Ein In-vitro-Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Dysfunktion: Ein Cybrid-Modell
9. März 2022
Transmitochondriale Cybride sind Hybridzellen, die durch Verschmelzung von mitochondrialen DNA (mtDNA)-deplementierten Zellen (rho0-Zellen ) mit Zytoplasten (enukleierten Zellen) von Patienten mit mitochondrialen Störungen erhalten werden. Sie ermöglichen die Bestimmung des nuklearen oder mitochondrialen Ursprungs der Krankheit, die Bewertung der biochemischen Aktivität und die Bestätigung der pathogenetischen Rolle von mtDNA-bezogenen Varianten.
Cyber-Generierung ist immer noch das State-of-the-Art-Protokoll, um die pathogene Rolle jeder neuartigen mitochondrialen DNA-Mutation zu verstehen und den Prozentsatz der Atriplassie mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Diese Technik ermöglicht die Durchführung biochemischer Untersuchungen in einem homogenen Kernsystem, in dem der Beitrag des nuklearen Hintergrunds des Patienten fehlt. Diese Technik ermöglicht die Validierung der Pathogenität einer Mutation der mitochondrialen DNA.
und ermöglicht es, seine Auswirkungen auf biochemischer Ebene zu untersuchen Waschen Sie das 35-Millimeter-Geschirr, das die Fibroblasten enthält, zweimal mit zwei Millilitern 1X PBS ohne Kalzium und Magnesium. Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs mit 70% Ethanol und warten Sie, bis der Alkohol verdunstet. Entfernen Sie die Deckel vom Geschirr und die Schraubverschlüsse von den Flaschen.
Stellen Sie jede Schale ohne Deckel kopfüber auf den Boden jeder 250-Milliliter-Zentrifugenflasche. Fügen Sie langsam 32 Milliliter eines Keimbildungsmediums zu jeder Flasche hinzu, damit das Medium in die Schale gelangen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann. Entfernen Sie alle Blasen vom Geschirr mit einer langen Glaspipette und krümmen Sie die Spitze in einer Bunsenflamme.
Schließen Sie jede Flasche mit dem Schraubverschluss und geben Sie sie in die Zentrifuge. Zentrifen Sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 8.000 x G.Saugen Sie das Medium aus den Flaschen und entsorgen Sie es. Entfernen Sie das Geschirr, indem Sie die Flaschen auf einer sterilen Gaze umdrehen, die zuvor mit 70% Ethanol besprüht wurde.
Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs und seiner Deckel mit 70% Ethanol und schließen Sie das Geschirr, nachdem das Ethanol verdunstet ist. Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie die Cytoplastenbildung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen. Suchen Sie nach extrem länglichen Fibroblasten aufgrund der Extrusion ihrer Kerne, die durch Cytochalasin induziert werden.
Fügen Sie zu jeder 35-Millimeter-Schale 1.000, 143 Zeilennullzellen hinzu. Resuspendiert in zwei Millilitern Kulturmedium, ergänzt mit 5% FBS. Lassen Sie das Geschirr drei Stunden in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator, um die 143 Reihen-Null-Zellen auf den Geistern zu besiedeln.
Nach drei Stunden Inkubation das Medium absaugen und entsorgen. Waschen Sie die Adhärenzzellen zweimal mit zwei Millilitern DMEM-hohem Glukosemedium ohne Serum oder MEM, dann aspirieren und verwerfen Sie das Medium. Geben Sie 500 Mikroliter Polyethylenglykollösung in die Zellen und inkubieren Sie für genau eine Minute.
Saugen Sie die Polyethylenglykollösung ab und verwerfen Sie sie. Waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei Millilitern DMEM-hoher Glukose ohne Serum oder mit MEM. Fügen Sie zwei Milliliter Fusionsmedium hinzu und inkubieren Sie über Nacht im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Trypsinisieren Sie die Zellen in den verbleibenden Kulturschalen Zählen Sie sie und säen Sie sie in eine oder mehrere Petrischalen Fügen Sie 50 bis 100 Zellen pro Schale in die ergänzte Kultur ein, bis Klone erscheinen. Dann lassen Sie sie mehrere Tage wachsen. Nehmen Sie mit einem Stereomikroskop die Klone mit Klonflaschen oder einer Pipettenspitze aus der Petrischale auf.
Versuchen Sie, das Pooling verschiedener Klone zu vermeiden und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte, die jeweils 200 Mikroliter ergänztes Kulturmedium enthält. Cybrids wurden ausgehend von Fibroblasten erzeugt, die von einem Patienten abgeleitet wurden, der den heteroplasmatischen M2343A2G trug Eine der häufigsten mitochondrialen DNA-Mutationen, die mit mitochondrialer Myopathie, Enzephalopathie, Laktatazidose und Schlaganfall-ähnlichen Episoden assoziiert sind. Die Analyse einer variablen Anzahl von Tandemwiederholungen zeigte, dass Cyber-DNA mit den Zellen der Reihe Null identisch ist, was den Ersatz der Cyber-DNA des Patienten durch das 143 B-Genom bestätigt.
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus oder Sequenzierungsanalysen können verwendet werden, um das Vorhandensein der mitochondrialen DNA-Mutation und den Heteroplasmieprozentsatz zu beurteilen. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, das korrekte genetische Asset des Nukleons und der mitochondrialen DNA sowie die mitochondriale DNA-Menge in den wiederbesiedelten Cybriden zu überprüfen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Transmitochondriale Cybriden sind Hybridzellen, die durch die Fusion von mtDNA-depletierten Zellen mit Cytoplasten von Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen erzeugt werden. Dieser Ansatz hilft, die Ursache von Krankheiten zu bestimmen und biochemische Aktivitäten zu bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- mitochondriale Genetik
Hintergrund
- Transmitochondriale Cybriden sind unerlässlich für die Erforschung mitochondrialer Erkrankungen.
- Sie ermöglichen die Analyse der Beiträge des Zellkerns und der Mitochondrien zur Krankheitsentstehung.
- Diese Technik ist entscheidend, um die Pathogenität von mtDNA-Mutationen zu bestätigen.
- Das Verständnis der biochemischen Auswirkungen von Mutationen ist entscheidend für das Krankheitsmanagement.
Zweck der Studie
- Untersuchung der pathogenen Rolle neuartiger mitochondrialer DNA-Mutationen.
- Korrelieren des Heteroplasmieanteils mit der Krankheitsschwere.
- Durchführung biochemischer Untersuchungen in einem kontrollierten nuklearen Umfeld.
Verwendete Methoden
- Fusion von rho 0-Zellen mit enucleierten Cytoplasten.
- Biochemische Assays zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion.
- Validierung von mtDNA-Mutationen durch Cybrid-Analyse.
- Verwendung von PBS und Ethanol zur Zellpräparation.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung von transmitochondrialen Cybriden.
- Identifizierung biochemischer Aktivitäten, die mit mtDNA-Mutationen assoziiert sind.
- Herstellung einer Korrelation zwischen Heteroplasmie-Grad und Krankheitsverlauf.
- Bestätigung der pathogenen Rolle spezifischer mtDNA-Varianten.
Schlussfolgerungen
- Transmitochondriale Cybriden eignen sich gut zur Erforschung mitochondrialer Erkrankungen.
- Diese Methode verbessert das Verständnis von mtDNA-Mutationen und deren Auswirkungen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um gezielte Therapien zu entwickeln.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Transmitochondriale Cybrid-Modelle ermöglichen eine präzise Aufschlüsselung der Beiträge der mitochondrialen gegenüber der nuklearen Genetik zur OXPHOS-Funktionsstörung, einem kritischen Wendepunkt in der Forschung zu mitochondrialen Erkrankungen. Dieser Ansatz liefert eine mechanistische Entlastung und Zielvalidierung für mitochondriale DNA-Mutationen und unterstützt die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Entdeckungs- und translationsmedizinischen Forschung. Die Fähigkeit des Cybrid-Systems, die Pathogenität zu isolieren und zu charakterisieren, bildet die Grundlage für risikoadjustierte Portfolioentscheidungen bei Programmen zu mitochondrialen Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Pathogenität von mtDNA-Mutationen in einem kontrollierten nuklearen Hintergrund.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem OXPHOS-Störungen, die auf mtDNA- oder nDNA-bedingte Ursachen zurückgehen, voneinander unterschieden werden.
- Erleichtert die mechanistische Absicherung neuartiger mitochondrialer Varianten, bevor weitere Investitionen getätigt werden.
- Bietet eine Plattform, um Heteroplasmie-Grade mit krankheitsrelevanten Phänotypen zu korrelieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Gründet validierte Cybrid-Linien für reproduzierbare biochemische und genetische Assays.
- Ermöglicht die quantitative Messung der OXPHOS-Aktivität und des Einflusses von Mutationen.
- Unterstützt die Standardisierung von Assays und die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren in der mitochondriellen Forschung.
- Ermöglicht die Erstellung robuster zellulärer Systeme für die Wirkstoffscreening zur gezielten Behandlung mitochondrialer Dysfunktionen.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft krankheitsrelevante Cybrid-Modelle mit der translationellen Biomarker-Entwicklung.
- Gewährleistet Kontinuität von der genetischen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mitochondrialer Zielstrukturen.
- Ermöglicht risikoadjustierte Weiterentwicklung von kandidatenbasierten Interventionen auf Grundlage mechanistischer Evidenz.
- Unterstützt die prädiktive Risikominimierung für Portfolios von Mitochondriopathien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Cybrid-Modell integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem es Hypothesentests, Zielvalidierung und die Aufklärung von Wirkmechanismen bei mitochondrialen Erkrankungen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Überprüfung der Nullhypothese zur Pathogenität von mtDNA-Mutationen und klärt die genetischen Treiber von OXPHOS-Störungen auf.
- Screening: Stellt standardisierte, reproduzierbare Cybrid-Linien für quantitative biochemische Assays bereit.
- Analytik: Liefert quantitative Messgrößen für Heteroplasmie und OXPHOS-Aktivität zur vergleichenden Analyse.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Erkenntnisse mit der präklinischen Modellvalidierung und der Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform für die kontinuierliche Entdeckung mitochondrialer Zielstrukturen und Biomarker.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Forschung zu mitochondrialen Erkrankungen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Erzeugung und Charakterisierung von Cybriden, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Programmen zu mitochondrialen Erkrankungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellfusion, mitochondrieller Genetik und der Entwicklung biochemischer Assays.
- Setzt Zugang zu spezialisierter Infrastruktur für Zellkultur, Zentrifugation und molekularanalytische Verfahren voraus.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung der Protokolle zur Erzeugung und Validierung von Cybriden.
- Kann Anpassungen für verschiedene Zelltypen oder krankheitsrelevante genetische Hintergründe erfordern.
- Die Überprüfung der nukleären und mitochondrialen genetischen Bestandteile ist entscheidend für die Modelltreue.
