Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna

Dieses Protokoll beschreibt, wie filamentöses Cyanobakterium, das zu Oszillatorien gehört, durch natürliche Umwandlung umgewandelt werden kann. Es zeigt auch, wie verschiedene Arten von Bewegung untersucht werden können. Natürliche Transformation ist die einfachste Transformationstechnik, wenn sie funktioniert.

Es werden nur DNA, Zellen und Wachstumsmedium benötigt. Bisher konnte kein anderes oscillatoriales Mitglied durch natürliche Transformation transformiert werden. Wir hoffen, dass unsere Studien andere Gruppen dazu anregen, andere Oszillatorien auszuprobieren.

Für die Transformation machen Sie eine gute, gesund aussehende Kultur und eine gute DNA-Vorbereitung. Verwenden Sie für Bewegungsstudien immer eine ultraschallbehandelte Kultur. Die Behandlung sollte frisch sein.

Das Verfahren wird Nora Weber, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Beimpfung von 50 Millilitern flüssigem F2-Medium in jeden der beiden 250-Milliliter-Flaschen mit einem Milliliter P.lacuna-Filamenten aus einer Laufkultur. In weißem Licht unter Bewegung für etwa fünf Tage bei 25 Grad Celsius kultivieren.

Nach fünf Tagen 100 Milliliter P.lacuna-Zellsuspension bei 10.000 U/min für drei Minuten homogenisieren und die optische Dichte bei 750 Nanometern messen. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 15 Minuten bei 6.000 mal G.Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 800 Mikrolitern der verbleibenden Flüssigkeit und zusätzlichem F2 + -Medium. Nehmen Sie acht F2 + Bacto-Agarplatten mit 120 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und pipettieren Sie 10 Mikrogramm DNA in die Mitte jeder Agarplatte.

Pipettieren Sie sofort 100 Mikroliter der Zellsuspension auf die DNA. Bewahren Sie die Agarplatte ohne Deckel auf der sauberen Bank auf, damit die überschüssige Flüssigkeit verdunsten kann. Schließen Sie den Teller und kultivieren Sie ihn zwei Tage lang in weißem Licht bei 25 Grad Celsius.

Nach zwei Tagen verteilen Sie die Filamente jeder Agarplatte auf mehrere frische F2 + Bacto-Agarplatten, die 120 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin mit einer Impfschleife enthalten. Kultivieren Sie die Platten in weißem Licht bei 25 Grad Celsius und überprüfen Sie die Kulturen regelmäßig unter dem Mikroskop. Identifizieren Sie nach 14 bis 28 Tagen die toten bräunlichen Filamente und suchen Sie unter dem Mikroskop nach transformierten Filamenten.

Die transformierten Filamente sehen gesund und grün aus und unterscheiden sich von der Masse der Filamente. Übertragen Sie jedes einzelne transformierte Filament in 50-Milliliter-Flaschen mit 10 Millilitern F2 + Medium mit 250 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin. In weißem Licht bei 25 Grad Celsius auf einem Shaker kultivieren und das Wachstum bis zu vier Wochen beobachten.

Übertragen Sie die Filamente zurück in das Agarmedium, das 250 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin enthält, und warten Sie, bis die Filamente wachsen. Erhöhen Sie dann die Kanamycinkonzentration erneut, um die Segregation zu beschleunigen. Für die GFP-Expression werden einzelne Filamente mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 40-facher oder 63-facher Vergrößerung beobachtet und ein Hellfeld-Transmissionsbild und ein Fluoreszenzbild aufgenommen.

Kultivieren Sie P.lacuna in F2-Medium unter 50 U / min horizontaler Bewegung in weißem Licht für etwa fünf Tage, bis die geschätzte optische Dichte bei 750 Nanometern 0,35 beträgt. Lagern Sie die Probe bei vier Grad Celsius. Homogenisieren Sie die Filamente mit Ultraschall für eine Minute bei maximaler Leistung und Zyklus von einem.

Messen Sie die optische Dichte bei 750 Nanometern und übertragen Sie acht Milliliter des Mediums, das P.lacuna enthält, in eine sechs Zentimeter große Petrischale. Warten Sie einige Minuten, bis die Probe Raumtemperatur erreicht hat und bedecken Sie dann die Petrischale mit Zellophanfolie. Legen Sie einen Objektträger auf den X-Y-Tisch eines Standardmikroskops mit einer Kamera.

Schalten Sie das Mikroskoplicht ein und bewegen Sie ein 4X- oder 10X-Objektiv in den Weg des Lichts. Legen Sie dann die Petrischale auf die Rutsche. Passen Sie einzelne Filamente oder Filamentbündel durch die X-, Y- und Z-Bewegungen des Tisches an.

Beobachten Sie die Bewegungen einzelner Filamente oder Bündel und zeichnen Sie die Bewegungen mit einer Standard-Mikroskopkamera auf. Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse die Flüssigkeit nicht berührt. Pipettieren Sie 0,5 Milliliter einer Lösung, die P.lacuna enthält, auf der Bacto-Agar-Oberfläche einer sechs Zentimeter großen Petrischale.

Lassen Sie die Flüssigkeit in die Oberfläche eindringen. Schließen Sie nach etwa 20 Minuten die Petrischale und beobachten Sie die Bewegung der Filamente auf der Oberfläche mit einem 4X- oder 10X-Objektiv. Erfassen Sie die Zeitrafferaufnahmen mit einer Okularkamera und einem Minicomputersystem.

Die Filamente müssen zuerst mit dem Auge und dann durch die Augenkamera fokussiert werden. Stellen Sie sicher, dass das Zeitintervall zwischen den nachfolgenden Bildern fünf Sekunden bis eine Minute beträgt. Programmieren Sie das Linux-Skript des Minicomputers, um die Zeitrafferaufzeichnung zu steuern.

Bereiten Sie LED-Halter vor, an denen die Fünf-Millimeter-LEDs montiert sind, um eine Fläche von 20 Millimetern im Quadrat von unten nach oben zu bestrahlen. Messen und justieren Sie die LED-Intensitäten. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Umgebung in einem dunklen Raum oder einem geschlossenen, dunklen Behälter befindet.

Legen Sie acht Milliliter des Mediums, das P.lacuna enthält, in eine sechs Zentimeter große Petrischale, schließen Sie die Petrischale mit dem Deckel und legen Sie sie auf eine LED-Halterung, so dass sich die LED in der Mitte der Petrischale befindet. Nehmen Sie nach typischerweise zwei Tagen ein Bild der Petrischale mit einer Smartphone-Kamera auf, die direkt auf die Position der Lichtbehandlung gerichtet ist. Verwenden Sie eine Halterung und ein weißes Blatt als Hintergrund, um für jedes Bild den gleichen Abstand und die gleichen Lichtverhältnisse zu gewährleisten.

Öffnen Sie die ImageJ-Software, klicken Sie auf Datei, Öffnen und wählen Sie die Datei aus. Klicken Sie dann auf Enter. Wählen Sie die gerade Taste und drücken Sie die linke Maustaste, um eine Linie von einem Ende der Petrischale zum gegenüberliegenden Ende zu zeichnen.

Stellen Sie sicher, dass die Leitung durch die Mitte des Kreises der Filamente verläuft. Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um die Länge der Petrischale anzuzeigen. Klicken Sie dann im Menü ImageJ auf Analyze and Plot Profile.

Schätzen Sie einen Durchschnittswert für die Pixelintensität außerhalb des Kreises und einen weiteren Durchschnittswert für die Pixelintensität innerhalb des Kreises. Zeigen Sie mit der Maus auf die Y-Position zwischen diesen Werten, um die X-Werte beider Seiten des Kreises zu schätzen. Notieren Sie sich beide Werte und berechnen Sie die Differenz.

Wählen Sie dann die gerade Schaltfläche und zeichnen Sie eine Linie im mittleren bis maximalen Wert der Pixelintensität. Klicken Sie abschließend auf Analysieren und dann auf Messen, um die Länge des inneren Zellkreises abzurufen. Die Integration und Trennung von Insert nach der Transformation von P.lacuna mit PAK1 ist hier dargestellt.

Ein PCR-Test mit äußeren Primern etwa eine Woche nach der Transformation hat typischerweise zwei Banden auf dem Elektrophoresegel, eine mit der Größe des Wildtypbandes und ein langsameres Migrationsband, das das Einsetzen der Widerstandskassette anzeigt. Hier stellen die Bahnen 1 bis 4 PCR-Produkte von Filamenten nach sieben Tagen, 11 Tagen, 14 Tagen und 17 Tagen der Isolierung eines resistenten Filaments dar, und Lane 5 repräsentiert PCR-Produkt des Wildtyps. In der siebentägigen Probe ist der Einsatz in einem kleinen Bruchteil der Chromosomen vorhanden.

Dieser Anteil erhöht sich bis zu 17 Tagen, wo kein Wildtypband sichtbar ist; das heißt, die Segregation ist vollständig. Dieses Bild stellt den Vektor pMH1 für die sfGHP-Expression unter der Kontrolle des endogenen Phycocyanin-Beta-Promotors dar. P.lacuna homologe Sequenz, pUC19-Vektor-Backbone und Insert mit sfGFP- und Kanamycin-Resistenz sind hier dargestellt.

In pMH1 wird das sfGHP-Gen drei Primzahlen des Phycocyanin-Beta-Gens platziert; daher wird es vom endogenen cpc-Beta-Promotor angetrieben. Fluoreszenzbilder von P.lacuna-Wildtyp-Filamenten und nach Transformation mit PAK1, PAK2, PAK3 und pMH1 sind hier gezeigt. Der Ausdruck von sfGFP wird vom cpc 560-Promotor, dem a2813-Promotor, dem psbA2S-Promotor oder dem endogenen cpc-Beta-Promotor gesteuert.

Die hier vorgestellten zusammengeführten Bilder zeigen die Motilität von Phormidium lacuna. Die Bewegung auf der Agaroberfläche wird hier gezeigt. Das Zeitintervall betrug eine Minute.

Die Bewegung im flüssigen Medium wird hier dargestellt. Das Zeitintervall betrug 10 Sekunden. Natürliche Transformation ist eine einfache Methode.

Mischen Sie einfach Plasmid-DNA mit einer Resistenzkassette in homologen Sequenzen mit den Zellen und lassen Sie die Zellen auf einem Medium mit Antibiotika wachsen. Gene können inaktiviert und Proteine überexprimiert werden. Dies ist wichtig für jede Grundlagenforschung und für biotechnische Studien.

In einzelligen Cyanobakterien, bei denen auch die natürliche Transformation festgestellt wird, wurden molekulare Studien zur Photosynthese oder zu Photorezeptoren usw. durchgeführt.