Schneiden des embryonalen Hühnerhirnstamms zur Bewertung tonotopischer Gradienten und Mikroschaltkreise
12. Juli 2022
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Gewinnung nicht-koronaler auditorischer Hirnstammschnitte des Hühnerembryos zur Untersuchung von tonotopischen Eigenschaften und Entwicklungsverläufen innerhalb einer Hirnstammscheibe. Diese Schnitte umfassen sagittale, horizontale und horizontale / transversale Abschnitte, die größere tonotopische Regionen innerhalb einer einzelnen Schichtebene umfassen als die traditionellen koronalen Abschnitte.
Diese Methode erwirbt lebende Scheiben des Hörhirnstamms des Huhns, der einen größeren Gradienten der Frequenzregion in derselben Scheibe umfasst. Diese Scheiben eignen sich für elektrophysiologische und anatomische Experimente mit einer größeren tonotopischen Achse. Diese Methodik wird helfen, die Entwicklung von Mikroschaltkreisen im auditorischen Hirnstamm zu verstehen.
Während die Anatomie spezifisch für das Huhn ist, haben andere Vogelarten wie Wachteln und Singvögel eine ähnliche Anatomie. Um zu beginnen, sterilisieren Sie die Eier mit 70% Ethanol und inkubieren Sie sie bei 38 Grad Celsius und 50% Feuchtigkeit. Als nächstes stellen Sie die Sprudelrate für den ACSF so ein, dass der pH-Wert 7,2 bis 7,4 mit einer Osmolalität zwischen 300 und 310 Milliosmolar pro Liter beträgt.
Dann mischen Sie fünf Gramm Agarose in 100 Milliliter dACSF. Lösen Sie die Agarose vollständig mit einem Wasserbad oder einer Mikrowelle auf, bis die Agarose zu sprudeln beginnt. Die geschmolzene Agarose bis zu einer Dicke von fünf Millimetern in eine Petrischale gießen und bei Raumtemperatur festhalten lassen.
Nach dem Abbinden die Petrischale verschließen und bei vier Grad Celsius lagern. Schneiden Sie die Agarose in Kabinenblöcke zur Verwendung zum Zeitpunkt der Dissektion. Reinigen Sie zuerst den Dissektionsbereich mit 70% Ethanol.
Kleben Sie den tragenden oder abgewinkelten Agaroseblock auf die Vibratomschale. Legen Sie das Ei unter ein helles Licht und suchen Sie den luftgefüllten Raum auf der größeren oder runderen Seite des Eies, dann knacken Sie die Schale über dem luftgefüllten Raum und legen Sie den Membransack frei. Machen Sie einen sanften Schnitt in den Sack, um den Schnabel freizulegen.
Ziehen Sie mit einem Skalpell Hals und Kopf vorsichtig aus dem Ei. Reinigen Sie den Kopf nach der Enthauptung mit gekühltem dACSF. Halten Sie den Kopf ruhig in gekühltem dACSF und machen Sie einen rostrocaudalen Einschnitt.
Beginnen Sie den Schnitt hinter und zwischen den Augen und folgen Sie der Länge des geernteten Halses. Trennen Sie die Haut, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie den Schädel hinter dem Auge in Mittellinie bis seitliche Richtung.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für beide Hemisphären. Schneiden Sie den rostralen Teil des Schädels, indem Sie die Klinge hinter die Augen legen und einen schnellen Schnitt machen. Dann tauchen Sie den Kopf in eine Schüssel mit gekühltem dACSF.
Machen Sie mit einer kleinen Schere Mittellinien- bis Seitenschnitte in der kaudalen Region des Schädels, um das Gehirn zu trennen, ohne Gewebeschäden zu verursachen. Legen Sie den Hirnstamm und das Kleinhirn vorsichtig frei. Ziehen Sie den dorsalen Bereich des gesamten Schädels zurück.
Entfernen Sie den Hirnstamm und belichten Sie ihn durch leichtes Pinseln mit einem feinen Pinsel. Verwenden Sie gebogene Pinzetten, um den Hirnstamm von Verbindungsgewebe und Blutgefäßen zu reinigen. Trennen Sie den Hirnstamm vom Kleinhirn, indem Sie die Stiele schneiden und die Blutgefäße vorsichtig entfernen.
Schneiden Sie den Hirnstamm zusätzlicher Blutgefäße ab. Platzieren Sie zunächst die Vibratomklinge entlang der horizontalen Achse. Für koronale Scheiben kleben Sie den Hirnstamm auf ein Schneidetablett an der Rostralseite, wobei die rostrocaudale Achse vertikal gehalten wird.
Halten Sie bei sagittalen Schnitten die laterale mediale Achse vertikal. Kleben Sie bei horizontalen Scheiben die ventrale Seite und halten Sie die dorsale ventrale Achse vertikal. Um die akute winkelige sagittale horizontale Ebene zu erreichen, kleben Sie die ventrale Seite des Hirnstamms so, dass die ventrale dorsale Achse vertikal auf dem Hypotenuse-Oberflächenagarosenblock liegt.
Kleben Sie die gegenüberliegende Oberfläche des Agaroseblocks zur Schneideschale hin und halten Sie die Rostrocades parallel zur Klingenkante. Als Alternative zum Vibratomschneiden tauchen Sie den isolierten Hirnstamm in 4% niedrige Schmelzpunktagarose bei 40 Grad Celsius in eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale. Nachdem die Agarose erstarrt ist, schneiden Sie den Kabinen-Agaroseblock mit einer scharfen Rasierklinge.
Kleben Sie den Agaroseblock auf seine rostrale Seite und halten Sie die rostrocaudale Achse des Hirnstamms vertikal. Nehmen Sie koronale Schnitte, bis die NM-Region zu sehen ist. Entfernen Sie den Agaroseblock mit einer scharfen Klinge vom Kleber.
Legen Sie mit einer feinen Nadel vorsichtig 0,5 Mikroliter Toluidinblau-Farbstoff auf die NM, um die Kerne zu erkennen. Montieren Sie diesen Block wieder auf der Schneideschale für sagittale oder horizontale Scheiben. Identifizieren Sie die Kerne in Bezug auf die gefärbte Region und schneiden Sie den Hirnstamm.
Nach dem Schneiden legen Sie die 200 bis 300 Mikrometer nacheinander gesammelten Scheiben in eine geschnittene Kammer, die ACSF enthält, um eine Stunde lang bei Raumtemperatur zu babribrieren. Koronale Schnitte des Hirnstammgewebes von einem E19- bis 21-Hühnerembryo stellen die relativen Isofrequenzregionen der auditorischen Hirnstammkerne von der niedrigsten zur höchsten charakteristischen Hörfrequenzregion dar. Die afferenten Hörnervenfasern und die Gabelung der NM-Axone waren sichtbar.
Nucleus angularis wurde ebenfalls beobachtet. In rostralen Abschnitten befindet sich der obere Olivarkern entlang der ventralen lateralen Region der koronalen Scheibe. In sagittalen Abschnitten wurden NM und Nucleus laminaris oder NL identifiziert, wo die Hörnervenfasern in den Cluster von Neuronen eintraten.
Der obere Olivarkern wurde in der rostrolateralen Region identifiziert. Es wurden nieder- und hochfrequente Hörregionen aus NM und NL entlang der rostrocaudalen Achse beobachtet. Der medialste Schnitt zeigte die ipsilateralen und kontralateralen axonalen Büschel und den Endpunkt der Hörregion.
In den horizontalen Schnitten wurden NM und NL in Richtung der Mittellinie identifiziert, und Neuronen waren entlang der lateralen medialen Achse verteilt. Schnitte des Hirnstammgewebes in einem spitzen Winkel von einer horizontalen Ebene zeigten die auditorischen Hirnstammkerne über eine große diagonale Ausbreitung. Vergrößerte Bilder zeigten die tonotopische Achse der Hörkerne entlang der rostromedialen bis caudolateralen Achse.
Stellen Sie sicher, dass der gesamte Prozess in eisgekühltem dACSF durchgeführt wird, das kontinuierlich mit Kohlenhydratsauerstoff geblasen wird. Dieses Protokoll wird für Forscher verwendet, die die anatomischen und biophysikalischen Eigenschaften der Entwicklung von Hirnstamm-Mikroschaltkreisen untersuchen, insbesondere die Beziehung zwischen den wichtigsten Hörkernen.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Gewinnung nicht-koronaler Hörstamm-Schnitte von Hühnerembryonen vor, das darauf abzielt, tonotopische Eigenschaften und Entwicklungstrajektorien zu untersuchen. Die Methode ermöglicht die Untersuchung größerer tonotopischer Regionen innerhalb eines einzelnen Hörstamm-Schnitts im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- Die Entwicklung des auditorischen Hirnstamms ist entscheidend für die Verarbeitung von Schallfrequenzen.
- Hühnerembryonen stellen aufgrund ihrer ähnlichen anatomischen Merkmale zu anderen Vogelarten ein geeignetes Modell dar.
- Herkömmliche koronare Schnittmethoden beschränken die Analyse tonotoper Muster.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, diese Einschränkungen zu überwinden und das Verständnis von Mikroschaltkreisen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Gewinnung von Schnitten bereitzustellen, die die in-vivo-Eigenschaften des auditorischen Hirnstamms bewahren.
- Die Untersuchung der Entwicklungsverläufe auditorischer Verarbeitungsareale zu erleichtern.
- Das Verständnis der anatomischen und biophysikalischen Eigenschaften der Schaltkreise des auditorischen Hirnstamms zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Gewinnung lebender Hirnstammschnitte mittels Vibratomschneidetechnik.
- Verwendung von Hühnerembryonen als biologisches Modell.
- Einige Schritte umfassen Sterilisation, Einbettung in Agarose und sorgfältige Dissektion von Hirnstammgewebe.
- Hirnstammschnitte werden vor der Experimentierung in ACSF equilibriert.
- Fokus auf spezifische auditorische Kerne und deren tonotopische Organisation in thematischen Schnitten.
Hauptergebnisse
- Nachweis der Fähigkeit, Schnitte zu erzeugen, die mehrere tonotopische Regionen in einer Ebene umfassen.
- Möglichmachung der Beobachtung zentraler auditorischer Kerne, wie des Nucleus angularis und des Nucleus olivaris superior.
- Hervorhebung der Organisation der auditorischen Nervenfasern und ihrer Rolle in der Tonotopie.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht detaillierte anatomische und funktionelle Untersuchungen des auditorischen Hirnstamms.
- Erleichtert das Verständnis der Beziehungen zwischen verschiedenen auditorischen Kernen und ihren Entwicklungsprozessen.
- Implikationen für zukünftige Forschung zu neurodevelopmentalen Mechanismen bei vogelartigen Spezies.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erhaltung tonotoper Gradienten in Schnitten des auditorischen Hirnstamms von embryonalen Hühnern ermöglicht eine umfassendere Bewertung der Entwicklung von Mikroschaltkreisen und der frequenzspezifischen neuronalen Organisation. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Validierung früher neurodevelopmentaler Zielstrukturen und unterstützt die translationale Kontinuität in der Forschung zum Hörsystem. Die Fähigkeit der Methode, größere Frequenzgradienten innerhalb eines einzelnen Schnitts aufrechtzuerhalten, macht sie zu einem wertvollen Werkzeug für die mechanistische Risikominimierung in forschungs- und entwicklungstechnischen Portfolios mit Fokus auf die Neurobiologie.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der tonotopen Organisation und der Entwicklung mikroskopischer Schaltkreise über einen breiteren Frequenzbereich hinweg.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem die anatomische und biophysikalische Diversität innerhalb einzelner Schnitte erhalten bleibt.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem gleichzeitige Analysen mehrerer auditorischer Kerne ermöglicht werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte Gewebesysteme für elektrophysiologische und anatomische Untersuchungen, die auf auditorische Bahnen abzielen.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit von Untersuchungen durch Standardisierung der Schnittrichtung und der tonotopischen Abdeckung.
- Ermöglicht den quantitativen Vergleich neuronaler Eigenschaften entlang der tonotopischen Achse.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Anwendung krankheitsrelevanter Modelle für die Entwicklung und Funktion des Hörsystems.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem in-vivo-ähnliche Gradienten aufrechterhalten werden.
- Verringert das Übersetzungsrisiko, indem eine physiologisch relevantere Analyse von Mikroschaltkreisen ermöglicht wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Schneideprotokoll integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem es frühe mechanistische Studien, die Entwicklung von Assays und translationsmedizinische Forschung an auditorischen Hirnstammkreisläufen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur tonotopischen Organisation und zur Reifung mikroskopischer Schaltkreise.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare Schnitte mit erhaltener Gradientierung für nachgeschaltete elektrophysiologische und anatomische Analysen.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse zum Vergleich neuronaler Eigenschaften über verschiedene Frequenzbereiche hinweg.
- Translationale Forschung: Gewährleistet Entwicklungstreue und anatomische Genauigkeit zur Abstimmung präklinischer Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein standardisiertes und anpassbares Protokoll für vielfältige Fragestellungen der neurodevelopmentalen Forschung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert die Mehrdeutigkeit bei der Zielvalidierung des auditorischen Systems.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der Hirnstammschnittpräparation.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem robuste mechanistische Studien ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung neurodevelopmentaler Zielstrukturen und Modelle.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in embryonaler Dissektion und Vibratomschneidetechniken.
- Benötigt Zugang zu spezialisierten Geräten für die Präparation und Analyse von lebendem Gewebe.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen für die Schnittrichtung und die Identifizierung der tonotopischen Achse voraus.
- Kann auf andere Vogelarten mit ähnlicher Anatomie des auditorischen Hirnstamms übertragen werden.
- Hängt von der Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen während der gesamten Gewebemanipulation und des Schneidens ab.
