenden, stellen Sie sicher, dass es optimale Übertragungseigenschaften aufweist, indem Sie die Bilder und die Signalintensitäten Pixel für Pixel entlang der Abtastlinie vergleichen.Bereiten Sie eine Vibratom-Pufferschale vor, die mit einer warmen Hanks'Balanced Salt Solution oder HBSS gefüllt ist. Befestigen Sie das Gehirn mit Cyanacrylatkleber über ein Stück Klebeband an der Probenplatte. Der kaudalste Teil berührt den Klebstoff, so dass die verwendbaren koronalen Abschnitte aus dem gegenüberliegenden rostralen Teil geschnitten werden können.Übertragen Sie die Probenplatte auf ihre magnetische Halterung in der Pufferschale. Beginnen Sie mit dem Schneiden von 300 bis 500 Mikrometern, bis die Scheiben die gesamte Gehirnoberfläche umfassen. Reduzieren Sie dann die Dicke des Abschnitts auf 160 Mikrometer.Sobald ein 160-Mikrometer-Schnitt auf Höhe des Corpus callosum geschnitten ist, wird er mit einer modifizierten Pasteur-Glaspipette mit einer großen Flanschöffnung zurückgewonnen. Übertragen Sie den Schnitt in eine saubere Petrischale mit neuem warmen HBSS oder direkt auf das Deckglas oder die Glasbodenschale für die Mikroskopie. Die Probe wird unter das Mikroskop gelegt und durch direkte Beobachtung durch das Okular mit Durchlicht entsprechend unter dem Objektiv positioniert.Entfernen Sie das überschüssige HBSS, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm die gesamte Probe bedeckt. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfilm alle paar Minuten, um eine übermäßige Verdunstung und Trocknung der Probe zu vermeiden. Bereiten Sie den Mikroskoptisch für die nicht gescannte Bildgebung vor, einschließlich des Schließens aller Türen der dunklen Inkubationskammer oder der Abdeckung der Inkubationskammer mit einem schwarzen Nylon-Polyurethan-beschichteten Gewebe.Wählen Sie den nicht gescannten Bildgebungsmodus entlang des Übertragungspfads aus. Auf diese Weise wird die Erfassung des schwachen SH-Signals von Tubulin optimiert. Wählen Sie dann das Ziel aus.Stellen Sie als nächstes eine Laserleistung mit einer Pixelverweilzeit von 12,6 Mikrosekunden ein. Nehmen Sie Bilder auf, die nicht größer als 512 x 512 Pixel sind, mit einer Geschwindigkeit von fünf und durchschnittlich zwei Pixeln für eine durchschnittliche Aufnahmezeit von 15 Sekunden. Nehmen Sie zuerst Bilder mit einem 485-Nanometer-Kurzpassfilter auf und fügen Sie in einem zweiten Schritt einen scharfen 405-Nanometer-Bandpassfilter hinzu.Schneiden Sie das Kleinhirn mit einem Skalpell in zwei Hemisphären und befestigen Sie sie am mittleren Teil an der Vibratomstütze. Schneiden und fotografieren Sie das Kleinhirn mit den gleichen Vibratom-, Klingen- und Mikroskopeinstellungen, die für das Gehirn beschrieben sind. Wenn die Fasern des Corpus callosum abgebildet werden, werden faserartige kurze Strukturen und abgerundete Elemente im Taiep-Gehirn beobachtet.Im Gegensatz dazu zeigt das Corpus callosum des Kontrollgehirns ein viel heterogeneres und isotroperes Signal in der gesamten Hirnregion. Der Ursprung des differentiellen Signals liegt speziell im Phänomen der Second-Harmonic Generation, da das Hinzufügen des schmalen Bandpassfilters nur die unspezifische Signalintensität aus den Kontrollbildern verringert, während dieses schwache diffuse Signal selektiv aus der Umgebung der somaartigen und der kurzen länglichen Strukturen in den Taiep-Bildern entfernt wird, die immer intensives SH-Licht erzeugen. Im Kontrollgewebe der zerebellären weißen Substanz wurde das völlige Fehlen eines SH-Signals beobachtet.Die Purkinje-Zellen sind bei Verwendung des Kurzpassfilters kaum sichtbar, und die länglichen und abgerundeten Strukturen bleiben im SH-Bild des Taiep-Gewebes bestehen. Ein kritischer Schritt, um das beste Bild zu erhalten, besteht darin, Gewebeschnitte so dünn wie möglich zu schneiden. Darüber hinaus erfordert die Arbeit mit akuten Gewebeschnitten schnelle Protokolle, um eine Verschlechterung des Gewebes zu verhindern.Daher ist es wichtig, das optische System vorher einzurichten und zu überprüfen. Das Signal der zweiten Harmonischen von Mikrotubuli ist schwächer als das Signal der zweiten Harmonischen von Stärke. Daher muss mehr Laserleistung für die Bildgebung von Mikrotubuli eingesetzt werden.Die Laserleistung sollte vorsichtig erhöht werden, da bei der Bildgebung ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur verwendet wird, die Intensität an der Probe schnell ansteigen würde. Mit der Bildgebung der zweiten harmonischen Generation werden die pathologischen Veränderungen in der zentralen Myelinomatik des tubulinopathischen Modells schnell und einfach identifiziert. Mögliche Anwendungen dieser Technik umfassen die Untersuchung der grundlegenden Mechanismen der H-ABC-Tubulinopathie und die Beurteilung pharmakologischer Therapien zur Behandlung von Patienten. Langfristig hat die Technik das Potenzial, ein komplementäres diagnostisches Instrument zu werden, das intrakraniell oder bei frischen Biopsien eingesetzt werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Video beschreiben wir die Technik der Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM), um Mikrotubuli zu visualisieren, die auf einer Deckglasoberfläche in Gegenwart eines geeigneten Puffers wachsen. Bei Beleuchtung mit einfallendem Licht reflektieren die Deckglas-Puffer-Grenzfläche und die Puffer-Mikrotubuli-Grenzfläche Licht, das sich zu einem Interferenzmuster verbindet, das die Visualisierung von Mikrotubuli als kontrastreiche Bilder vor einem hellen Hintergrund ermöglicht.

Interferenzreflexionsmikroskopie zur markierungsfreien Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik

Quelle: Piazza, V., et al., Markierungsfreie nichtlineare Optik zur Untersuchung von Tubulin-abhängigen Defekten im zentralen Myelin. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Bildgebung von Mikrotubuli-Anomalien in einem Hirngewebeschnitt einer Ratte mit einem Zwei-Photonen-Anregungsmikroskop. Es verwendet Signale der zweiten harmonischen Generation (SHG), um Tubulindefekte und eine verminderte Myelinproduktion zu erkennen.

Bildgebung der zweiten harmonischen Generation in einem Rattenmodell zur Untersuchung von Tubulindefekten

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zwei-Photonen-Anregungs-Zeitraffermikroskopie verwendet, um gleichzeitig die Dynamik von Axon- und Myelinverletzungen in Echtzeit zu visualisieren. Dieses vorgeschlagene Protokoll ermöglicht die Untersuchung sowohl intrinsischer als auch extrinsischer Faktoren, die das Schicksal des zentralen myelinisierten Axons nach einer Verletzung beeinflussen und zu einer dauerhaften klinischen Behinderung beitragen können.

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