Name: Bewertung der auditiven Hirnstammreaktion bei Hühnerschlüpflingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie die ABR-Methode zur Bewertung der auditiven Funktion bei Hühnerschlüpflingen. Dieses nicht-invasive Protokoll ermöglicht die Untersuchung genetischer Einflüsse auf das Gehör und kann auf andere Vogelarten übertragen werden.

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Diese Arbeit wird unterstützt durch die NIH/NIDCD R01 DC017167

Die hier beschriebenen Experimente wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) der Northwestern University genehmigt und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt.
1. Hühnerhaltung
<ol><li>Erwerben Sie befruchtete weiße Leghorn-Hühnereier. HINWEIS: Es gibt mehrere Hühnerrassen, die in der wissenschaftlichen Forschung verwendet werden, aber die hier gezeigten Ergebnisse stammen vom weißen Listilhornhuhn (Gallus gallus domesticus). Während die ABR-Variabilität zwischen den Rassen unbekannt ist, wurden einige Unterschiede beim Vergleich von erwachsenen eierlegenden Hühnern mit fleischproduzierenden Masthühnerngefunden 24,25.</li>
	<li>Eier bei 38 °C, Feuchtigkeit bei 50% 21 Tage vor dem gewünschten Testtermin bebrüten. HINWEIS: Wenn Eier nicht sofort bei 38 °C bebrütet werden, können sie bei 14 °C, Luftfeuchtigkeit bei 40% gelagert werden. Je länger die Eier jedoch bei 14 °C gehalten werden, desto unwahrscheinlicher ist es, dass sie sich zu lebensfähigen Jungtieren entwickeln. Nach 7 Tagen kann die Lebensfähigkeit der Eier auf bis zu 50% sinken, je nachdem, wie lange die Eier bei 14 ° C gehalten werden. Die Lebensfähigkeit der Eier wird auch in den Wintermonaten sinken.</li>
	<li>Drehen Sie die Eier regelmäßig 2-3 mal am Tag. Die meisten Inkubatoren verfügen über einen Mechanismus, um dies automatisch durchzuführen.</li>
	<li>Wenn Sie einen Styropor-Inkubator oder einen Inkubator mit mehr als 6 Eiern verwenden, übertragen Sie die Eier am Tag vor dem Schlüpfen, dem 20. Embryonaltag (E20), in einen kleinen Inkubator mit einer Temperatur von 38 °C. Eier sollten 21 Tage (E21) schlüpfen, nachdem sie in den Inkubator gelegt wurden. HINWEIS: Während des Schlupfprozesses beginnt das Tier, aus dem Ei zu "spritzen" und ein kleines Loch zu bilden, das schließlich um das gesamte Ei geht. Wenn die Bedingungen zu trocken sind, kann das Ei austrocknen und das Tier kann nicht schlüpfen. Die Luftfeuchtigkeit sollte bei 50% gehalten werden, basierend auf früheren Studien zur Lebensfähigkeit von Eiern26,27,28,29.</li>
	<li>Bestimmen Sie das Alter des Tieres. Wenn die Luke nicht persönlich beobachtet wird, ist der einzige Hinweis auf das Alter die 2-3 Stunden, die das Fruchtwasser zum Trocknen benötigt. HINWEIS: Der Brutkasten für Jungtiere sollte täglich gründlich mit 70% Isopropylalkohol gereinigt werden, je nachdem, wie viele Jungtiere verarbeitet werden. Hühnerschlüpflinge hinterlassen oft Exkremente, Federn und Fruchtwasser im Inkubator, die die Bedingungen und die Luftqualität kontaminieren können.</li>
</ol>2. Arzneimittelzubereitung
<ol><li>Wiegen Sie das Tier, indem Sie es in ein großes Wiegeboot legen. Bei einer ausreichend sanften Platzierung sollte sich das Tier nicht bewegen. HINWEIS: Die Masse kann zwischen 30 und 45 g liegen. Jüngere Tiere sind oft schwerer, weil sie Eigelbreserven haben und noch keine Abfälle ausscheiden. Ältere Tiere, die sich dem Alter von 24 Stunden nähern, und P2 wiegen normalerweise weniger.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Anästhesiecocktail aus Ketamin (100 mg / ml) und Xylazin (20 mg / ml) vor, so dass die Dosierung 50 mg / kg Ketamin und 16,68 mg / kg Xylazin basierend auf dem Tiergewicht beträgt. HINWEIS: Dieser Medikamentencocktail kann mit 1 ml Ketamin (100 mg / ml), 1,5 ml Xylazin (20 mg / ml) und 2,5 ml H2O hergestellt werden. Anästhetische Cocktail-Injektionen reichen von 0,05-0,1 ml, basierend auf dem Bereich von 30-45 g im Tiergewicht.</li>
</ol>3. Drogeninjektion und Tiervorbereitung
<ol><li>Halten Sie das Tier in einer Hand und achten Sie darauf, die Beine festzuhalten.</li>
	<li>Fühlen Sie für das Brustbein des Tieres, den Kiel. Auf beiden Seiten des Kiels befindet sich der Brustmuskel.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 29-G-Nadel und eine Spritze, um 5 mm in die Haut einzudringen und injizieren Sie den Ketamin/Xylazin-Cocktail in den Brustmuskel. Injizieren Sie zwischen 0,05 und 0,1 ml basierend auf dem Tiergewicht.</li>
	<li>Legen Sie das Tier nach der Injektion wieder in den Inkubator. Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres für einige Minuten aufrecht, während das Anästhetikum wirkt.<ol>
<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um den Zeh des Tieres zu kneifen und überprüfen Sie, ob der Hals schlaff ist. Wenn es keinen Reflex und einen schlaffen Hals gibt, ist das Tier bewusstlos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie das Geschlecht des Huhns mit seinen Flügelfedern. Wenn die Federn alle gleich lang sind, ist das Tier männlich. Wenn die Federn in der Länge variieren, ist das Tier weiblich30. HINWEIS: Eine andere Methode, das Tier zu sexieren, ist das Entlüften. Die männlichen Genitalien sind in der Kloake31 zu sehen. Diese Methode ist sehr schwierig und kann dem Tier schaden, wenn sie nicht richtig durchgeführt wird. Es wird empfohlen, die Flügelfedermethode zu verwenden.</li>
	<li>Enthaarungscreme mit einem Baumwollspitzenapplikator auf den Kopf- und Halsbereich auftragen, besonders in der Nähe der Ohröffnung für den Vogel.</li>
	<li>Verwenden Sie 70% Isopropylalkohol-Tücher, um Federn, verbleibende Enthaarungscreme und die Haut an Kopf und Hals abzuwischen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein 70% iges Isopropylalkohol-Tuch, um die subdermalen Elektroden und die rektale Sonde zu sterilisieren.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in eine schallisolierte und elektrisch abgeschirmte Kammer. Stellen Sie sicher, dass die Umgebung nur minimale elektrische und akustische Geräusche aufweist, um die besten Aufnahmen zu erzielen. HINWEIS: Die Experimente hier wurden in einem kundenspezifischen schallisolierten Gehäuse mit den Maßen 24 x 24 x 25 Zoll durchgeführt. Jede Kammer oder jeder Raum, der akustische Geräusche sowie elektrisches Rauschen von elektrischem Wechselstrom (60 Hz in den Vereinigten Staaten) eliminiert, ist ausreichend.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Heizkissen oder ein Temperaturkontrollsystem, um die Körpertemperatur des Tieres aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Setzen Sie die geschmierte Rektalsonde ein, um sicherzustellen, dass die Temperatur des Tieres zwischen 37-41 ° C (98,6-105 ° F) 32,33 gehalten wird. HINWEIS: Wenn die Sonde eine falsche Größe hat, kann das Tier auf dem Temperaturfühler liegen.</li>
	<li>Befestigen Sie den Kopf des Tieres oder legen Sie den Schnabel gegen einen Gegenstand, um unerwünschte Bewegungen zu vermeiden. Dies kann mit Modelliermasse erfolgen, wenn die Atmung nicht behindert wird.</li>
	<li>Verabreichen Sie eine zusätzliche Injektion eines Anästhesiecocktails, der der Hälfte der ursprünglichen Dosierung entspricht, wenn das Tier während des Tests das Bewusstsein wiedererlangt. HINWEIS: Jede Körperbewegung oder Lautäußerung ist ein Zeichen dafür, dass eine Ergänzungsdosis verabreicht werden muss. Winzige Schnabelbewegungen zeigen die Atmung an und sind akzeptabel.</li>
</ol>4. Platzierung der Elektrode
<ol><li>Verwenden Sie drei Edelstahl-Silberchlorid-Nadelelektroden mit den folgenden Bezeichnungen: die Referenzelektrode, die aktive Elektrode und die gemeinsame Erdungselektrode. HINWEIS: Die Referenzelektrode wird auch als invertierend oder "-" bezeichnet. Die aktive Elektrode wird auch als nichtinvertierend oder "+" bezeichnet.</li>
	<li>Legen Sie jede Elektrode subdermal 2-3 mm in den Kopf, aber nicht tief genug, um den Schädel zu durchdringen. Verwenden Sie Elektroden mit einer Länge von 7 mm und einem Durchmesser von 0,4 mm.</li>
	<li>Stecken Sie die Elektrode aus der Haut und legen Sie die Spitze frei. Dies hilft, den Kontakt mit der Haut zu minimieren und eine gleichmäßige Einführtiefe bei Tierenzu gewährleisten 34. HINWEIS: Der Elektrodendraht sollte ausreichend locker sein, so dass nach dem Platzieren der Elektrode keine Spannung entsteht, die ihn herauszieht oder die Haut straff zieht.</li>
	<li>Für die Einkanalaufnahme platzieren Sie die aktive Elektrode über dem Schädel an der Mittellinie, so weit kaudal wie der Gehörgang.<ol>
<li>Platzieren Sie die Referenzelektrode hinter dem Ohr, wo der Reiz abgegeben wird, und platzieren Sie die Bodenelektrode hinter dem kontralateralen Gehörgang im Nacken. HINWEIS: Wenn Sie eine Operation am Schädel oder Gehörgang des Tieres durchführen, legen Sie die Referenzelektrode in den Hals an der Mittellinie des Tieres. Sowohl dies als auch Schritt 4.4.1 werden als horizontale Elektrodenaufzeichnungsmontagen betrachtet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie für die Zweikanalaufzeichnung zwei negative Elektroden und eine kombinierte positive Elektrode, die ein Adapterkabel erfordert. Platzieren Sie die Erdelektrode subdermal im Nacken und eine Referenzelektrode hinter jedem Gehörgang.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Elektrodenimpedanz. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtimpedanz der Elektrode 5,0 kΩ nicht überschreitet. Halten Sie die Interelektrodenimpedanz unter 3,0 kΩ.</li>
</ol>5. ABR-Aufzeichnung
<ol><li>Abhängig von der Erfassungshardware und -software ist darauf zu achten, dass die korrekten Schallpegel über die verwendeten Reizfrequenzen hinweg kalibriert werden. HINWEIS: Die Kalibrierungstechniken variieren je nach Gerät (siehe Diskussion). Bei einigen Programmen kann die Schalldämpfung innerhalb der Software bearbeitet werden. Die hier durchgeführten Kalibrierungsverfahren beinhalteten die Verwendung eines 1/8-Zoll-B & K 4138-Kondensatormikrofons, um Frequenzreize in einem geschlossenen Kopplersystem aufzuzeichnen, das sich dem Chick-Gehörgang (~ 5 mm) annäherte. Ein Kalibrierungstisch für Hühnerschlüpflinge wird als Zusatztabelle zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Bewegen Sie den Schallwandlerapparat in Richtung des aktiven Ohres des Tieres. Platzieren Sie den Schallwandler in einer geringen Tiefe von 2 mm im Gehörgang. HINWEIS: Je nach Schallwandler kann ein Kunststoffspekulum angebracht und in den Gehörgang eingeführt werden. Die Spekulumplatzierung ist kritisch. Wenn der Ton durch die Kanalwand blockiert wird oder der Gehörgang eingeklemmt ist, fehlen ABRs oder ähneln einer ~ 40 dB Verschiebung in der Schwelle.</li>
	<li>Überprüfen Sie das Tier während des Tests, ob die Ergebnisse abnormal aussehen oder fehlen. Wenn dies der Fall ist, positionieren Sie den Schallwandler im Gehörgang neu. HINWEIS: Da die Haut locker ist und Tierbewegungen möglich sind, kann sich die Spekulumplatzierung während der Aufnahme verschieben. Bei korrekter Anästhesieinjektion und dem Tier völlig bewusstlos kann die Aufnahme jedoch 30-45 Minuten lang ununterbrochen erfolgen.</li>
</ol>6. Datenerfassung
<ol><li>Verwenden Sie ausreichend Equipment / Software, um Klangreize zu erzeugen und ABR-Aufnahmen aufzunehmen / zu erfassen. HINWEIS: Es gibt viele kommerziell erhältliche oder kundenspezifische Systeme für die ABR-Akquisition. Für diese Experimente wurde die kommerziell erhältliche SmartEP USB-Plattform Intelligent Hearing Systems (IHS) verwendet. Die Fähigkeit, Aufzeichnungsparameter zu manipulieren, ist von entscheidender Bedeutung. Dazu gehören unter anderem die Stimulusintensität, die Stimuluslänge, die Stimulusfrequenz, die Stimuluspräsentationsrate, der Hochpass- und Tiefpassfilter, die Artefaktablehnung, die Anzahl der Sweeps, die Abtastrate, die Hüllkurvenform und die Reizpolarisation.</li>
	<li>Legen Sie die oberen und unteren Grenzwerte für die Artefaktablehnung (AR) auf ±25 μV fest, sodass Tierbewegungen oder -geräusche während eines Sweeps diesen Sweep von der Analyse ausschließen. In der getesteten Population wurden weniger als 1% der gesamten Sweeps aufgrund von Artefakten abgelehnt.</li>
	<li>Sammeln Sie mindestens 1024 Sweeps, um eine große durchschnittliche Antwort zu erhalten. Dies kann in zwei Aufnahmen von jeweils 512 Sweeps erfolgen. Dies stellt auch sicher, dass die Reaktion reizbeschworen und wiederholbar ist.</li>
	<li>Stellen Sie die Verstärkung auf 100.000, den Tiefpassfilter auf 100 Hz und den Hochpassfilter auf 3000 Hz ein. HINWEIS: Die Tief- und Hochpassfiltereinstellungen waren optimal für Aufnahmen mit dem IHS-System. Daher sind diese Parameter Empfehlungen. ABR-Aufzeichnungen bei anderen Vogelarten mit der BIOSIG-Software filterten das Signal zwischen 30 und 3000 Hz 5,13,14,16,22.</li>
	<li>Stellen Sie die Stimulus-Präsentationsrate zwischen 10 und 20 Stimuli pro Sekunde ein. Hohe Präsentationsraten verschieben die ABR-Spitzenlatenz, insbesondere für spätere Spitzen13. Niedrige Präsentationsraten erhöhen die Zeit, die für die Erfassung der ABR erforderlich ist.</li>
	<li>Stellen Sie die Zeitdauer des Klickreizes auf 100 μs ein.<ol>
<li>Wenn Sie einen Ton-Burst-Stimulus verwenden, bearbeiten Sie die Häufigkeit und Dauer des Stimulus basierend auf dem gewünschten Effekt. Ein Bereich von 100-4000 Hz wurde für Ton-Burst-Reize verwendet, obwohl der Bereich des Verhaltenshörens bei erwachsenen Hühnern von 2-9000 Hz35 reicht. HINWEIS: Im IHS-System kann die Anstiegs- und Abfallzeit eines Tonausbruchreizes nur geändert werden, wenn die spektrale Hüllkurvenform ein Trapez ist. Die Kosinus-Quadrat- und Blackman-Umschläge bieten jedoch eine voreingestellte Auf- und Abstiegszeit, die häufig in Tier-ABR-Experimenten verwendet wird. Das IHS-System kann die spektrale Hüllkurve eines Tonausbruchs anzeigen, um angemessene Anstiegs- und Abfallzeiten zu gewährleisten. Die Auf- und Abstiegszeit eines Klickreizes kann in IHS nicht bearbeitet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie die Abtastrate auf den höchsten zulässigen Wert (normalerweise 40 kHz) ein, um die Daten mit der besten Auflösung zu erhalten. HINWEIS: Einige Systeme, einschließlich IHS, verwenden eine begrenzte Anzahl von Abtastpunkten und ändern die Länge des Aufzeichnungsfensters. Eine Abtastrate von 40 kHz (25 μs Periode) kann nur ein Aufnahmefenster von 12 ms zulassen, so dass zur Erfassung eines Tonburst-ABR eine Abtastrate von 20 kHz (50 μs Periode) verwendet wurde, um ein Aufnahmefenster von 24 ms zu ermöglichen. Wenn Sie Klick- und Toneburst-ABRs direkt vergleichen, halten Sie die Abtastrate konstant, um die gleiche Auflösung beizubehalten.</li>
	<li>Stellen Sie die Reizpolarisation auf alternierend ein. Dies geschieht, um die Visualisierung der Cochlea-Mikrofonik aus ABR-Aufnahmen zu eliminieren. Um die Cochlea-Mikrofonik zu visualisieren, verwenden Sie Verdünnung oder Kondensation für die Reizpolarität. HINWEIS: Bei der Auswahl von Reizen können viele Einstellungen geändert werden. Die bereitgestellten Verstärkungs- und Filtereinstellungen sind für andere Gerätekonfigurationen möglicherweise nicht optimal. Die Werkseinstellungen auf den meisten ABR-Maschinen sind nicht für die Aufnahme in Junghuhn eingestellt.</li>
	<li>Wenn Sie 512 Sweeps aufzeichnen, kombinieren Sie zwei separate Tests, um einen Sweep-Durchschnitt von 1024 zu erstellen.</li>
	<li>Für einen Klick- oder Tonstoßreiz erwerben Sie einen ABR mit einer supraschwellenden Intensität.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Aufzeichnung mit niedrigeren und niedrigeren Intensitäten fort, bis die hervorgerufene Reaktion nicht mehr identifiziert werden kann.</li>
	<li>Definieren Sie den ABR-Schwellenwert als die niedrigste Reizintensität, die eine nachweisbare evozierte Reaktion hervorruft. Senken Sie die Stimulusintensität um Schritte von 5 dBSPL, um die niedrigste Reizintensität zu finden, die einen nachweisbaren Peak hervorruft.</li>
</ol>7. Euthanasie und Experimentende
<ol><li>Sobald ABRs erworben sind, bereiten Sie eine Überdosis (0,1 ml) Euthanasielösung (Pentobarbitalnatrium 390 mg/ml Phenytoinnatrium 50 mg/ml) vor.</li>
	<li>Nachdem Sie eine Zehenklemme verwendet haben, um zu bestätigen, dass kein Reflex vorliegt, injizieren Sie die Euthanasielösung in den Brustmuskel mit einer 29-G-Nadel in einer Tiefe von 5 mm. Die Injektionstechnik ist die gleiche wie bei der Anästhesieinjektion. HINWEIS: Das Tier verfällt nach einigen Minuten. Manipulieren oder enthaupten Sie das Tier erst, wenn keine Bewegung festgestellt wird. Eine alternative Euthanasietechnik ist die Durchführung einer intravenösen Injektion in die Vena brachialis unter dem Flügel.</li>
	<li>Sobald das Tier nicht reflexartig ist und Atmung und Herzschlag aufgehört haben, enthaupten Sie schnell mit einer scharfen Schere oder Schere.</li>
	<li>Reinigen Sie das Heizkissen, die Rektalsonde und die Silberchloridelektroden mit 70% Isopropylalkoholtüchern.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass alle erfassten Spuren gespeichert wurden. Zur weiteren Analyse exportieren Sie Dateien als .txt Dateien, die im Editor angezeigt oder in eine Tabelle importiert werden können.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der auditive Hirnstamm von Vögeln ist gut untersucht, und viele Strukturen sind analog zum Hörweg von Säugetieren. Der Hörnerv liefert erregende Inputs auf die beiden zentralen Kerne erster Ordnung, den Cochlea-Nucleus magnocellularis (NM) und die Angularis (NA). NM sendet bilateral eine exzitatorische Projektion an sein auditives Ziel, den Nucleus laminaris (NL)7. NL projiziert auf den Nucleus mesencephalicus lateralis, Pars dorsalis (MLd)40,41. NL projiziert auch auf den oberen Olivarkern (SON), der eine Rückkopplungshemmung für NM, NA und NL42 bietet. Dieser untere auditorische Hirnstamm-Mikroschaltkreis ist exquisit für die Funktion, die er erfüllt, die Schalllokalisation und das binaurale Hören33 konserviert. Die oberen auditiven Hirnstammregionen des Vogels haben auch Kerne, die analog zum lateralen Lemniscus des Säugetiers und zum Colliculus inferior im Mittelhirn sind. Aufgrund dieser Ähnlichkeiten ist die Zusammensetzung des Vogel-ABR bis zum auditorischen Mittelhirn bei allen Wirbeltieren vergleichbar.
Während mehrere Vogelarten drei positive Peaks innerhalb von 6 ms nach Stimulusbeginn aufweisen, weist die Korrelation von ABR-Peaks mit zentralen auditiven Strukturen eine gewisse Variabilität auf. Welle I kann vernünftigerweise als die erste neuronale Reaktion der peripheren basilalen Papille und des Hörnervs angesehen werden und zeigt eine geringe Variabilität zwischen Individuen (Abbildung 1C). Die nachfolgende Wellenidentifizierung ist weniger sicher und kann sich zwischen den Arten unterscheiden. Kuokkanen et al.17 haben kürzlich festgestellt, dass Welle III der ABR der Schleiereule von NL erzeugt wird; Daher ist es vernünftig zu argumentieren, dass Welle II von NM und NA des Cochlea-Nucleus20 stammt. Die Eulenwelle III wurde jedoch als der positive Peak definiert, der 3 ms nach Beginn des Reizes erzeugt wurde. Dies entspricht der Welle II, wie sie im ABR des Junghuhns definiert ist. In der Schleiereule ABR wurden die Wellen I und II kombiniert.
Während das Junghuhn in der Regel innerhalb von 6 ms drei Spitzen aufwies, wurde gelegentlich ein vierter Peak beobachtet (siehe z. B. Abbildung 1A). Bevölkerungsdaten, eine größere Stichprobengröße und zusätzliche experimentelle Paradigmen wären erforderlich, um eine vierte Welle und in einigen Fällen eine fünfwellige Hühner-ABR zu unterstützen. Das konsistenteste Ergebnis waren die drei hier gezeigten Spitzendarstellungen.
Da die ABR als Maß für die neuronale Synchronität definiert ist, könnten die Hauptkerne im Hörweg jeden positiv gehenden Peak in der ABR darstellen. Das Signal, das vom Hörnerv zu NM / NA und dann zu NL weitergeleitet wird, kann die Wellen I, II und III im ABR des Junghuhns definieren. Darüber hinaus könnte der später auftretende vierte Höhepunkt der Hühner-ABR eine obere Hirnstamm- oder Mittelhirn-Hörstruktur darstellen. Bei der Charakterisierung von Vogel-ABRs sollte auch der Unterschied zwischen frühreifen und altrischen Vögeln berücksichtigt werden. Die Reifung der auditiven Reaktionen variiert je nach Art und wird auch durch andere kritische Merkmale wie Raubtierverhalten und / oder Stimmlernenbeeinflusst 4. Unabhängig davon lassen sich die beschriebenen Methoden und Techniken leicht auf eine Vielzahl von Vogel- und Wirbeltierarten anwenden.
Die Bedeutung der Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei Tieren ist in Abbildung 2 dargestellt. Als die innere Körpertemperatur abnahm, stieg die Latenz der ABR-Reaktionen bei gleicher Reizintensität an. Dies ist ausgeprägter, wenn die Körpertemperatur unter 32 °C36,37 fällt. Der Latenzanstieg der ABR um etwa 1 ms ist geringer als zuvor beim Hühnchen23. Katayama 23 verwendete jedoch ein 12 Tage altes Jungtier, das gekühlt und anschließend über einen Zeitraum von 4 Stunden erwärmt wurde. Die Daten in Abbildung 2 wurden während des Abkühlvorgangs über einen Zeitraum von 20 Minuten aufgezeichnet. Um die beste Qualität und die konsistentesten Aufzeichnungen zu erhalten, muss die Körpertemperatur des Tieres aufrechterhalten werden, und alle Aufzeichnungen sollten bei der gleichen physiologischen Temperatur bei Tieren durchgeführt werden.
Der Einfluss des Alters auf die ABR ist gering, aber wichtig zu berücksichtigen. Während nur die Latenz der Wellen I und II der ABR signifikant unterschiedlich war, liegt dies zum Teil daran, dass in Abbildung 3 nur drei junge Jungtiere verwendet wurden; die anderen drei wiesen keine drei identifizierbaren ABR-Spitzen auf. ABR-Amplituden- und Schwellenwertverschiebungen können auch offensichtlich sein, wenn große Stichprobengrößen verwendet oder frequenzspezifische ABRs verglichen werden. Dieser altersbedingte Effekt könnte durch Flüssigkeit im Mittelohr des Huhns verursacht werden. Solche leitfähigen Veränderungen führen zu einem deutlichen Anstieg der ABR-Schwellenwerte sowohl für menschliche als auch für andere Säugetiermodelle38,39.
Unter Verwendung von zwei verschiedenen Aufzeichnungsmontagen wurden ähnliche Reaktionen beobachtet (Abbildung 4A). Während die häufigste Montage die Referenzelektrode hinter dem Reizempfängsohr platziert, kann die Referenzelektrode im Halsgewebe nützlich sein, wenn der ABR von einem chirurgischen Eingriff begleitet wird. Wenn jedoch zweikanalige ABR-Aufnahmen verwendet werden, sollten die Referenzelektroden separat und symmetrisch platziert werden, was schwierig ist, wenn die Referenzelektrode im Nacken platziert wird. Die Mastoidposition für die Referenzelektrode wird empfohlen, um so viele Aspekte der Aufzeichnung wie möglich zu standardisieren. Zweikanal-ABR-Aufzeichnung ist ein effektives Werkzeug, das wenig zusätzliche Vorbereitung erfordert und zu ähnlichen Reaktionen zwischen den Ohren führt. Geringfügige Amplitudenunterschiede waren wahrscheinlich auf die Positionierung des Kopfhörers zurückzuführen. Die Zweikanalaufzeichnung ermöglicht einen einfachen Vergleich zwischen einem experimentell manipulierten Ohr oder einer Gehirnhälfte und einer Kontrolle. Dieses Setup wäre auch für das Testen von binauralen ABRs erforderlich. Zukünftige Experimente mit dem Hühner-ABR können sich auf frühere Literatur zur Aufzeichnung von Konfigurationen und Montagenbeziehen 34.
Diese Methodik ist mit mehreren Einschränkungen verbunden. Wie in Schritt 5.1 erwähnt, kann eine schlechte Spekulumplatzierung zu einer Verschiebung um 40 dBSPL als Reaktion führen. Dies könnte zu einer falschen Interpretation eines manipulierten oder veränderten Tieres führen. Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen werden empfohlen: Erfassen Sie eine große Stichprobe von Kontrolldaten, bevor Sie die ABRs von manipulierten oder mutierten Modellen erfassen. Verringern Sie die Stimulusintensität zwischen den Aufnahmen nicht um mehr als 20 dBSPL. Wenn sich die Amplitude oder Latenz stärker als erwartet verschiebt, überprüfen Sie die Tier- und Spekulumposition. Wiederholen Sie diesen ABR-Reiz, um Veränderungen zu beobachten. Wenn sich das Spekulum bewegt hat, erwerben Sie frühere Tests erneut. Eine weitere Einschränkung ist die Kalibrierung von ABRs. Ohne eine ordnungsgemäße Kalibrierung zur Aufzeichnung des Schalldruckpegels ist die dem Tier präsentierte Intensität unbekannt. Verwenden Sie bei der Messung der Klangausgabe das gleiche Spekulum wie bei experimentellen Aufnahmen und ein kleines Mikrofon in einem Hohlraum, der sich der Gehörgangslänge des Tieres (~ 5 mm) annähert. Messen Sie die gleichen Tonfrequenzen, die in Experimenten verwendet werden, da Kalibrierungen frequenzspezifisch sind. Das Handbuch für Hardware- und Softwaresysteme kann Anweisungen für die Kalibrierung enthalten. Es gibt auch zusätzliche Filter wie lineare Phasen- und Minimalphasenfilter, die Klick- und Toneburst-ABRs43 verbessern können. Diese Filter wurden in der vorliegenden Studie nicht verwendet. Zusätzliche Überlegungen, wie die Anstiegs- und Abfallzeit einer spektralen Tonexplosionshülle, die sich als Funktion der Frequenz ändert oder die Anstiegs- und Abfallzeit der Klickreize ändert, wurden ebenfalls nicht untersucht. Dies sind gute zukünftige Untersuchungen, sobald zuverlässige und konsistente ABRs erworben werden können.
Der Vergleich des Junghuhns mit anderen Vogelmodellen ist vielversprechend. Wellensittiche und Östliche Kreischeulen zeigen auch drei positive Mikrovoltspitzen innerhalb der ersten 6 ms des ABR13,22. Bei verschiedenen Spechtarten sind auch drei Spitzen zu sehen, aber ihre Latenz ist später in der Zeit. Darüber hinaus liegt der Bereich der besten Frequenzempfindlichkeit bei Spechten zwischen 1500 und 4000 Hz, was etwas höher ist als der beste Schwellenwert des Huhns bei 1000 Hz. Beim erwachsenen Huhn liegt die beste Empfindlichkeit bei 2000 Hz35, so dass das Hören hoher Frequenzen verbessert werden kann, wenn sich Hühnerschlüpflinge zu Erwachsenen entwickeln. Diese Entwicklung wird sich zwischen den Vogelarten unterscheiden, wobei die altriciale oder frühreife Entwicklung des Tieresberücksichtigt wird 4.
Die hier beschriebenen experimentellen Methoden können helfen zu bestimmen, welche Faktoren zu Nachteilen oder Veränderungen der auditiven Reaktionen und Schwellenwerte sowie zu Studien in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung führen. Genetische Manipulation, Alterung und Lärmbelastung sind bekannte Manipulationen bei Tieren und anderen Vogelmodellen 24,25,44,45. Diese Methoden sollten auf das Hühnermodell ausgeweitet werden, da Techniken wie die In-Ovo-Elektroporation die Expression von Proteinen ermöglichen, die fokal und zeitlich auf einer Seite des auditorischen Hirnstammskontrolliert werden 12,46. Dies ermöglicht den direkten Vergleich von ABRs aus dem genetisch manipulierten Ohr mit dem kontralateralen Steuerohr unter Verwendung eines Zweikanal-Aufzeichnungsparadigmas.
Insgesamt ist die ABR von Junghühnern eine nützliche Forschungsmethode, die fast identisch mit Messungen der Hörfunktion in menschlichen und anderen Säugetiermodellen ist. Es ist auch eine nicht-invasive In-vivo-Methodik . Abgesehen von der anästhetischen Injektion und der subdermalen Elektrodenplatzierung von wenigen Millimetern ist keine weitere physikalische Manipulation erforderlich. Ein Jungtier könnte theoretisch mehrmals über einen Entwicklungszeitverlauf von Tagen oder Wochen getestet werden, wenn es in einer geeigneten Umgebung aufbewahrt wird. Dieses Protokoll legt nicht nur die notwendigen Schritte und Aufzeichnungsparameter für die ABR des Junghuhns fest, sondern schlägt auch Merkmale eines Vogel-ABR vor, die weitere Tests der auditiven Hirnstammfunktion beeinflussen können.

Die Untersuchung evozierter neuronaler Reaktionen auf Klangreize reicht über ein halbes Jahrhundertzurück 1. Die auditive Hirnstammreaktion (ABR) ist ein evoziertes Potenzial, das seit Jahrzehnten als Maß für die auditive Funktion sowohl bei nichtmenschlichen Tieren als auch bei Menschen verwendet wird. Die menschliche ABR weist fünf bis sieben Wellenformspitzen auf, die konventionell mit römischen Ziffern (I-VII)2 gekennzeichnet sind. Diese Peaks werden basierend auf ihrer Latenz (Zeitpunkt des Auftretens in Millisekunden) und Amplitude (Peak-to-Trog-Größe in Mikrovolt) der neuronalen Reaktionen analysiert. Die ABR ist maßgeblich an der Bewertung der Funktion und Integrität des Hörnervs sowie der Hirnstamm- und Hörschwellenempfindlichkeit beteiligt. Defizite im auditorischen System führen zu fehlenden, reduzierten, verlängerten oder abnormalen ABR-Latenzen und Amplituden. Bemerkenswerterweise sind diese Parameter bei Menschen und anderen Tieren nahezu identisch, was sie zu einem konsistenten objektiven Test der auditiven Funktion in allen Wirbeltiermodellen3 macht.
Ein solches Modellsystem ist das Huhn, und es ist besonders nützlich aus einer Vielzahl von Gründen. Vögel können als altricial oder precocial4 klassifiziert werden. Altricial Vögel schlüpfen mit Sinnen, die sich noch entwickeln; Zum Beispiel zeigen Schleiereulen erst vier Tage nach dem Schlüpfen5 eine konsistente ABR. Frühreife Tiere wie das Huhn schlüpfen mit fast reifen Sinnen. Der Beginn des Gehörs tritt in der Embryonalentwicklung auf, so dass Tage vor dem Schlüpfen (Embryonaltag 21) das auditorische System nahe der funktionellen Reifungsteht 6,7,8. Greifvögel und die meisten Säugetiermodelle sind anfällig für extrinsische Faktoren, die die Entwicklung beeinflussen und eine Tierhaltung erfordern, bis das Gehör reif ist. Hühner-ABRs können am selben Tag wie der Schlupf durchgeführt werden, ohne dass eine Fütterung oder eine angereicherte Umgebung erforderlich ist.
Das embryonale Huhn war ein gut untersuchtes Modell für Physiologie und Entwicklung, insbesondere im auditorischen Hirnstamm. Zu den spezifischen Strukturen gehören der Hähnchen-Cochlea-Kern, unterteilt in Nucleus magnocellularis (NM) und Nucleus angularis (NA), und das Vogelkorrelat der medialen oberen Olive, bekannt als Nucleus laminaris (NL) 6,7. Der ABR ist ideal, um sich auf die zentrale Hörfunktion vor der Ebene des Vorderhirns und des Kortex zu konzentrieren. Die Translation zwischen In-vivo-ABR-Messungen und in-vitro-neuronalen Studien der Entwicklung8, Physiologie9, Tonotopie 10 und Genetik11,12 bietet ideale Forschungsmöglichkeiten, die Studien der gesamten auditiven Funktion unterstützen.
Obwohl die ABR in Säugetiermodellen ausführlich untersucht wurde, gab es für Vögel weniger Fokus. Frühere Vogel-ABR-Studien umfassen Charakterisierungen des Wellensittichs 13, Specht14, Möwe15, Tauchvögel16, Zebrafink17, Tagignalgreifer18, Kanarienvogel19, drei Eulenarten 5,20,21,22 und Huhn 23. Angesichts der fast vier Jahrzehnte seit der letzten gründlichen Charakterisierung der Hühner-ABR haben sich viele der zuvor verwendeten Geräte und Techniken geändert. Erkenntnisse aus Studien in anderen Vogelmodellen können dazu beitragen, eine moderne Hühner-ABR-Methodik zu entwickeln und gleichzeitig als Vergleich mit der Hühner-ABR zu dienen. Dieses Papier wird den Versuchsaufbau und das experimentelle Design skizzieren, um die ABR-Aufzeichnung bei Junghühnern zu ermöglichen, die auch auf embryonale Entwicklungsstadien und andere kleine Nagetier- und Vogelmodelle angewendet werden könnten. Darüber hinaus können angesichts der frühreifen Entwicklung des Huhns Entwicklungsmanipulationen ohne extensive Tierhaltung durchgeführt werden. Manipulationen an einem sich entwickelnden Embryo können nur wenige Stunden nach dem Schlüpfen des Tieres mit nahezu reifen Hörfähigkeiten bewertet werden.

<table><tbody><tr><td>1/8 Zoll B& K Mikrofon</td><td>Br&uuml; el & Kj&aelig; r</td><td>4138</td><td>Typ 4138-A-015 funktioniert auch Auditorisch</td></tr><tr><td>evoziertes Potenzial Universal Smart Box</td><td>Intelligente Hörsysteme</td><td>M011110</td><td></td></tr><tr><td>Custom Sound Isolation Chamber</td><td>GK Soundbooth Inc</td><td>N / A</td><td>Kundenspezifisches</td></tr><tr><td>DC-Netzteil</td><td>CSI / Speco</td><td>PSV-5</td><td></td></tr><tr><td>ER3 Insert Kopfhörer</td><td>Intelligente Hörsysteme</td><td>M015302</td><td>Verwendung als Ton Schallkopf</td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>Kontrollierte Substanz; Euthanasielösung</td></tr><tr><td>Insulinspritze (29 g)</td><td>Comfort Point</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Covetrus</td><td>11695-0703-1</td><td>Kontrollierte Substanz</td></tr><tr><td>Stromversorgung</td><td>Powervar</td><td>93051-55R</td><td></td></tr><tr><td>Rektalsonde</td><td>YSI</td><td>401 (10-09010)</td><td>Jede Sonde der Serie 400 funktioniert mit dem YSI Temperaturmonitor</td></tr><tr><td>Subdermale Nadeln</td><td>Rhythmlink</td><td>RLSND107-1,5</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturmonitor</td><td>YSI</td><td>73ATA 7651</td><td>Funktioniert mit jeder rektalen Sonde der Serie 400</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Anased</td><td>59399-110-20</td><td>Wird mit Ketamin und Wasser zur Anästhesie</td></tr></tbody></table> verwendet

bewertung der auditiven hirnstammreaktion bei hühnerschlüpflingen

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

Die auditive Hirnstammreaktion (ABR) ist ein unschätzbarer Assay in der klinischen Audiologie, bei nichtmenschlichen Tieren und in der Humanforschung. Trotz der weit verbreiteten Verwendung von ABRs bei der Messung der auditiven neuronalen Synchronität und der Schätzung der Hörempfindlichkeit in anderen Wirbeltiermodellsystemen wurden seit fast vier Jahrzehnten keine Methoden zur Aufzeichnung von ABRs beim Huhn mehr berichtet. Hühner bieten ein robustes Tierversuchsmodell, da ihr Hörsystem in späten embryonalen und frühen Jungschlüpfstadien kurz vor der funktionellen Reifung steht. Wir haben Methoden demonstriert, die verwendet werden, um ein- oder zweikanalige ABR-Aufnahmen mit subdermalen Nadelelektrodenarrays bei Hühnerschlüpflingen hervorzurufen. Unabhängig von der Elektrodenaufzeichnungskonfiguration (d. h. Montage) enthielten ABR-Aufnahmen 3-4 positiv gehende Peakwellenformen innerhalb der ersten 6 ms eines supraschwellenden Klickstimulus. Die Amplituden von der Peak-to-Trog-Wellenform reichten von 2 bis 11 μV bei hoher Intensität, wobei positive Spitzen die erwarteten Latenzintensitätsfunktionen aufwiesen (d. h. eine Zunahme der Latenz als Funktion der abnehmenden Intensität). Eine standardisierte Kopfhörerposition war entscheidend für optimale Aufnahmen, da lose Haut den Gehörgang verschließen kann und Tierbewegungen den Reizwandler verdrängen können. Die Spitzenamplituden waren kleiner und die Latenzen waren länger, als die Körpertemperatur der Tiere sank, was die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung der physiologischen Körpertemperatur unterstützte. Für junge Jungtiere (<3 h nach dem Schlüpfen Tag 1) waren die Schwellenwerte um ~ 5 dB erhöht, die Spitzenlatenzen stiegen um ~ 1-2 ms und die Amplituden von Spitze zu Tal, um ~ 1 μV im Vergleich zu älteren Jungtieren. Dies deutet auf ein potenzielles leitfähiges Problem hin (d. H. Flüssigkeit in der Mittelohrhöhle) und sollte für junge Jungtiere in Betracht gezogen werden. Insgesamt erlauben die hier beschriebenen ABR-Methoden eine genaue und reproduzierbare Aufzeichnung der in-vivo-Hörfunktion bei Hühnerschlüpflingen, die auf verschiedene Entwicklungsstadien angewendet werden könnte. Solche Ergebnisse lassen sich leicht mit menschlichen und Säugetiermodellen von Hörverlust, Altern oder anderen auditiven Manipulationen vergleichen.

Repräsentative ABR-Aufzeichnungen für Jungküken Die folgenden repräsentativen und Populationsergebnisse stammen aus ABR-Aufzeichnungen, die an 43 Tieren gemacht wurden. Als Reaktion auf einen supraschwellenden Klickreiz (75 dBSPL) wurden bei allen Jungtieren durchweg drei positive Peaks beobachtet. Diese Spitzen traten innerhalb von 6 ms nach Beginn des Reizes auf. Selten wurde auch ein vierter Peak bei ~6 ms beobachtet. Während die Identifizierung von ABR-Peaks bei Vögeln zwischen Tieren variierte (siehe Diskussion), wurden Peaks als römische Ziffernwellen I-IV bezeichnet und identifiziert. Eine repräsentative ABR-Wellenform mit markierten Peaks ist in Abbildung 1A (obere Leiterbahn) dargestellt. Abbildung 1B zeigt die Latenzintensitätsfunktion für die Wellen I und III, die in der repräsentativen Spur markiert sind. Die Spitzenlatenz der Welle I stieg um ~ 0,3 ms für jede 20 dB Abnahme der Stimulusintensität. Im Durchschnitt traten die Wellen I-III bei 1,50 ms (±0,02 ms), 3,00 ms (±0,06 ms) bzw. 4,13 ms (±0,09 ms) bei 75 dBSPL auf (Abbildung 1C). Welle I und Welle III präsentierten sich immer als singulärer Gipfel. Gelegentlich wurden für Welle II mehrere kleine Spitzen zwischen 2,5 und 3,2 ms beobachtet. Jeder Peak hatte einen entsprechenden Trog, und die Amplitude von Peak zu Trog von Welle I - dem größten aller Peaks - betrug durchschnittlich 7 μV und näherte sich einer maximalen Amplitude von 11 μV bei 75 dB SPL.
Zusätzlich zur größten Amplitude zeigte Welle I der Küken-ABR die geringste Variabilität in der Spitzenlatenz bei Tieren. Daher wurde dieser Peak verwendet, um die Hörschwellenempfindlichkeit zu schätzen. ABR-Schwellenwerte wurden als die niedrigste Reizintensität definiert, die einen identifizierbaren und wiederholbaren Wellenform-Peak auslöste. Dies wurde vom Experimentator subjektiv bestimmt und von einem zweiten Experimentator auf Schwellenwertübereinstimmung überprüft. Peaks waren besser definiert und leichter zu identifizieren, wenn Klickreize verwendet wurden, aber Tonausbrüche erzeugten auch definierte und identifizierbare Peaks, die je nach Reizfrequenz und ihren Parametern variierten (Abbildung 1D, n = 4 Küken). Die klickbeschworene ABR-Schwelle war niedriger als die Tonexplosionsschwelle, mit Ausnahme von 1000 Hz. Die Schwellenwerte variierten zwischen 10-30 dBSPL für Klickreize. Klick-evozierte ABRs, die keine identifizierbaren Spitzen &gt;30 dBSPL zeigten, waren oft das Ergebnis der Verdrängung des Spekulums aus dem Gehörgang aufgrund von Tierbewegungen.
Verminderte Körpertemperatur erhöht ABR-Latenzen Es ist bekannt, dass die Geschwindigkeit der neuronalen Aktivität - gemessen am Spitzenvorkommen einer Wellenformamplitude (d. h. Latenz) - bei niedrigeren Körpertemperaturenabnimmt 36,37. Dieses Phänomen wurde bei Hühner-ABRs mit einem 75 dBSPL-Klickreiz beobachtet. Eine repräsentative Ablaufverfolgung ist in Abbildung 2A dargestellt. Als die Körpertemperatur von 39 ° C abnahm, trat die Latenz der ABR-Spitzen trotz der gleichen Reizintensität später in der Zeit auf. Abbildung 2B zeigt die Latenz der Wellen I und III als Funktion der niedrigeren Körpertemperaturen für die repräsentative Spur. Es gab eine starke Korrelation (R2 = 0,89) zwischen niedrigeren Körpertemperaturen und dem Auftreten von Wave I Peak Latenz (Abbildung 2C, n = 5 Küken). Diese Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit, während ABR-Aufnahmen eine nahezu normale Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Wenn die nahezu normale Körpertemperatur nicht aufrechterhalten wird, sind Latenzintensitätsfunktionen und Amplitudenmessungen des ABR sehr variabel und oft ungenau.
Latenz- und Amplitudenunterschiede bei frühen Jungtieren Die Forschung hat gezeigt, dass die neuronale Aktivität im Zusammenhang mit dem Einsetzen des Gehörs für das Küken im späten Embryonalalterim Alter von 8 Jahren kurz vor der Reifung steht. Für eine Teilmenge sehr früher Jungtiere (&lt;3 h nach dem Schlüpfen) beobachteten wir jedoch eine Spitzenlatenzverschiebung der ABR-Wellenformen (n = 4) als Reaktion auf einen 75 dB SPL-Klickreiz oder evozierte Potentiale waren nicht identifizierbar (n = 2 Küken). Bei 2 jungen Jungtieren konnte kein Tonburst-ABR ausgelöst werden, und die Klickschwellen wurden um 50 dBSPL erhöht. Dies könnte auf ein leitfähiges Problem zurückzuführen sein, bei dem sich noch Flüssigkeit im Gehörgang / in der Mittelohrhöhle des Tieres befindet, oder auf eine unterentwickelte neuronale Komponente. Säugetierstudien haben Schwellenverschiebungen von 50 dB bei Neugeborenen38,39 berichtet. Repräsentative Tiere, die hier verwendet wurden, waren &gt;3 h alt, was auch mit der Länge der Trocknungszeit der Federn zusammenfiel. Abbildung 3A zeigt ABRs, die von jungen (P1, &lt;3 h alt) und älteren Jungtieren (P2) aufgezeichnet wurden. Für die Analyse präsentierten nur 3 junge Jungtiere alle drei ABR-Peaks. Die Spitzenwellenformlatenzen waren signifikant verlängert, und die Wellenformamplituden waren im Vergleich zu älteren Jungtieren leicht reduziert (Abbildung 3B-C).
Referenzelektrodenplatzierung und zweikanalige ABR-Aufnahmen In Abbildung 4 wurde die Platzierung der Referenzelektrode zwischen 2 verschiedenen Stellen modifiziert, führte aber immer noch zu vergleichbaren ABR-Aufnahmen. Ein Vergleich zwischen 75 dBSPL-Klickspuren im selben Tier mit den beiden Referenzelektrodenplatzierungen zeigte minimale Unterschiede in den Peak-to-Trog-Wellenformamplituden und Peak-Wellenformlatenzen (Abbildung 4A). Die Platzierung des Mastoids war methodisch wie bei ABR-Experimenten von Säugetieren, bei denen die Referenzelektrode auf dem Mastoid oder der Pinna platziert wurde. Die Verwendung einer Halsplatzierung für die Referenzelektrode wäre von Vorteil, wenn eine Manipulation oder Operation an beiden Ohren durchgeführt würde. Interessanterweise trat die Peakamplitude der Welle II für die Mastoidplatzierung (rote Spur) 1 ms nach dem Peak der Welle II für die Halsplatzierung (schwarze Spur) auf. Dieser Zeitunterschied spiegelt wahrscheinlich den Ort (die Orte) der neuronalen ABR-Erzeugung relativ zur Elektrodenplatzierung wider.
Unter Verwendung eines Zweikanal-Aufbaus wurden eine aktive Aufzeichnungselektrode (Top-of-Head-Platzierung) und zwei Referenzelektroden (Mastoid-Platzierungen) verwendet, um ABRs für das linke und rechte Ohr zu erhalten (Abbildung 4B). Die Reaktionen zwischen den beiden Ohren waren ähnlich, mit geringfügigen Änderungen der Spitzenamplituden wahrscheinlich aufgrund der Kopfhörerpositionierung. Die Latenz, die sowohl das linke als auch das rechte Ohr äquivalent waren, unterstützte die gleichermaßen gesunde Funktion beider Ohren und Hirnstammhemisphären beim Junghuhn. Die Zweikanal-Aufnahmemontage könnte auch für binaurale ABRs verwendet werden, aber für diese Aufnahmen wären zusätzliche Überlegungen erforderlich.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63477/63477fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Aufnahmen von Jungküken zu Klick- und Ton-evozierten Reizen. (A) Repräsentative ABR-Aufzeichnungen von einem Jungküken (P2) in Abhängigkeit von verschiedenen Reizintensitätsstufen. Drei bis vier positive Peaks in Mikrovolt (μV) können innerhalb von 6 ms nach Stimulusbeginn identifiziert werden (Zeit = 0 ms). Wellen wurden mit römischen Ziffern identifiziert. Die Amplituden von der Spitze bis zum Tiefpunkt nehmen bei niedrigeren Stimulusintensitäten ab. (B) Latenzintensitätsfunktionen der Wellen I und III für die repräsentative Spur unter Buchstabe A. Nur diese Spitzen wurden analysiert, da Welle II typischerweise nicht bei Intensitäten &lt;45 dBSPL beobachtet wurde. (C) Latenz von klickevozierten ABR-Peakwellenformen (n = 43 Küken). Fehlerbalken bezeichnen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). (D) Gemittelte tonevozierte ABRs (schwarze Spuren) für vier Jungküken mit drei verschiedenen Frequenzen. Rote Spuren = Standardfehler des Mittelwerts (SEM) Stimuli = 75 dBSPL. In dieser und den folgenden Abbildungen bezeichnen Fehlerbalken SEM, und das rechte Ohr war das Reizohr. (Ausnahme für Abbildung 4B, wo beide Ohren stimuliert wurden). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/63477fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63477/63477fig02.jpg"> Abbildung 2: Einfluss der Körpertemperatur auf ABR-Aufnahmen. (A) Repräsentative ABR-Aufzeichnungen von einem Jungküken (P2) in Abhängigkeit von der Körpertemperatur. Bei niedrigeren Körpertemperaturen nahmen die Spitzenwellenformlatenzen zu, während die Amplituden von Spitze zu Tal, relativ unverändert blieben. (B) Latenz-Temperatur-Funktion der Wellen I und III für die repräsentativen Spuren unter Buchstabe A. (C) Populationsdaten, die den Zusammenhang zwischen Latenz und Temperaturänderungen für 5 Küken zeigen (p &lt; 0,01, R2 = 0,89). Ein ähnlicher Trend wurde für die Wellen II und III beobachtet (Daten nicht gezeigt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/63477fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63477/63477fig03.jpg"> Abbildung 3: Altersbedingte Unterschiede bei ABR-Aufzeichnungen. (A) Repräsentative ABR-Aufzeichnungen (überlappend) eines repräsentativen Jungkükens bei P2 (schwarze Spur) und P1 (&lt;3 h nach dem Schlüpfen, rote Spur). (B) Spitzenwellenformlatenzen für die Wellen I, II und III als Funktion des Alters. Die Latenzen für die Wellen I-III unterschieden sich signifikant zwischen den Altersstufen (P &lt; 0,05, n = 6 Küken). (C) Peak-to-Trog-Wellenformamplituden der Wellen I, II und III als Funktion des Alters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/63477fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63477/63477fig04.jpg"> Abbildung 4: Elektrodenplatzierung und zweikanalige ABR-Aufnahmen: (A) Repräsentative ABR-Aufnahmen (überlappend) desselben Jungkükens (P2) mit der Referenzelektrode im Hals (schwarze Spur) oder Mastoid (rote Spur). Die aktive Elektrode wurde für beide Elektrodenaufnahmemontagen an der Mittellinie des Schädels platziert. Die Latenz der Wellen I und III und die Amplitude der Wellen I und III sind unter beiden Bedingungen nahezu identisch. Die Latenz von Welle II ist früher, und die Amplitude ist größer für die Elektrode, die im Halsgewebe platziert ist. (B) Zweikanalaufzeichnung unter sequentieller Stimulation des rechten und linken Ohres. Repräsentative ABR-Aufnahmen (überlappend) desselben Jungkükens (P2) mit den Referenzelektroden, die im Mastoid des linken Ohres (blaue Spuren) und des rechten Ohres (rote Spuren) in drei verschiedenen Intensitätsstufen platziert sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/63477fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzungstabelle: Kalibriertabelle für Hühnerschlüpflinge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/Hatchling%20Chicken%20Calibration%20Table.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Wir haben Standardtechniken der auditiven Hirnstammreaktion (ABR) verwendet und sie auf Junghühner angewendet, ein frühreifes Vogelmodell für die auditive Funktion. Das Protokoll beschreibt die Tierpräparation und ABR-Erwerbstechniken im Detail, mit Schritten, die auf andere Vogel- oder Nagetiermodelle übertragen werden können.

Bewertung der auditiven Hirnstammreaktion bei Hühnerschlüpflingen

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dieses Protokoll kombiniert eine klinisch relevante Methodik mit einem etablierten Tierversuchsmodell. Es wird helfen, Fragen zur auditiven Entwicklung und Verfeinerung sowie zu funktionellen Veränderungen des Gehörs nach genetischer Manipulation zu beantworten. Diese Technik ist nicht-invasiv, so dass sie keine Operation erfordert und mit zusätzlichen Experimenten kombiniert werden kann.Außerdem dauert es nur etwa eine Stunde, um aufzutreten. Diese Methode könnte bei jeder kleinen Vogelart angewendet werden. Die vergleichende Physiologie ist also relativ einfach.Die Hühner-ABR kann auch die Wirkung auf das funktionelle Gehör nach genetischer Manipulation bewerten. Beginnen Sie mit dem Erwerb von befruchteten weißen Leghorn-Hühnereiern. Als nächstes inkubieren Sie das Ei bei 38 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von 50% für 21 Tage vor dem gewünschten Testtermin.Sobald das Ei geschlüpft ist, wiegen Sie das Tier, indem Sie es vorsichtig in ein großes Wiegeboot legen. Nach der Anästhesieinjektion das Tier wieder in den Inkubator geben. Überprüfen Sie dann, ob der Hals schlaff ist und kneifen Sie den Zeh des Tieres mit einer Pinzette zusammen.Als nächsten Schritt bestimmen Sie das Geschlecht des Huhns mit seinen Flügelfedern. Später enthaarende Creme mit einem Baumwollspitzenapplikator auf den Kopf- und Halsbereich auftragen, besonders in der Nähe der Ohröffnung für den Vogel. Verwenden Sie nun 70% Isopropylalkohol-Tücher, um Federn, verbleibende Enthaarungscreme und die Haut an Kopf und Hals abzuwischen.Sterilisieren Sie auch die subdermalen Elektroden und die rektale Sonde mit einem 70% Isopropylalkohol-Tuch. Platzieren Sie das Tier in einer schallisolierten und elektrisch abgeschirmten Kammer, um sicherzustellen, dass die Umgebung minimale elektrische und akustische Geräusche für die besten Aufnahmen aufweist. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur des Tieres aufrechtzuerhalten.Setzen Sie nun die rektale Sonde ein und fixieren Sie den Kopf des Tieres oder legen Sie den Schnabel gegen einen Gegenstand, um unerwünschte Bewegungen zu vermeiden. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Temperaturkontrollkammer die Temperatur des Tieres zwischen 37 und 41 Grad Celsius hält. Verwenden Sie drei Edelstahl-, Silberchlorid-Nadelelektroden als Referenz-, Aktiv- und Common-Ground-Elektroden.Legen Sie jede Elektrode subdermal zwei bis drei Millimeter in den Kopf, aber nicht tief genug, um den Schädel zu durchdringen, und stecken Sie dann die Elektrode aus der Haut und legen Sie die Spitze frei. Für die einkanalige Aufnahme platzieren Sie die aktive Elektrode über dem Schädel an der Mittellinie so weit kaudal wie der Gehörgang. Platzieren Sie die Referenzelektrode hinter dem Ohr, wo der Reiz abgegeben wird, und platzieren Sie die Bodenelektrode hinter dem kontralateralen Ohr im Nacken.Überprüfen Sie nun die Elektrodenimpedanz. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtimpedanz der Elektrode fünf Kilo Ohm nicht überschreitet. Halten Sie auch die Interelektrodenimpedanz unter drei Kilo Ohm.Achten Sie bei ABR-Aufnahmen je nach Erfassungshardware und -software darauf, die richtigen Schallpegel über die verwendeten Reizfrequenzen hinweg zu kalibrieren. Bewegen Sie nun den Schallwandlerapparat in Richtung des aktiven Ohres des Tieres und platzieren Sie ihn in einer geringen Tiefe von zwei Millimetern im Gehörgang. Überprüfen Sie schließlich das Tier während des Tests.Wenn die Ergebnisse abnormal aussehen oder fehlen, positionieren Sie den Schallwandler im Gehörgang neu. Öffnen Sie zunächst die Software, um ABR-Aufnahmen zu erfassen. Legen Sie die oberen und unteren Grenzwerte für die Artefaktabweisung auf etwa 25 Mikrovolt fest, sodass Tiere, Bewegungen oder Geräusche während eines Sweeps diesen Sweep von der Analyse ausschließen.Sammeln Sie mindestens 1024 Sweeps, um eine große durchschnittliche Antwort zu erhalten, die in zwei Aufzeichnungen von jeweils 512 Sweeps durchgeführt werden kann. Dies stellt sicher, dass die Reaktion ein Reiz ist, der hervorgerufen und wiederholbar ist. Stellen Sie in den Verstärkereinstellungen der Software die Verstärkung auf 100.000, den Tiefpassfilter auf 3.000 Hertz und den Hochpassfilter auf 100 Hertz ein.Stellen Sie die Stimulus-Präsentationsrate zwischen 10 und 20 Stimuli pro Sekunde und die Zeitdauer des Klick-Stimulus auf 100 Mikrosekunden ein. Stellen Sie als Nächstes die Abtastrate auf 40 Kilohertz, 25 Mikrosekunden für die Daten mit der besten Auflösung ein und stellen Sie die Reizpolarisation auf abwechselnd ein. Wenn Sie 512 Sweeps aufzeichnen, kombinieren Sie zwei separate Tests, um einen Sweep-Durchschnitt von 1.024 zu erstellen, und fahren Sie mit der Aufzeichnung bei niedrigeren und niedrigeren Intensitäten fort, bis das evozierte Potenzial nicht mehr identifiziert werden kann.Senken Sie die Stimulusintensität um Schritte von fünf Dezibel Schalldruckpegel, um die niedrigste Reizintensität zu finden, die eine hervorgerufene Reaktion hervorruft. Definieren Sie den ABR-Schwellenwert als die niedrigste Reizintensität, die eine nachweisbare evozierte Reaktion hervorruft. Stellen Sie nach dem Einschläfern und Enthaupten des Tieres und des Experiments durch Reinigen des Heizkissens, der Rektalsonde und der Silberchloridelektroden mit 70% Isopropylalkoholtüchern sicher, dass alle erworbenen Spuren gespeichert wurden.Diese Abbildung stellt die Klick-ABR dar. Die Spitzenlatenz der Welle I stieg um etwa 0,3 Millisekunden pro 20 Dezibel Abnahme der Stimulusintensität. Welle I zeigte auch die größte Peakamplitude und die niedrigste Peak-Latenzvariabilität aller Wellenform-Peaks.Die Grafik zeigt den Tonausbruch, der ABR hervorgerufen hat. Die beste Resonanz wurde bei 1.000 Hertz gesehen. Die Abbildung zeigt, dass, wenn die Körpertemperatur nicht eingehalten wird, die Latenzintensitätsfunktionen des ABR sehr variabel und oft ungenau sind.Die Abbildung zeigt, dass ABRs, die von weniger als drei Stunden alten Jungtieren aufgezeichnet wurden und als P1 bezeichnet werden, Spitzenlatenzen aufweisen, die im Vergleich zu älteren Jungtieren, die als P2 bezeichnet werden, signifikant verlängert und die Spitzenamplituden reduziert haben. Die Abbildung vergleicht 75 Dezibel Schalldruckpegel-Klickspuren im selben Tier mit unterschiedlichen Referenzelektrodenplatzierungen. Die Peakamplitude der Welle II für die Mastoidplatzierung trat eine Millisekunde nach dem Peak der Welle II für die Halsplatzierung auf. Dieser Zeitunterschied spiegelt wahrscheinlich die Orte der neuronalen ABR-Erzeugung relativ zur Elektrodenplatzierung wider.Die Reaktionen zwischen den beiden Ohren waren ähnlich mit geringfügigen Änderungen der Spitzenamplituden wahrscheinlich aufgrund der Kopfhörerpositionierung. Die Latenz des linken und rechten Ohrs, die gleichwertig ist, unterstützt die gleichermaßen gesunde Funktion von Ohren und Hirnstammhemisphären beim Junghuhn. Die richtige Platzierung des Schallwandlers kann zwischen guten und keinen Ergebnissen unterscheiden.Der Hühner-ABR sollte robust sein und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen. Alle Fragen, die durch ABR-Studien an anderen Vogelarten beantwortet werden, können auf das Huhn angewendet werden. Auch die molekularphysiologische Forschung an embryonalen Hühnern kann diese In-vivo-Methodik einbeziehen.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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