Intraduktale Verabreichung und Röntgenvisualisierung von Ethanol-basierter ablativer Lösung zur Prävention und lokalen Behandlung von Brustkrebs in Mausmodellen

Brustkrebs ist die häufigste Krebsart und die zweithäufigste Krebstodesursache für Frauen in den USA. Aktuelle Präventionsansätze sind begrenzt und mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen verbunden. Neue Interventionen zur Primärprävention sind erforderlich. Wir haben eine Methode zur intraduktalen Verabreichung einer ethanolbasierten ablativen Lösung an das Mammaepithel der Maus zur Brustkrebsprävention entwickelt.

Die Injektion direkt in die Brustwarzenöffnung ermöglicht es, Epithelzellen, die den duktalen Baum auskleiden, mit minimalen Kollateralschäden des Gewebes anzusprechen. Diese Methode ermöglicht eine simultane In-vivo-Bildgebung mit Tantaloxid-Nanopartikeln als hochauflösendem Kontrastmittel. Dieses Verfahren kann für die Verwendung mit anderen Röntgenkontrastmitteln und verschiedenen vorbeugenden Behandlungen mit verschiedenen chemischen oder thermischen ablativen Lösungen angepasst werden.

Der erste Schritt bei dieser Methode der bildgeführten Brustkrebsprävention besteht darin, eine ausgedehnte entzündungshemmende Behandlung durch orale Dosierung von Carprofen unter Verwendung von im Labor hergestellten Sucralose-Gelbechern zu induzieren. Wir bereiten das Tier vor, indem wir enthaarende Creme verwenden, um das Fell aus dem Bereich zu entfernen, der die zu injizierenden Brustwarzen umgibt. Dann werden intraduktale Injektionen mit Hilfe eines Stereoskops durchgeführt, um die Öffnung der Brustwarze für das Einführen der Nadel am besten zu lokalisieren und zu visualisieren.

Nach abgabe der Lösung werden die Tiere mittels Mikro-CT oder Fluoroskopie abgebildet, um festzustellen, wie erfolgreich die Injektionen waren. Mikro-CT-Scans können verarbeitet werden, um 3D-Rekonstruktionen des injizierten Brustduktalbaums für die weitere Analyse der erfolgreichen Füllung und anderer Metriken zu erstellen. Bereiten Sie zuerst Carprofen in der erforderlichen Konzentration vor.

Wir stellen eine Arbeitslösung von zwei mg pro ml her, um 0,5 ml zu injizieren und eine Enddosis von einem mg pro Tasse zu erreichen. Sie können der Mischung sterilen Lebensmittelfarbstoff hinzufügen, um das vollständige Mischen des Arzneimittels in die Sucralose der Tasse besser zu bestätigen. Als nächstes legen Sie die Tassen für 15 Minuten in ein Wasserbad bei 60 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Tassen und trocknen Sie sie ab, um die Möglichkeit einer Kontamination zu minimieren. Verwenden Sie 70% Ethanol oder Ethanoltücher, um die Oberfläche des Tassendeckels zu reinigen und trocknen zu lassen. Verwenden Sie eine Spritze, um die notwendige Menge Carprofenlösung durch den Deckel zu injizieren.

In diesem Fall müssen wir 500 Mikroliter für das gewünschte Ergebnis injizieren. Legen Sie einen Aufkleber über das Loch der Nadel und schütteln Sie die Tasse für 15 Sekunden, bevor Sie für weitere 15 Sekunden wirbeln. Überprüfen Sie die Tasse auf homogenes Mischen, indem Sie nach dunkelblauen Klumpen suchen.

Tassen können dann bis zu einem Monat gekühlt werden. Die Vorbereitung des Tieres sollte zwei bis drei Tage vor dem intraduktalen Eingriff erfolgen. Beginnen Sie mit der Betäubung des Tieres mit Isofluran.

Übertragen Sie die anästhesierte Maus auf einen Nasenkegel, der weiterhin Isofluran liefert. Tragen Sie das Augengleitmittel am Nasenkegel auf die Maus auf und positionieren Sie die Maus dann auf dem Rücken. Verwenden Sie einen Applikator mit Baumwollspitze, um Enthaarungscreme auf den Bereich der Brustdrüsen aufzutragen, den Sie injizieren möchten.

Reiben Sie den Applikator im gewünschten Bereich auf und ab über die Haut des Tieres, um eine schnellere Lockerung des Fells zu ermöglichen. Es ist wichtig, die Creme so wenig Zeit wie möglich auf der Maus zu lassen, um ein Verbrennen der Haut zu vermeiden. Verwenden Sie nach 10 bis 30 Sekunden der Anwendung warmes Wasser auf Gaze, um die Creme vollständig zu entfernen.

Verwenden Sie zwei bis vier Spülungen, um eine vollständige Entfernung sicherzustellen, bevor Sie die Haut mit sauberer Gaze trocknen. Überprüfen Sie die Bereiche der Fellentfernung, um eine gute Sicht und den Zugang zu den Brustwarzen zu bestätigen. Wiederholen Sie bei Bedarf den Enthaarungsvorgang.

Legen Sie die Maus in einen sauberen Aufwachkäfig auf ein Wärmekissen, um sich von der Narkose zu erholen. Geben Sie einen Carprofenbecher, um Mäuse nach der Genesung in ihrem Heimkäfig vorzubereiten. Sie beginnen wieder mit der Betäubung des Tieres mit Isoflurananästhesie und bewegen die Maus zu einem Nasenkegel, sobald sie vollständig induziert wurde.

Augengleitmittel wird aufgetragen, bevor das Tier zur Injektion auf den Rücken gelegt wird. Es kann hilfreich sein, die Beine in der Nähe der Brustdrüsen abzukleben, die injiziert werden, ist aber nicht notwendig. Bereiten Sie die Spritze mit dem gewünschten Volumen der Injektionslösung plus einem Mikroliter vor, falls nach dem Entfernen der Nadel etwas ausläuft.

Es kann hilfreich sein, mit zusätzlichem Volumen zu füllen, um die Nadel unmittelbar vor der Injektion auf freien Durchfluss der Lösung zu testen. Wenn Sie mehr als eine Brustdrüse injizieren, kann es Zeit sparen, mehrere Spritzen vorzufüllen, falls verfügbar. Achten Sie darauf, dies nicht zu früh zu tun, wenn die Lösung anfällig für Verstopfungen ist, wenn sie sitzen gelassen wird.

Bereiten Sie die Brustwarze vor, indem Sie nach Möglichkeit sichtbare abgestorbene Haut mit einer feinen Pinzette entfernen. Es ist nicht notwendig, alle abgestorbene Haut zu entfernen, wenn sie die Brustwarzenöffnung nicht blockiert und gegen Ziehen resistent ist. Dies kann manchmal zu Verletzungen und Schwellungen der Brustwarze führen, wenn abgestorbene Haut zu fest an der lebenden Haut befestigt ist.

Wenn die Fase der Nadel sichtbar ist, führen Sie die Nadel mit Hilfe der fein bestückten Pinzette in die Öffnung der Brustwarze ein. Abhängig von der Länge und Festigkeit der Brustwarze ist es möglicherweise nicht immer möglich, die Brustwarze während der Führung in der Nadel zu halten. Manchmal ist es notwendig, die Brustwarze mit der Nadel zu manövrieren, damit die Pinzette die Brustwarze über die Nadel nach oben ziehen kann, anstatt die Nadel nach unten in die Brustwarze zu führen.

Sobald die Nadelschräne vollständig von der Brustwarze und im Hauptkanal umgeben ist, beginnen Sie langsam mit der Injektion der Lösung. Die gewünschte Rate beträgt ca. 40 Mikroliter pro Minute. Vermeiden Sie es, schneller zu injizieren, um mögliche Schäden am duktalen Baum zu vermeiden.

Warten Sie nach der vollständigen Injektion 30 Sekunden, bevor Sie die Nadel mit Hilfe der Pinzette aus der Brustwarze entfernen. Dies minimiert das Auslaufen aus dem Nippel. Beurteilen Sie den Bereich auf Anzeichen einer erfolglosen Injektion.

Ein gewölbtes Aussehen kann auf eine Fettpolsterinjektion oder ein Trauma in den Bereich hinweisen. Es ist oft möglich zu sehen, dass eine Injektion in das Fettpolster stattfindet, wenn die Lösung Farbstoff enthält oder wenn Sie sorgfältig nach einem Doming an der Injektionsstelle suchen, wie hier zu sehen ist. Fahren Sie fort, die verbleibenden Brustdrüsen, die für Ihr Experiment benötigt werden, auf ähnliche Weise zu injizieren und dabei die Injektionsvolumina und eventuelle Leckagen zu notieren.

Einige Bereiche der Maus können aufgrund von Problemen wie ungeschickter Handplatzierung oder Atemstörungen schwieriger zu injizieren sein. Zum Beispiel wird es einem rechtshändigen Injektor wahrscheinlich am schwersten fallen, die Drüsen auf der oberen rechten Seite der Maus zu injizieren, die hier zu sehen sind. Diese bewegen sich aufgrund der Nähe zur Lunge mehr und es kann schwierig sein, eine gute Handplatzierung mit dem Körper des Tieres zu finden, um das Handgelenk auf der Oberfläche auszuruhen.

Einige können es einfacher finden, die Maus neu zu positionieren, wenn der Nasenkegel es zulässt. Bei der Injektion einer ethanolhaltigen Lösung ist darauf zu achten, dass eine systemische Alkoholintoxikation vermieden wird. Dies erfordert das Wissen, wie viel Ethanol in einer Sitzung injiziert werden kann, und die Verabreichung von Saccharose-haltiger Lösung IP während des Verfahrens, um den Auswirkungen entgegenzuwirken.

Nach dem intraduktalen Eingriff können die Tiere in einem sauberen Käfig auf einem Heizkissen geborgen oder zur Bildgebung gefüllter duktaler Bäume in das Mikro-CT-System gebracht werden. Die Maus sollte auch nach jeder Bildgebungssitzung wiederhergestellt werden. Nachdem Sie das injizierte Tier in das Mikro-CT-System gebracht haben, setzen Sie die Verabreichung von Isofluran fort, um die Anästhesie während der Bildgebung aufrechtzuerhalten.

Es kann hilfreich sein, die Bildgebungsposition zu standardisieren, indem Sie die Beine in der Nähe der zu fotografierenden Stelle abkleben. Zum Beispiel kann das Abkleben der Hinterbeine in einer ausgestreckten Position verhindern, dass der Knochen der Beine die Sicht auf die injizierten Drüsen behindert. Das Abkleben der Vorderbeine in einer nach oben ausgestreckten Position kann ebenfalls bei der Betrachtung der oberen Drüsen helfen.

Wir haben auch herausgefunden, dass das Abkleben über den Bauch der Maus bei der Verringerung des Atemartefakts für die unteren Drüsen helfen kann. Es gibt viele akzeptable Scanparameter für die Visualisierung des duktalen Baumes. Es sollte immer darauf geachtet werden, dass die strahlende Strahlendosis, die sich aus diesen Scans ergibt, die Strahlungsgrenzwerte für einen bestimmten Mäusestamm nicht überschreitet.

Die Strahlendosierung kann stark reduziert werden, indem die Fluoroskopie betrachtet und der Liefererfolg festgestellt wird, anstatt Bilder mit längeren Belichtungszeiten aufzunehmen. Unsere Standard-Scanparameter sind für die Wiederholungsbildgebung akzeptabel, wenn nur kurze zweiminütige Standardscans erfasst werden. Längere Scans mit höherer Auflösung von bis zu 14 Minuten sind als terminales Verfahren vor der Euthanasie akzeptabel.

Diese längeren Scans sind für Längsschnittstudien nicht akzeptabel, da sie beim Tier eine Strahlenkrankheit verursachen können. Diesem Tier wurde eine Ethanollösung injiziert, die 100 Millimolar Tantaloxidkontrast in den Drüsen vier und neun enthielt. Die aktuelle Erfassung ist ein 14-minütiger hochauflösender Scan der injizierten unteren Drüsen.

Die Fluoroskopie des Tieres ermöglicht es uns, die duktale Baumarchitektur zu sehen, die durch den Kontrast in der Injektionslösung hervorgehoben wird. Das von uns verwendete Mikro-CT-System verfügt über eine integrierte Software, die die Erstellung schneller Wiedergabeversionen ermöglicht, um den Erfolg der Injektion ohne formale Analyse zu bewerten. Diese Funktion verfügt über einen einfachen Kontrastschieberegler, der eine vernünftige Signal-Rausch-Reduzierung ermöglicht.

Die Einschränkung dieser Wiedergabeversionen besteht darin, dass die gleichen Signalschwellenwerte auf das gesamte Bild angewendet werden. Dadurch können helle Signale, die eindeutig nicht Teil des duktalen Baumes sind, wie Eisen in der Nahrung, in der Wiedergabe verbleiben. Bessere formale Wiedergaben können mit einer ausgefeilteren Analysesoftware erstellt werden, die eine Segmentierung des Interessengebiets ermöglicht.

Um das beste Rendering des einzigen duktalen Baumes zu erhalten, empfehlen wir, das Brustfettpolster für die weitere Bildverarbeitung zu segmentieren. Dieser Prozess erfordert eine Linie, die die Grenzen des Fettpolsters über die gesamte Dicke des Tieres verfolgt. Wir haben festgestellt, dass das Verfolgen jeder dritten Schicht und die Ausbreitung des Objekts ausreicht, um die Gesamtheit des Kanals zu erfassen.

Dies kann ein subjektiver Prozess sein, der die Einhaltung von Laborstandards für die Rückverfolgung erfordert, um eine ähnliche Ausgabe aller Personen zu gewährleisten, die Scans analysieren. Vertrautheit mit der Anatomie kann bei der Beurteilung helfen, welche Bereiche einbezogen werden sollen. Nach der Verbreitung von Spuren ist es dann möglich, die Wiedergabe innerhalb eines bestimmten Bereichs so zu quadrieren, dass nur der in der Brustdrüse enthaltene Kontrast angezeigt wird.

Dies sollte die Lösung innerhalb des duktalen Baumes sein, sowie eventuelle Leckagen in unmittelbarer Nähe. Ein Bereich von 300 bis 3.000 HE neigt dazu, bei Tantaloxid-haltigen Lösungen gut zu funktionieren. Ein Beispiel für eine vollständig verarbeitete Wiedergabe kann hier in mehreren Aspekten gesehen werden.

Je nachdem, wie das Tier im Mikro-CT ausgerichtet ist, kann es notwendig sein, DICOM-Dateien in der Analysesoftware neu auszurichten, um eine intuitive anatomische Positionierung mit dem Kopf des Tieres oben im Bild darzustellen. Es kann auch schwierig sein zu bestimmen, welche Drüse betrachtet wird, wenn Sie nicht darauf achten, das Bild jedes Mal auf ähnliche Weise zu drehen. Weitere Messungen wie Volumen oder Länge können durchgeführt werden, sobald Sie eine Rekonstruktion des duktalen Baumes erstellt haben.

Die Validierung für eine erfolgreiche Verabreichung durch dieses Verfahren kann nicht nur durch 3D-Mikro-CT-Wiedergaben, wie hier beschrieben, demonstriert werden, sondern auch durch Dual-Stain-Ganzfassungen mit injiziertem Evans-Blau, das den gesamten duktalen Baum überlappt, der mit Karmin-Alaun hervorgehoben ist. Die konfokale 3D-Mikroskopie kann die Architektur des duktalen Baumes in einer mit E-Cadherin gefärbten Drüse hervorheben. Stamm-zu-Stamm- und Maus-zu-Maus-Variabilität und Brustwarzenanatomie können es mehr oder weniger schwierig machen, Drüsen zu injizieren.

Dies ist ein Beispiel für einen idealen Nippel für die Injektion mit einem hohen Profil für ein einfaches Greifen. Brustwarzen mit niedrigeren Profilen, wie diese, können schwieriger erfolgreich zu kanülieren sein. Diese Unterschiede können es wahrscheinlicher machen, eine erfolgreiche Injektion ohne Trauma oder Doming zu erreichen, wie hier zu sehen, oder eher erfolglos zu sein, wie das gewölbte Aussehen dieser Fettpolsterinjektion zeigt.

Wenn es um die Brustkrebsprävention geht, gibt es derzeit zwei Haupttaktiken, die angewendet werden. Das erste, wachsame Warten, beinhaltet keine wirkliche Intervention. Personen, die diesen Weg verfolgen, werden regelmäßig auf Knoten in ihrem Brustgewebe überwacht, die auf eine Krebsbildung hinweisen würden.

Die Erkennung von Krankheiten würde dann eine Behandlung veranlassen. Die prophylaktische Mastektomie ist ein invasiveres Verfahren, bei dem alle Epithelzellen, aus denen Brustkrebs entstehen kann, zusammen mit dem umgebenden Stroma entfernt werden. Diese Operation kann schwerwiegende Nebenwirkungen haben und wird selten als prophylaktische Option für Personen mit niedrigem oder mäßigem Krankheitsrisiko ausgewählt.

Unser Ansatz beinhaltet die lokale Epithelablation durch Injektion einer ablativen Lösung direkt in den Makmus-Duktalbaum. Diese Methode reduziert Kollateralschäden und wäre wahrscheinlich eine attraktivere Option für Personen, die kein schweres Krankheitsrisiko haben. Die Hinzufügung von Kontrast für die sofortige Bildgebung nach der Injektion macht dies auch leicht auf die Klinik übertragbar.