Name: Messung des Gewebe-Nicht-Häm-Eisengehalts mit einem Bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Lernen Sie die Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in Geweben mit einem kolorimetrischen Bathophenanthrolin-Assay. Diese kostengünstige Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen im Mikroplattenformat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von nationalen Fonds durch FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., im Rahmen des Projekts UIDB/04293/2020 finanziert.

C57BL/6 Mäuse wurden kommerziell gekauft und Hepcidin-Null (Hamp1−/−) Mäuse auf einem C57BL/6 Hintergrund8 waren ein freundliches Geschenk von Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankreich). Die Tiere wurden in der i3S-Tieranlage unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in einer temperatur- und lichtkontrollierten Umgebung untergebracht, mit freiem Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser. Der Europäische Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax) wurde von einer kommerziellen Fischfarm gekauft und in der ICBAS-Tieranlage in einer temperatur- und lichtkontrollierten Umgebung untergebracht und täglich ad libitum mit Standard-Wolfsbarschfutter gefüttert. Alle Verfahren mit Wirbeltieren wurden von der i3S-Tierethikkommission und der nationalen Behörde Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV) genehmigt. Informationen über kommerzielle Reagenzien, Geräte und Tiere sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Lösungsvorbereitung
HINWEIS: Behandeln und bereiten Sie alle Reagenzien und Lösungen mit eisenfreien Glaswaren oder Einwegplastikwaren vor. Lassen Sie metallische Labormaterialien (z. B. Edelstahlspatel) aufgrund des Risikos einer Eisenkontamination nicht mit Reagenzien oder Lösungen in Berührung kommen. Stellen Sie sicher, dass alle wiederverwendbaren Glaswaren eisenfrei sind. Waschen Sie die Materialien mit geeignetem Laborwaschmittel für 30-60 min, spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab, tränken Sie sie über Nacht in einer 37% igen Salpetersäurelösung, die 1:3 mit deionisiertem Wasser verdünnt ist, spülen Sie sie erneut mit deionisiertem Wasser ab und lassen Sie sie trocknen.
<ol><li>Säuremischung: Fügen Sie 10 g Trichloressigsäure zu 82,2 ml 37% Salzsäure in einer Glasflasche hinzu, lösen Sie es gründlich auf und stellen Sie das endgültige Volumen mit entionisiertem Wasser auf 100 ml ein. Vor Gebrauch schütteln. Alternativ können Sie nur 37% Salzsäure für die Gewebeverdauung verwenden. HINWEIS: Die Lösung ist mindestens 2 Monate haltbar, wenn sie in dunkelbraunen Glasreagenzflaschen gelagert wird. ACHTUNG: Salzsäure und Trichloressigsäure sind ätzend und konzentrierte Formen setzen giftige saure Dämpfe frei. Tragen Sie beim Umgang mit Säuren jederzeit Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und Chemikalienspritzschutzbrillen. Vermeiden Sie es, sie einzuatmen und immer mit Säuren umzugehen, während Sie sich unter einem Abzug befinden.</li>
	<li>Gesättigtes Natriumacetat: 228 g wasserfreies Natriumacetat in eine Glasflasche zu 400 ml entionisiertem Wasser geben und über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Lassen Sie die Lösung ruhen und einen Tag lang ausfällen. Wenn kein Niederschlag auftritt, fügen Sie weiterhin kleine Mengen Natriumacetat hinzu. Lagern Sie die Lösung in einer Glasflasche.</li>
	<li>Chromogen-Reagenz: Zur Herstellung von 1 ml chromogenem Reagenz 1 mg 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrilines Disulfonsäure-Dinatriumsalz zu 500 μL deionisiertem Wasser und 10 μL konzentrierter (100%) Thioglykolsäure und gründlich auflösen. Machen Sie das endgültige Volumen auf 1 ml mit deionisiertem Wasser aus. HINWEIS: Bereiten Sie so viel Chromogenreagenz wie nötig vor. Die Lösung ist 1 Monat lang stabil, wenn sie vor Licht geschützt ist.</li>
	<li>Working Chromogen Reagent (WCR): Fügen Sie 1 Volumen des Chromogenreagenzes zu 5 Volumen gesättigtem Natriumacetat und 5 Volumen deionisiertem Wasser hinzu. HINWEIS: Diese Lösung sollte am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Stamm-Eisen-Standardlösung: Um eine 20 mM Stammeisenlösung herzustellen, geben Sie 111,5 mg Carbonyleisenpulver in einen 250-ml-Messkolben, der 5.480 μL 37% Salzsäure enthält. Über Nacht bei Raumtemperatur auflösen lassen (oder in einem kochenden Wasserbad inkubieren). Dann machen Sie die Lösung zu einem endgültigen Volumen von 100 ml mit deionisiertem Wasser. HINWEIS: Die Standardlösung kann auf unbestimmte Zeit aufbewahrt werden, wenn sie in einem dicht verschlossenen Behälter gelagert wird.</li>
	<li>Working Iron Standard Solution (WISS): 13,5 μL 37% Salzsäure zu 500 μL deionisiertem Wasser hinzufügen. 10 μL der Stammeisen-Standardlösung zugeben und das Endvolumen mit deionisiertem Wasser auf 1 ml auffüllen (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; gemessen durch AAS). HINWEIS: Die Arbeitslösung sollte am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden.</li>
</ol>2. Probentrocknung
<ol><li>Schneiden Sie eine Gewebeprobe mit einem Gewicht von 10-100 mg mit einer Skalpellklinge. Wiegen Sie es genau in einer analytischen / Präzisionswaage über einem kleinen Stück Parafilm (Fresh Weight).</li>
	<li>Legen Sie das Gewebestück mit einer Kunststoffpinzette in eine 24-Well-Platte (unbedeckt, um eine Wasserverdunstung zu ermöglichen) und lassen Sie es auf einem Standard-Inkubator bei 65 ° C für 48 h trocknen.</li>
	<li>Alternativ können Sie einen Mikrowellen-Aufschlussofen im Labor zum Trocknen von Gewebeproben verwenden. Legen Sie das gewogene Stück Gewebe mit einer Plastikpinzette in einen eisenfreien Teflonbecher und trocknen Sie es in der Mikrowelle. Stellen Sie die Betriebsparameter gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts ein. HINWEIS: Als Referenz sind die Betriebsparameter für die Trocknung von Leberproben mit dem spezifischen Faulofen (siehe Materialtabelle) in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
	<li>Legen Sie mit einer Kunststoffpinzette jedes getrocknete Stück Gewebe über ein kleines Stück Parafilm in einer Analyse- / Präzisionswaage und wiegen Sie es genau (Trockengewicht).</li>
</ol>3. Probe saurer Aufschluss
<ol><li>Übertragen Sie jedes getrocknete Gewebestück mit einer Kunststoffpinzette in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml der Säuremischung hinzu und schließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie einen sauren Rohling auf die gleiche Weise vor, außer dass das Gewebe weggelassen wird. VORSICHT: Das Säuregemisch ist ätzend und setzt giftige Dämpfe frei. Tragen Sie beim Umgang mit der Säuremischung Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und eine chemische Spritzschutzbrille. Vermeiden Sie es, es einzuatmen und behandeln Sie es immer unter einem Abzug.</li>
	<li>Verdauen Sie das Gewebe, indem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Inkubator bei 65 °C für 20 h inkubieren.</li>
	<li>Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 500 μL des klaren (gelben) Säureextrakts (Überstand) mit einer mit Kunststoffspitzen versehenen Mikropipette in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Wenn es nicht möglich ist, einen klaren Überstand zu erhalten, führen Sie einen kurzen Zentrifugationsspin durch. ACHTUNG: Der Überstand ist stark sauer. Tragen Sie beim Umgang mit den Überständen Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und Chemikalienspritzschutzbrillen. Behandeln Sie sie immer unter einem Abzug. HINWEIS: An dieser Stelle können die Säureextrakte sofort für den kolorimetrischen Assay verwendet oder bei -20 °C für die spätere Verwendung eingefroren werden. Tauen Sie gefrorene Proben vollständig auf Raumtemperatur auf und wirbeln Sie sie vor der Verwendung ein.</li>
</ol>4. Farbentwicklung
<ol><li>Chromogenreaktionen gemäß Tabelle 2 in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen oder, für höheren Durchsatz, direkt in den flachen Boden, 96-Well, klare, unbehandelte Polystyrol-Mikrotiterplatten vorbereiten. Bereiten Sie alle Reaktionen (Säurerohling, Standard und Probe) mindestens doppelt vor.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.</li>
</ol>5. Absorptionsmessung
<ol><li>Messen Sie die Probenabsorption in einem Spektralphotometer oder Plattenleser bei einer Wellenlänge von 535 nm gegen eine deionisierte Wasserreferenz. Platten können unbedeckt oder deckelfrei gelesen werden. Entfernen Sie im Deckelgehäuse jegliche Kondensation, die sich aufgrund der Freisetzung von Säuredämpfen aus dem Deckel kurz vor der Messung gebildet hat, um mögliche Interferenzen mit dem Absorptionswert zu vermeiden. HINWEIS: Die optische Absorption des Säurerohlings gegen deionisiertes Wasser (Referenz) sollte kleiner als 0,015 sein; Die optische Absorption des Standards und der Proben sollte zwischen 0,100 und 1,000 liegen. Bei Proben mit sehr hohem oder sehr niedrigem Eisengehalt müssen die Volumina von Säureextrakt (Überstand) und diH2O möglicherweise angepasst werden (Tabelle 2): Wenn die Absorption größer als 1,0 ist, verwenden Sie ein kleineres Probenvolumen (Überstand); Wenn die Absorption niedriger als 0,1 ist, verwenden Sie ein höheres Volumen des Überstands. Das Probenvolumen (Vsmp) wird bei der Berechnung des Eisengehalts des Gewebes jeder Probe berücksichtigt (siehe Schritt 6).</li>
</ol>6. Berechnung des Gewebeeisengehalts
<ol><li>Berechnen Sie den Eisengehalt an Nicht-Häm-Gewebe mit der folgenden Gleichung: Gewebeeisen (μg/g Trockengewebe) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63469/63469eq01v2.jpg"> AT = Absorption der Probe AB = Absorption von saurem Rohling AS = Absorption des Standards Fes = Eisenkonzentration von WISS (μg Fe/ml) W = Gewicht des Trockengewebes (g) Vsmp = Probenvolumen (variables Volumen des Überstands in Tabelle 2 umgerechnet in ml) Vf = Endvolumen der Säuremischung nach Inkubation über Nacht bei 65 °C (entspricht dem Säurevolumen plus Trockengewebevolumen in ml; wenn sich die Probengewichte nicht wesentlich unterscheiden, nehmen Sie ein konstantes Volumen ≈ 1 ml an) Vstd = Eisenstandardvolumen (WISS-Volumen in Tabelle 2 umgerechnet in ml) Vrv = Endreaktionsvolumen (Gesamtvolumen in Tabelle 2 umgerechnet in ml)</li>
</ol>

<ol><li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+carpet+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li>
<li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+and+anemia%3A+A+tight+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).</li>
<li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anemia+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li>
<li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+homeostasis%3A+Lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).</li>
<li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li>
<li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorrence%2C+JD+%22Methods+in+Haematology%22">Methods in Haematology</a>. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).</li>
<li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li>
<li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li>
<li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297(2010).</li>
<li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li>
<li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li>
<li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischen Geweben wird unter Verwendung einer Anpassung des ursprünglich von Torrance und Bothwell beschriebenen bathophenanthrolinbasierten kolorimetrischen Assays bereitgestellt5,6. Die kritischen Schritte der Methode sind die Trocknung von Gewebeproben; Proteindenaturierung und Freisetzung von anorganischem Eisen durch saure Hydrolyse; Reduktion von Eisen (Fe3+) Eisen in den Eisenzustand (<sup...

Eisen ist ein essentieller Mikronährstoff, der für die Funktion von Proteinen benötigt wird, die an entscheidenden biologischen Prozessen wie Sauerstofftransport, Energieproduktion oder DNA-Synthese beteiligt sind. Wichtig ist, dass sowohl Eisenüberschuss als auch Eisenmangel für die menschliche Gesundheit sehr schädlich sind und der Eisenspiegel im Gewebe fein reguliert ist. Abnorme Eisenaufnahme in der Nahrung, Eisenmangel, wiederholte Bluttransfusionen und chronische Entzündungen sind häufige Ursachen für Eisen-assoziierte Erkrankungen, von denen Milliarden von Menschen weltweit betroffen sind1,2,3.
Experimentelle Tiermodelle der Eisenüberladung oder -mangel waren maßgeblich daran beteiligt, unser Wissen über die Mechanismen der systemischen und zellulären Regulation der Eisenhomöostase zu erweitern4. Trotz der erheblichen Fortschritte, die in den letzten zwei Jahrzehnten erzielt wurden, sind viele wichtige Aspekte nach wie vor schwer fassbar. In den kommenden Jahren wird die genaue Messung des Gesamteisgehalts in tierischen Geweben ein entscheidender Schritt bleiben, um die Forschung auf dem Gebiet der Eisenbiologie voranzutreiben.
Die meisten Labore quantifizieren Gewebeeisen entweder mit Atomabsorptionsspektroskopie (AAS), Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) oder einem kolorimetrischen Assay, der auf der Reaktion von Nicht-Häm-Eisen mit einem Bathophenanthrolin-Reagenz basiert. Letzteres basiert auf der ursprünglichen Methode, die Torrance und Bothwell vor über 50 Jahren beschrieben haben5,6. Während später eine Variation dieser Methode entwickelt wurde, bei der Ferrozin als Alternative zu Bathophenanthrolin7 verwendet wurde, bleibt letzteres das am häufigsten zitierte chromogene Reagenz in der Literatur.
Die Methode der Wahl hängt oft vom verfügbaren Fachwissen und der Infrastruktur ab. Während AAS und ICP-MS empfindlicher sind, bleibt der kolorimetrische Assay weit verbreitet, da er die folgenden wichtigen Vorteile bietet: i) es schließt den Beitrag von Häm-Eisen aus, das aus Hämoglobin gewonnen wird, das in roten Blutkörperchen enthalten ist; ii) es erfordert keine ausgefeilten analytischen Fähigkeiten oder sehr teure Ausrüstung; und iii) der ursprüngliche Küvetten-basierte Assay kann an ein Mikroplattenformat angepasst werden, was einen höheren Probendurchsatz ermöglicht. Der kolorimetrische Ansatz, der in dieser Arbeit vorgestellt wird, wird routinemäßig verwendet, um Veränderungen des Gewebe-Nicht-Häm-Eisenspiegels in einer Vielzahl von experimentellen Tiermodellen von Eisenüberladung oder Eisenmangel, von Nagetieren bis hin zu Fischen und Fruchtfliegen, zu quantifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischem Gewebe bereitgestellt, wobei ein einfacher, gut etablierter, kolorimetrischer Assay verwendet wird, den die meisten Laboratorien leicht implementieren sollten.

<table><tbody><tr><td>96 Well UV-transparente Platte</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Kern</td><td>ABJ 220-4M</td><td></td></tr><tr><td>Wasserfreies Natriumacetat</td><td>Merck</td><td>106268</td><td></td></tr><tr><td>Bathophenanthrolinsulfonat, (4,7-Diphenyl-1,10-phenantrolindissulfonsäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1375</td><td></td></tr>, <tr><td>C57BL/6 Mäuse (Mus musculus)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonyleisenpulver, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Einwegküvetten aus Polymethylmethacrylat (PMMA)</td><td>VWR</td><td>634-0678P</td><td></td></tr><tr><td>Doppelt destilliertes, steriles Wasser</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek Instruments</td><td>FLx800</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellen-Aufschlussherd und weiße Teflonbecher</td><td>CEM</td><td>MDS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Salpetersäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>15687290</td><td></td></tr><tr><td>Oven Binder</td><td></td><td>ED115</td><td></td></tr><tr><td>Nagetierfutter</td><td>Harlan Laboratories</td><td>2014S</td><td>Teklad Global 14% Protein Nagetiererhaltungsfutter mit 175 mg/kg Eisen</td></tr><tr><td>Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax)</td><td>Sonrionansa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wolfsbarschfutter</td><td>Skretting</td><td>L-2 Alterna 1P</td><td></td></tr><tr><td>Einstrahl-UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>Shimadzu</td><td>UV mini 1240</td><td></td></tr><tr><td>Thioglykolsäure</td><td>Merck</td><td>100700</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>Merck</td><td>100807</td><td></td></tr></tbody></table>

messung des gewebe-nicht-häm-eisengehalts mit einem bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen assay

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Eisen ist ein essentieller Mikronährstoff. Sowohl Eisenüberladung als auch -mangel sind für den Menschen sehr schädlich, und der Eisenspiegel im Gewebe ist fein reguliert. Die Verwendung experimenteller Tiermodelle für Eisenüberladung oder -mangel war hilfreich, um das Wissen über die Mechanismen zu erweitern, die an der systemischen und zellulären Regulation der Eisenhomöostase beteiligt sind. Die Messung des Gesamteisengehalts in tierischen Geweben wird üblicherweise mit Atomabsorptionsspektroskopie oder mit einem kolorimetrischen Assay durchgeführt, der auf der Reaktion von Nicht-Häm-Eisen mit einem Bathophenanthrolin-Reagenz basiert. Seit vielen Jahren wird der kolorimetrische Assay zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in einer Vielzahl von tierischen Geweben eingesetzt. Im Gegensatz zur Atomabsorptionsspektroskopie schließt es den Beitrag von Häm-Eisen aus, das aus Hämoglobin gewonnen wird, das in roten Blutkörperchen enthalten ist. Darüber hinaus erfordert es keine ausgefeilten analytischen Fähigkeiten oder sehr teure Ausrüstung und kann daher in den meisten Labors leicht implementiert werden. Schließlich kann der kolorimetrische Assay entweder küvettenbasiert oder an ein Mikroplattenformat angepasst sein, was einen höheren Probendurchsatz ermöglicht. Die vorliegende Arbeit liefert ein gut etabliertes Protokoll, das für den Nachweis von Veränderungen des Eisengehalts im Gewebe in einer Vielzahl von experimentellen Tiermodellen von Eisenüberladung oder Eisenmangel geeignet ist.

Vergleich von Küvette zu 96-Well-Mikrotiterplatten Die Messung von Gewebe-Nicht-Häm-Eisen durch Reaktion mit einem ursprünglich von Torrance und Bothwell5,6 beschriebenen Bathophenanthrol-Reagenz beruht auf der Verwendung eines Spektralphotometers zur Absorptionsmessung. Daher sind die in der Chromogenreaktion verwendeten Volumina mit der Größe einer normalen Spektralphotometerküvette kompatibel. Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methoden...

Hier wird ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischen Geweben bereitgestellt, wobei ein einfacher, gut etablierter kolorimetrischer Assay verwendet wird, der in den meisten Labors leicht implementiert werden kann.

Messung des Gewebe-Nicht-Häm-Eisengehalts mit einem Bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Hier haben wir ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Gehalts in tierischen Geweben bereitgestellt. Mit einem einfachen, gut etablierten kolorimetrischen Assay, der in den meisten Labors leicht implementiert werden kann. Der Bathophenanthrolin-basierte kolorimetrische Assay erfordert keine ausgefeilten Fähigkeiten oder sehr teure Ausrüstung und kann für einen höheren Probendurchsatz und eine höhere Kosteneffizienz an das Mikrotiterplattenformat angepasst werden.Dieses Protokoll eignet sich zum Nachweis von Veränderungen des Eisengehalts im Gewebe in einer Vielzahl von experimentellen Tiermodellen von Eisenüberladungen oder Eiseneffizienz. Beginnen Sie mit dem Schneiden einer Gewebeprobe mit einem Gewicht von 10 bis 100 Gramm mit einer Skalpellklinge. Wiegen Sie es genau in einer Analysenwaage über ein kleines Stück Parafilm.Verwenden Sie eine Kunststoffpinzette, um das Stück Gewebe in eine 24-Well-Platte zu legen. Lassen Sie es auf einem Standard-Inkubator bei 65 Grad Celsius für 48 Stunden trocknen. Alternativ können Sie das Stück Gewebe mit einer Stockpinzette in einen eisenfreien Teflonbecher geben und im Mikrowellen-Fermentationsofen des Labors trocknen.Legen Sie jedes getrocknete Stück Gewebe über ein kleines Stück Paraform in einer Analysenwaage und wiegen Sie es genau. Geben Sie jedes getrocknete Stück Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie einen Liter der Säuremischung in das Röhrchen hinzu und schließen Sie es.Bereiten Sie einen sauren Rohling auf die gleiche Weise vor, außer dass das Gewebe hier weggelassen wird. Inkubieren Sie die Röhren bei 65 Grad Celsius für 20 Stunden, um das Gewebe zu verdauen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur gelangen mit einer mit Kunststoffspitzen versehenen Mikropipette 500 Mikroliter des klaren Säureextrakts in ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen.Bereiten Sie Chromogenreaktionen direkt in die flachen 96-Well-, klaren, unbehandelten Polystyrol-Mikroplatten vor. Inkubierte Raumtemperatur für 15 Minuten. Messen Sie die Probenabsorption in einem Plattenleser bei einer Wellenlänge von 535 Nanometern gegen eine deionisierte Wasserreferenz.Die Bestimmung von Nicht-Häm-Eisen durch die Küvette und 96-Well-Mikrotiterplatten-basierte kolorimetrische Assays sind hier dargestellt. Die Korrelation zwischen küvettenbasierten und Mikroplatten-basierten Nicht-Häm-Eisenspiegeln in 55 Gewebeproben von sechs Monate alten männlichen Schwarzen, sechs Mäusen, einschließlich Leber, Milz, Herz, Lunge und Knochenmark, ist hier gezeigt. Die hohe Korrelation zwischen den beiden Methoden deutet darauf hin, dass die Mikroplatten-basierte Methode eine gültige Alternative zur ursprünglichen Küvetten-basierten Methode ist.Schließlich wurden die Nicht-Häm-Eisengehalte mit der auf Mikroplatten basierenden Methode quantifiziert, nachdem saure Proben aus denselben Geweben entweder mit einer Mischung aus Salzsäure und Trichloressigsäure oder Salzsäure allein verdaut wurden. Die hohe Korrelation zeigt, dass Trichloressigsäure aus dem Säureaufschluss abgegeben werden kann. Das repräsentative Bild zeigt die Nicht-Häm-Eisenspiegel in Leber, Milz, Herz und Bauchspeicheldrüse von männlichen schwarzen sechs Wildtypmäusen und männlichen Hepcidin-Knockout-Mäusen auf schwarzem Sechs-genetischem Hintergrund, gemessen mit Bathophenanthrolin-basiertem kolorimetrischem Assay.Die Störung von Hepcidin führt zu einer Hämochromatose wie Eisenabscheidung Phänotyp mit schwerer hepatischer, pankreatischer und kardialer Eisenakkumulation und Milzeisenmangel. Hepatische Nicht-Häm-Eisenwerte in juvenilen weiblichen europäischen Wolfsbarschen nach experimenteller Eisenmodulation sind hier dargestellt. Der Eisengehalt der Leber stieg bei eisenbehandelten Tieren massiv an.Während Anämie eine leichte Verringerung der Lebereisenspeicher verursachte. Die repräsentativen Bilder zeigen die Nicht-Häm-Eisenspiegel bei einem Monat alten Drosophila, gemessen mit einem Bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay. Die Ergebnisse zeigen den Nicht-Häm-Eisengehalt in jedem Pool von 20 Fliegen oder den geschätzten Eisengehalt jeder Fliege.Betrachtet man ein Durchschnittsgewicht von 0,64 Milligramm pro Fliege. Denken Sie bei diesem Vorgang daran, den gesamten Glasverschleiß gründlich zu reinigen und die metallischen Labormaterialien aufgrund des Risikos einer Kontamination nicht mit einem Reagenz oder einer Lösung in Berührung kommen zu lassen.

measurement-tissue-non-heme-iron-content-using-bathophenanthroline

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video beschreiben wir eine kolorimetrische Methode zur Bestimmung des Nicht-Häm-Eisengehalts in Lebergewebe von Mäusen. Als chromogenes Substrat wird Bathophenanthrolinsulfonat in Gegenwart eines Reduktionsmittels verwendet, das Eisen(III)-Eisen in chelatables Eisen umwandelt.

Kolorimetrischer Assay auf Bathophenanthrolinsulfonat-Basis: eine einfache und schnelle Methode zur Quantifizierung von Nicht-Häm-Eisen in Lebergewebe von Mäusen

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Beurteilung der Bioverfügbarkeit von Eisen in komplexen Nahrungsquellen. Die Technik kombiniert die Simulation der menschlichen Verdauung mit der Eisenaufnahme durch differenzierte Caco-2-Zellen. Die intrazelluläre Ferritinbildung fungiert als Marker für die zelluläre Eisenaufnahme.

Caco-2 Cell Bioassay: Eine In-vitro-Methode zur Messung der Bioverfügbarkeit von Eisen in komplexen Nahrungsquellen

Veränderte intrazelluläre Häm-Spiegel werden mit häufigen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht. Daher besteht die Notwendigkeit, die Häm-Biosynthese in verschiedenen Zellen zu messen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle und empfindliche Methode zur Messung und zum Vergleich des Niveaus der Häm-Synthese in verschiedenen Zellen bereitzustellen.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Wir präsentieren Ihnen ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zur Messung der Eisengehalt im Pflanzengewebe mit der kolorimetrischen Preußischblau-Methode.

Ein kolorimetrischen Verfahren zur Messung der Eisengehalt in Pflanzen

Wir präsentieren einen Test zur einfachen Quantifizierung von Metallen, die in Proben eingeführt werden, die mit der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie hergestellt werden. Das Verfahren verwendet Hydroxynaphtholblau als farbmetrischemetallanzeige und ein UV-Vis Spektralphotometer als Detektor.

Quantifizierung der Metallauslaugung in der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie

Diese Eisen-Redox-Speziation methode basiert auf kapillarer Elektrophorese-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie mit Probenstapelung kombiniert mit kurzer Analyse in einem Durchlauf. Die Methode analysiert schnell und bietet niedrige Quantifizierungsgrenzen für Eisen-Redox-Arten in einer Vielzahl von Geweben und Biofluidproben.

Aufbau der Kapillarelektrophorese-Induktiv gekoppelte Plasmamassenspektrometrie (CE-ICP-MS) zur Quantifizierung von Eisenredoxarten (Fe(II), Fe(III))

Dieser Artikel zeigt, wie transferringebundenes nichtradioaktives Isotopeneisen für Studien zum Eisentransport in der Mausschwangerschaft vorbereitet und verabreicht wird. Der Ansatz zur Quantifizierung von isotopischem Eisen in fetoplazentaren Kompartimenten wird ebenfalls beschrieben.

Quantifizierung des Eisentransports über die Mausplazenta in vivo unter Verwendung nichtradioaktiver Eisenisotope

Der Caco-2-Zell-Bioassay für die Bioverfügbarkeit von Eisen (Fe) stellt einen kostengünstigen und vielseitigen Ansatz zur Beurteilung der Fe-Bioverfügbarkeit von Lebensmitteln, Lebensmittelprodukten, Nahrungsergänzungsmitteln, Mahlzeiten und sogar Diäten dar. Es wurde gründlich für Humanstudien validiert und stellt den Stand der Technik für Studien zur Fe-Bioverfügbarkeit dar.

Der Caco-2-Zell-Bioassay zur Messung der Eisenbioverfügbarkeit von Lebensmitteln

Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Assay, der schnell und kostengünstig die Fähigkeit neuartiger Verbindungen bestätigen kann, Eisen zu chelatisieren. Der Assay misst die Fähigkeit von Verbindungen, die Eisenbindungsaktivität der schwachen Eisenchelat-Fluoreszenzsonde Calcein zu übertreffen, was zu einem quantifizierbaren Anstieg der Fluoreszenz führt, wenn eine Chelatbildung auftritt.

Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren 

Dieses Protokoll stellt Methoden zur Beurteilung der Verteilung und Menge der Eisenablagerung in Geweben, insbesondere im Gehirn, vor. Das Protokoll beschreibt die Verfahren für die Probenvorbereitung, die Perls/DAB-Färbung, die Bildaufnahme und die Datenanalyse.

Beurteilung der Eisenablagerung im Gehirn von 5xFAD-Mäusen durch Perls'/DAB-Färbung

In dieser Arbeit wurde das Protokoll für das Design und die Entwicklung eines E-Eye-Enable-POCT-Geräts zum Nachweis von Fe, Cr, As und F in Umweltproben, biologischen Proben sowie Lebensmitteln und Getränken diskutiert. Fast 2000 Proben wurden getestet, und die Ergebnisse stimmen mit der Goldstandard-Technik überein.

TD-DFT-geführte, fortschrittliche E-Eye-Sensing-Technik für die Vor-Ort-Quantifizierung von Fe, Cr, F und As in Umwelt-, Bio- und Lebensmittelproben

Lernen Sie die Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in Geweben mit einem kolorimetrischen Bathophenanthrolin-Assay. Diese kostengünstige Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen im Mikroplattenformat.

Messung des Gewebe-Nicht-Häm-Eisengehalts mit einem Bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay

Weitere Videos entdecken