Name: Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Lernen Sie die Primärkultur von Rattenastrozyten und Mikroglia für die Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose. Diese Methode ermöglicht die Analyse intrazellulärer Ca²⁺-Signalwege bei neuroinflammatorischen Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und technologische Entwicklung Republik Serbien Vertrag Nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, dem FENS - NENS Education and Training Cluster-Projekt "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" und dem EC H2020 MSCA RISE Grant #778405 unterstützt. Wir danken Marija Adžić und Mina Perić für die Bereitstellung der immunhistochemischen Bilder und Danijela Bataveljić für die Hilfe beim Schreiben von Papieren.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den EU-Richtlinien zum Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit Genehmigung der Ethikkommission der Fakultät für Biologie der Universität Belgrad (Zulassungsnummer EK-BF-2016/08) durchgeführt. Das Patientenmaterial (Seren für IgGs) wurde für die routinemäßige klinische Untersuchung mit informierter Zustimmung des Patienten gemäß dem Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) für Experimente am Menschen gesammelt. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission des Klinischen Zentrums Serbiens genehmigt (Nr. 850/6).
1. Vorbereitung der primären Zellkultur
<ol><li>Isolierung von Hirngewebe HINWEIS: Die Isolierung sollte auf Eis mit eiskalten Lösungen durchgeführt werden.<ol><li>Verwenden Sie neugeborene Welpen im Alter von 1-3 Tagen für die primäre neonatale Zellkultur33. HINWEIS: Für die hier vorgestellte Studie wurden Sprague Dawley hSOD1G93A und nicht-transgene Ratten verwendet. Für die Genotypisierung wurden Rattenschwänze für die spätere DNA-Extraktion und PCR verwendet.</li>
		<li>Bestreuen Sie den Kopf des Welpen mit 70% Ethanol und enthaupten Sie ihn sofort schnell mit einer Schere.</li>
		<li>Schneiden Sie die Haut mit einer kleinen Schere auf, um den Schädel freizulegen. Öffnen Sie den Schädel, indem Sie einen Schnitt vom Foramen magnum in Richtung der Orbita machen. Als nächstes machen Sie einen senkrechten Mittellinienschnitt. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie es in eine Petrischale, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält. HINWEIS: Reinigen Sie die Werkzeuge zwischen den Welpen, um eine Kreuzkontamination zwischen transgenen und nicht-transgenen Welpen zu vermeiden. Die Isolierung der Kortices vom Rest des Gehirns sollte unter einem Stereomikroskop erfolgen.</li>
		<li>Reißen Sie mit der Spitze der Pinzette die Verbindungen zwischen beiden Hemisphären. Trennen Sie dann die Hemisphären mit einer gekrümmten Pinzette, indem Sie eine Halbkugel vorsichtig von der Mitte zur Seite schieben.</li>
		<li>Entfernen Sie die Hirnhäute, indem Sie sie vorsichtig mit geraden und gebogenen Pinzetten zerreißen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Hippocampus, indem Sie ihn mit einer gebogenen Pinzette kneifen. Verwerfen Sie den Hippocampus oder verwenden Sie ihn für ein anderes Zellkulturpräparat. HINWEIS: Weitere Schritte sollten unter der Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Gewebehomogenisierung und Dissoziation<ol><li>Übertragen Sie einen Kortex in eine 15-ml-Röhre, die mit 3 ml kaltem PBS gefüllt ist. Pipeten Sie die Aufhängung mit einer 1-ml-Spitze auf und ab und absolvieren Sie 10-15 Hübe, bis die Aufhängung homogen wird. HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig, um in diesem Prozess keine Blasen zu erzeugen.</li>
		<li>Bei 500 × g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml kaltem PBS, indem Sie es mit einer 1-ml-Spitze auf und ab pipettieren. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. HINWEIS: Alle ab diesem Zeitpunkt verwendeten Lösungen sollten auf 37 °C vorgewärmt werden.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml komplettem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin). Das Homogenat in ein 2 mL Röhrchen überführen.</li>
		<li>Führen Sie das Homogenat durch 21 G und 23 G Nadeln (jeweils dreimal), um eine Suspension aus einzelnen Zellen herzustellen. HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig, um in diesem Prozess keine Blasen zu erzeugen.</li>
	</ol></li>
	<li>Gießen Sie die aus einem Kortex hergestellte Zellsuspension in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm oder einen T25-Kolben (wobei die Oberfläche mit einer Polypeptidbeschichtung für das Wachstum adhärenter Zellen vorbehandelt ist), die 3 ml vollständiges DMEM enthält. Die Petrischale leicht schütteln, damit die Suspension gleichmäßig verteilt ist.</li>
	<li>Züchten Sie die Zellen im Inkubator in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2/95% Luft bei 37 °C.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium 48 h nach der Isolierung und ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage.</li>
	<li>Um das Wachstum von Astrozyten zu fördern, waschen Sie sie, wenn Zellen eine Konfluenz von 70% -80% erreichen, mit vorgewärmtem PBS, um die lose anhaftenden Gliazellen und Spuren von FBS im Medium zu entfernen.<ol><li>Trypsinisieren Sie die darunter liegende Schicht von Astrozyten durch Zugabe von 1 ml vorgewärmter Trypsinlösung (0,25% Trypsin, 0,02% EDTA in PBS, steril gefiltert).</li>
		<li>Die Schale bei 37 °C für 2-5 min in den Inkubator stellen.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn sie sich zu lösen beginnen, fügen Sie 4 ml vollständiges DMEM hinzu.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
		<li>Replaten Sie die Zellen bei einer Dichte von 104 Zellen /cm2 in 5 ml frischem komplettem DMEM.</li>
	</ol></li>
	<li>Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage. Um das Vorhandensein anderer Gliazelltypen zu minimieren, waschen Sie die Zellen nach Erreichen von 50% Konfluenz und vor jedem Medienaustausch mit vollständigem DMEM.<ol><li>Das überstehende Medium mit einer 1 ml Pipette absaugen und mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht dosieren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Zellschicht während dieses Waschschritts bedeckt ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Sobald die Zellen einen Zusammenfluss von 80% erreicht haben (normalerweise nach 14 Tagen), wiederholen Sie die Trypsinisierung und die Entnahme von Astrozyten wie in Schritt 1.6 beschrieben.</li>
	<li>Samen 5 × 103 von Astrozyten auf einem 7 mm kreisförmigen Glasdeckglas, beschichtet mit Poly-L-Lysin (50 μg/ml). Verwenden Sie sie in Experimenten nach 48 h.</li>
	<li>Um Mikroglia zu fördern, lassen Sie nach Schritt 1.7 die Gliazellen eine konfluente Schicht34 erreichen. Wenn Mikrogliazellen auf der Astrozytenschicht erscheinen (nach 10-15 Tagen, erkennbar an ihren kleineren, ovaleren Körpern und kürzeren Prozessen), schütteln Sie die Petrischale auf einem Orbitalschüttler für 2 h bei 220 U / min.</li>
	<li>Dispergieren und Aussaaten von Mikrogliazellen<ol><li>Waschen Sie die abgelösten und lose anhaftenden Zellen leicht, indem Sie das überstehende Medium mit einer 1-ml-Pipettenspitze ansaugen und mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht aufsaugen. Achten Sie darauf, während dieses Waschschritts die gesamte Oberfläche der Zellschicht zu bedecken, das Medium mit den abgelösten Zellen zu sammeln und in ein 15-ml-Röhrchen zu überführen.</li>
		<li>Bei 500 × g 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Medium.</li>
		<li>Führen Sie die Zellsuspension durch eine 21-G-Nadel, um eine einzellige Suspension zu erhalten. HINWEIS: Die meisten veröffentlichten Methoden verwenden Trypsin oder Papain, um das Gewebe zu dissoziieren; 21 G-Nadeln haben jedoch den Vorteil, dass sie die Überverdauung von Zellen verhindern und eine sanftere Dissoziation ermöglichen.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Seed 5 × 103 Mikrogliazellen auf einem 7 mm großen kreisförmigen Glasdeckglas, beschichtet mit Poly-L-Lysin (50 μg/ml). Verwenden Sie sie in Experimenten nach 48 h. HINWEIS: Es ist schwierig, eine reine Mikrogliakultur durch Schütteln zu erhalten, da die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Astrozyten je nach Erfahrung des Experimentators noch in variabler Anzahl vorhanden sein können. Das immunzytochemische Protokoll, das zur Abschätzung des Vorhandenseins verschiedener Zellpopulationen in Gliakulturen verwendet wird, wurde an anderer Stelle beschrieben35.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Immunzytochemie
<ol><li>Spülen Sie die auf Deckgläsern plattierten Zellen in PBS, 2 x 1 min.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen in 4% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Waschen in PBS 3 x 5 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie in einer Blocklösung, die 10% normales Eselserum (NDS)/1% Rinderserumalbumin (BSA)/0,1% Triton X-100 für 45 min bei RT enthält.<ol><li>Fügen Sie 50 μL einer Blocklösung pro Deckglas mit einem Durchmesser von 10 mm hinzu.</li>
	</ol></li>
	<li>Primäre Antikörper in 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 in den folgenden Verdünnungen herstellen: Maus-Anti-GFAP 1:300, Ziegen-Anti-Iba1 1:500. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern über Nacht bei +4 °C.</li>
	<li>Spülen in PBS, 3 x 10 Min.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit den sekundären Antikörpern, die mit einem Fluorophor konjugiert sind: Esel-Anti-Maus (Anregung 488 nm [1:200])) oder Esel-Anti-Ziege (angeregt bei 647 nm [1:200)). Inkubieren Sie die Zellen für 2 h bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen in PBS, 7 x 5 Min.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:4.000) für 10 min bei RT.</li>
	<li>Waschen in PBS 5 x 5 min.</li>
	<li>Montieren Sie die Deckgläser mit einer Montagelösung auf Objektträgern; Verwenden Sie einen Tropfen davon pro Deckglas. HINWEIS: Antikörperverdünnungen können je nach Hersteller variieren. Anwender müssen optimale Verdünnungen für ihre Experimente bestimmen.</li>
</ol>3. Zeitraffer-Video-Imaging
HINWEIS: Lösungen, die den Fluoreszenzfarbstoff enthalten, sollten vor direktem Licht geschützt werden. Bevor Sie mit dem bildgebenden Experiment beginnen, stellen Sie sicher, dass sich das Glasdeckglas beim Einschalten der Perfusion nicht bewegt.
<ol><li>Herstellung von Lösungen und Zellen<ol><li>Extrazelluläre Lösung (ECS) für die Bildgebung vorbereiten: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose und 10 mM HEPES. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität 280-300 mOsm/kg beträgt und bereiten Sie ECS ohne Ca2+ vor: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose, 10 mM HEPES und 0,1 mM EGTA.</li>
		<li>Bereiten Sie die Testlösungen vor: 100 μM ATP gelöst in ECS, 1 μM Thg in ECS ohne Ca2+ und 0,1 mg/ml ALS IgG in ECS8.</li>
		<li>Ein Deckglas mit ECS in eine Schale geben, um das komplette DMEM auszuwaschen. Die Farbstoffbeladungslösung wird hergestellt, indem 1 mM Stammlösung von Fluo-4 AM mit ECS auf die Endkonzentration von 5 μM Fluo-4 AM verdünnt wird.<ol><li>Legen Sie das Deckglas mit Zellen für 30 min bei RT im Dunkeln in die Farbstoffladelösung. Waschen Sie die Zellen 20 min in ECS.</li>
		</ol></li>
		<li>Wenn die Zellen nicht ausreichend belastet sind (d. h. wenn der basale Fluoreszenzpegel zu niedrig ist <5% des Dynamikumfangs der Kamera bei einer Belichtungszeit von mehr als 400 ms), erhöhen Sie die Ladezeit auf bis zu 45 min bis 1 h bei 37 °C. Alternativ kann die Fluo-4 AM-Stammlösung mit einem gleichen Volumen von 20% (w/v) Reinigungsmittel (Pluronic) in DMSO gemischt werden, bevor sie in ECS verdünnt wird, wobei die endgültige Pluronic-Konzentration ~0,02% beträgt. HINWEIS: Die experimentellen Beispiele dieser Studie wurden mit humanem IgG durchgeführt, das aus Blutseren von ALS-Patienten isoliert wurde, wie zuvorbeschrieben 4,5,11. Jedes Experiment wurde mit IgG-Proben eines einzelnen Patienten durchgeführt.</li>
	</ol></li>
	<li>Video-Imaging HINWEIS: In diesem Protokoll wurde das Video-Imaging-System mit einer Xenon-Kurzbogenlampe, einem Polychromatorsystem und einem inversen Epifluoreszenzmikroskop kombiniert, das mit Wasser-, Glycerin- und Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Die Zeitrafferaufnahmen wurden mit einem Digitalkamerasystem durchgeführt.<ol><li>Schalten Sie die Komponenten des Bildgebungsaufbaus 15 Minuten vor dem Experiment ein, damit das System die Arbeitstemperatur erreichen kann.</li>
		<li>Legen Sie das Deckglas mit 1 mL Arbeitslösung (ECS oder ECS ohne Ca2+) in die Aufnahmekammer.</li>
		<li>Um das richtige Bildgebungsprotokoll auszuwählen, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und wählen Sie im Erfassungsbereich die Filterpaare für Fluo4-AM mit einer Anregungswellenlänge bei 480 nm, einem dichroitischen Spiegel bei 505 nm und einer Emissionswellenlänge bei 535 nm aus.</li>
		<li>Wählen Sie das Sichtfeld und achten Sie darauf, dass während des gesamten Experiments eine konsistente Anzahl von Zellen vorhanden ist. Stellen Sie die Belichtungszeit und die Detektorverstärkung entsprechend ein, so dass das Signal nicht gesättigt wird. Wählen Sie den Pseudofarbmodus für die Erfassung. Ausführlichere Anweisungen finden Sie im Handbuch des Herstellers.</li>
		<li>Stellen Sie die Abtastrate auf 1 Hz (1 Bild pro Sekunde) ein.</li>
		<li>Beginnen Sie die Bildgebung, indem Sie den basalen Fluoreszenzspiegel für 3-5 min für die Baseline-Bestimmung (F0) erfassen. Stellen Sie einen konstanten Fluss der Arbeitslösung sicher.</li>
		<li>Stoppen Sie den Fluss der Arbeitslösung und wechseln Sie für die gewünschte Zeit zur Testlösung (siehe auch Zeitbalken in den Beispielen von Abbildung 2 und Abbildung 3). Zwischen den einzelnen Testlösungen die Zellen mit einem konstanten Fluss der Arbeitslösung für 3-5 min waschen.</li>
		<li>Halten Sie das Lösungsvolumen in der Aufnahmekammer bei ~1 ml, indem Sie eine konstante Absaugung von der Oberseite der Lösung veranlassen (siehe Abbildung 2E). HINWEIS: Um die Behandlung direkt auf die abgebildeten Zellen anzuwenden, wurde ein kundenspezifisches Abgabesystem aus einer Glaspipette (0,8 mm Innendurchmesser) ~350 μm entfernt und ~1 mm über den Zellen in einem Winkel von 45° positioniert, kombiniert mit dem Lösungsaustauschsystem mit Quetschventilen und einer elektronischen Ventilsteuerung (siehe Abbildung 2E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>Definieren Sie eine Region of Interest (ROI), die der einzelnen Zelle entspricht.<ol><li>Wählen Sie den Rahmen mit der höchsten Signalintensität (d. h. aus der Anwendung von ATP) und umgeben Sie eine Zelle mit dem Polygonal Tool. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zellen im erfassten Feld. Wählen Sie mit dem Kreiswerkzeug fünf ROIs im Hintergrund aus.</li>
		<li>Um die mittlere Signalintensität einer einzelnen Zelle und den Hintergrund für jeden Zeitraum zu messen, wählen Sie alle ROIs aus und verwenden Sie den Befehl Multi Measure im ROI Manager in ImageJ oder einen gleichwertigen Befehl in kommerzieller Software (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
	<li>Exportieren Sie die mittleren Signalintensitätswerte der ROIs als Tabelle.</li>
	<li>Durchschnittlich fünf Hintergrund-ROIs und subtrahieren Sie den gemittelten Hintergrund jedes Frames von der mittleren ROI-Intensität des gleichzeitig erfassten Frames.</li>
	<li>Um die erhaltenen Daten auf das Basisliniensignal zu normalisieren, verwenden Sie Gleichung (1): ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1) wobei F die Signalintensität jedes Zeitrahmens nach Hintergrundsubtraktion und F0 die Basislinie Fluo-4-Fluoreszenz ist. HINWEIS: In dieser Studie wurde ein benutzerdefinierter Code verwendet.</li>
	<li>Um die Calciumaktivität zu analysieren, bestimmen Sie mehrere Parameter4: die Amplitude des Calciumpeaks (ΔF/F 0), die integrierte Änderung (Zeitintegral, Oberfläche unter der Antwortaufzeichnung) des Calciumtransienten (ΔF/F 0 × s), die Zeit bis zur Spitze vom Beginn der Stimulation bis zum Maximum des Kalziumtransienten (s), die Anstiegszeit vom Beginn der Stimulation bis zum Wert von ΔF/F 0 Das erreicht 50% -80% der maximalen Amplitude (s), halbe Breite voller Breite eines Transienten bei halbmaximaler Amplitude (s), Frequenz der Antworten, wenn sie sich wiederholen (Hz).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

In diesem Artikel wird die Methode der primären Zellkultivierung als schnelles und "budgetgerechtes" Werkzeug zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Zell(patho)physiologie wie ALS im hSOD1G93A-Modell der Ratte vorgestellt. Die Technik eignet sich daher für Studien auf Einzelzellebene, die auf einer höheren Organisationsebene (d.h. in Gewebeschnitten oder in einem lebenden Tier) extrapoliert und weiter untersucht werden können. Die Zellkultivierung als Technik hat jedoch einige Vorbehalte. Es ist am wichtig...

Zellkulturtechniken haben zu zahlreichen Fortschritten in verschiedenen Bereichen der zellulären Neurophysiologie in Gesundheit und Krankheit geführt. Insbesondere primäre Zellkulturen, frisch isoliert aus dem neuronalen Gewebe eines Labortieres, ermöglichen es dem Experimentator, das Verhalten verschiedener Zellen in verschiedenen biochemischen Medien und physiologischen Setups genau zu untersuchen. Die Verwendung verschiedener fluoreszierender physiologischer Indikatoren wie der Ca2+-sensitiven Farbstoffe in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ermöglicht einen besseren Einblick in die zellulären biophysikalischen und biochemischen Prozesse in Echtzeit.
ALS ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung, die obere und untere Motoneuronen betrifft1. Die Krankheit hat eine komplexe Pathogenese des familiären Typs, aber meist der sporadischen Form (90% der Fälle)2. Es ist bekannt, dass nicht-zellautonome Mechanismen zur ALS-Pathophysiologie beitragen, vor allem aufgrund der essentiellen Rolle von Gliazellen3. ALS ist auch gut als neuroinflammatorische Erkrankung mit Beteiligung von humoralen und zellulären Faktoren der Entzündung charakterisiert.
Immunglobulin G wird häufig als molekularer Marker bei ALS und anderen neurodegenerativen Erkrankungen verwendet. Die Untersuchung des Serumspiegels dieses Markers kann auf das Vorhandensein und Stadium der Neuroinflammation bei der Krankheit 4,5,6 hinweisen, während seine Anwesenheit in der Zerebrospinalflüssigkeit auf eine Verletzung der Blut-Hirn-Schranke 7 hinweisen kann. IgGs wurden auch als Ablagerungen in den Rückenmarks-Motoneuronen von ALS-Patienten identifiziert7. Dennoch hat dieser Ansatz einige Inkonsistenzen in der Korrelation des IgG-Spiegels mit dem Stadium und den Merkmalen der Krankheit gezeigt6.
Aus den Seren von ALS-Patienten isoliertes IgG (ALS-IgG) kann eine Kalziumreaktion in naiven Astrozyten8 und eine Glutamatfreisetzung in Neuronen induzieren, was auf eine exzitotoxische Wirkung hinweist - ein Kennzeichen der ALS-Pathologie9. Studien am HSOD1G93A ALS-Rattenmodell (das mehrere Kopien der menschlichen SOD1-Mutation10 enthielt) zeigten jedoch eine Reihe von Markern für oxidativen Stress in kultivierten Neurogliazellen11, Geweben 12,13,14 oder lebenden Tieren 13. Es ist bemerkenswert, dass die aus dem ALS-Rattenmodell gezüchteten Astrozyten anfälliger für oxidativen Stress waren, der durch Peroxid induziert wurde, als die Astroglia aus nicht-transgenen Wurfgeschwistern11.
Mikrogliazellen in Kultur sind weniger offensichtlich von ALS-IgG betroffen. Eine BV-2-Mikrogliazelllinie zeigte nämlich einen Anstieg des Signals von fluoreszierenden Markern für oxidativen Stress als Reaktion auf die Anwendung von nur 4/11 ALS-IgG-Patientenproben15. Es ist bekannt, dass Mikroglia an vielen neuroinflammatorischen Pathologien beteiligt sind, was zu oxidativem Stress und der späten Progressionsphase im nicht-zellautonomen Mechanismus von ALS16,17 beiträgt. Dennoch zeigten die Daten mit ALS-IgGs, dass diese Zellen möglicherweise nicht so reaktiv sind wie Astrozyten auf diese humoralen Faktoren der ALS-Entzündung. Mehrere Studien wurden mit primären Astrozyten aus ALS-Mausmodellen durchgeführt, nicht nur bei Welpen, sondern auch bei symptomatischen Tieren, entweder am Gehirn oder am Rückenmark 18,19,20,21. Dies gilt auch für mikrogliale Primärkulturen, wenn auch in geringerem Maße als Astrozyten und meist aus Hirnregionen im embryonalen Stadium22,23,24.
Wir verwenden Zeitraffer-Videoaufnahmen von Ca2+ auf Zellen in Kultur hauptsächlich als Mittel, um intrazelluläre Transienten dieses Ions als physiologischen Marker für Exzitotoxizität zu verfolgen. So kann der Forscher durch biophysikalische Charakterisierung dieser Transienten (Amplitude, Fläche unter Transienten, Anstiegszeit, Frequenz) experimentelle diagnostische Parameter aus verschiedenen zellulären Modellen der Neurodegeneration erhalten. Diese Technik bietet somit den Vorteil einer quantitativen physiologischen Bewertung von IgGs als Krankheitsbiomarker. Es gibt eine große Menge an Literatur über die Rolle von IgGs und Ca2+ bei der Induktion von ALS. Die meisten dieser Studien wurden durchgeführt, indem ALS induziert wurde, indem Patienten-IgGs in Versuchstiere injiziert wurden 25,26,27,28,29, die dann intrazelluläre Ca 2+-Erhöhung und IgG-Ablagerungen zeigten. Eine Reihe von Studien untersuchte die Wirkung von ALS-IgGs auf die motorische Synapse in vitro30,31,32. Im obigen Kontext legt die hier vorgestellte Technik den Fokus auf die Gliazellen als wichtige Akteure im nicht-zellautonomen Mechanismus der ALS und quantifiziert ihre mögliche exzitotoxische Reaktion auf IgGs als humorale Faktoren der Neuroinflammation. Dieser Ansatz kann eine breitere Anwendung beim Testen anderer humoraler Faktoren wie ganze Seren, Liquor oder Zytokine in verschiedenen Zellkultursystemen und in zellulären Modellen allgemeiner Entzündungen haben.
Dieser Artikel beschreibt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden können und wie diese Zellen weiter verwendet werden können, um die ALS-Pathophysiologie mit Patienten-Seren-abgeleitetem IgG zu untersuchen. Protokolle sind detailliert für die Farbstoffbeladung von kultivierten Zellen (Abbildung 1) und die Aufzeichnungen von Ca2+ Änderungen in Zeitraffer-Video-Imaging-Experimenten. Beispiele für Videoaufnahmen zeigen, wie Gliazellen auf ALS-IgG im Vergleich zu ATP reagieren, wobei letzteres purinerge Membranrezeptoren aktiviert. Zum ersten Mal wird ein Beispiel gezeigt, wie aus dem HSOD1G93A ALS-Rattengehirn isolierte Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen mit einer ausgeprägteren Ca 2+-Reaktion auf ALS-IgG reagieren und wie dieser Prozess mit den Unterschieden im Ca2+-Speicherbetrieb in Beziehung gesetzt werden kann. Ebenfalls gezeigt wird ein Beispiel für die Kalziumbildgebung in Mikrogliazellen, die akut mit ALS IgG herausgefordert wurden, mit nur einer bescheidenen Reaktion von intrazellulärem Kalzium.

<table><tbody><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Röhrchen</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>21 G Nadel</td><td>Nipro, Japan</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>23 G Nadel</td><td>Nipro, Japan</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritze</td><td>Nipro, Japan</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>6 mm rundes Glasdeckglas</td><td>Menzel Glasser, Deutschland</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischale</td><td>ThermoFisher Sientific, USA</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Esel-Anti-Ziege AlexaFluor 647 IgG-Antikörper</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus AlexaFluor 488 IgG-Antikörper</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>" evolve"-EM 512 Digital Camera System</td><td>Photometrics, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi ImageJ Software</td><td>Open source unter der GNU General Public Licence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-Filterset</td><td>Chroma Technology Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Iba1</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, Frankreich</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>HighSpeed Solution Exchange System</td><td>ALA Scientific Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matlab-Software</td><td>Math Works, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-GFAP</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselsserum</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin und Streptomycin</td><td>ThermoFisher Sientific, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Carlo Erba Reagenzien, Spanien</td><td>471686</td><td></td></tr><tr><td>Shaker DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Tocris Bioscience, Großbritannien</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Vapro Dampfdruck-Osmometer 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiFluor Imaging System</td><td>Visitron System Gmbh, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiChrome Polychromator System</td><td>Visitron System Gmbh, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView Hochleistungs-Setup</td><td>Visitron System Gmbh, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenon-Kurzbogenlampe</td><td>Ushio, Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primärkulturen von rattenastrozyten und mikroglia und ihre verwendung bei der untersuchung der amyotrophen lateralsklerose

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Dieses Protokoll zeigt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden und wie diese Zellen zur Untersuchung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im hSOD1G93A-Modell der Ratte verwendet werden können. Zuerst zeigt das Protokoll, wie Astrozyten und Mikroglia aus postnatalen Rattenkortikern isoliert und kultiviert werden, und dann, wie diese Kulturen durch Immunzytochemie unter Verwendung des Gliafibrillär-sauren Proteins (GFAP) -Markers von Astrozyten und des ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba1) Mikrogliamarkers charakterisiert und getestet werden. Im nächsten Schritt werden Methoden zur Farbstoffbeladung (calciumsensitives Fluo 4-AM) von kultivierten Zellen und die Aufzeichnung von Ca2+ Veränderungen in Videobildgebungsexperimenten an lebenden Zellen beschrieben.
Die Beispiele für Videoaufnahmen bestehen aus: (1) Fällen von Ca2+-Bildgebung von kultivierten Astrozyten, die akut Immunglobulin G (IgG) ausgesetzt waren, das von ALS-Patienten isoliert wurde und eine charakteristische und spezifische Reaktion im Vergleich zur Reaktion auf ATP zeigte, wie im selben Experiment gezeigt. Beispiele zeigen auch einen ausgeprägteren vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, hervorgerufen durch ALS-IgG in hSOD1G93A-Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen; (2) Ca 2+ Bildgebung von kultivierten Astrozyten während einer Erschöpfung der Calciumspeicher durch Thapsigargin (Thg), einem nicht-kompetitiven Inhibitor des endoplasmatischen Retikulums Ca 2+ ATPase, gefolgt von einem speicherbetriebenen Calciumeintritt, der durch die Zugabe von Calcium in der Aufnahmelösung hervorgerufen wird, was den Unterschied zwischen dem Ca 2+-Speicherbetrieb in hSOD1G93A und in nicht-transgenen Astrozyten zeigt; (3) Ca 2+-Bildgebung der kultivierten Mikroglia zeigte überwiegend eine mangelnde Reaktion auf ALS-IgG, während die ATP-Anwendung eine Ca2+-Veränderung hervorrief. Dieses Papier betont auch mögliche Vorbehalte und Vorsichtsmaßnahmen in Bezug auf kritische Zelldichte und Reinheit von Kulturen, indem die richtige Konzentration des Ca2+ Farbstoffs und der Farbstoffladetechniken gewählt wird.

Charakterisierung verschiedener Gliazelltypen in Kultur Es dauert normalerweise 15-21 Tage, um Astrozyten für Experimente zu produzieren, während Mikrogliazellen 10-15 Tage brauchen, um zu wachsen. Eine Immunfärbung wurde durchgeführt, um die Zellreinheit der Kultur zu beurteilen. Abbildung 1 zeigt die Expression der Doppelmarkierung des astrozytären Markers GFAP und des Mikrogliamarkers Iba1 in jeweiligen Kulturen.
Es ist bekannt, dass die Kal...

Wir präsentieren hier ein Protokoll zur Vorbereitung von Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus Rattenkortices für die Zeitraffer-Videobildgebung von intrazellulärem Ca2+ für die Erforschung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose im hSOD1G93A-Rattenmodell .

Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, interzelluläre Kalziumsignalmuster aufzudecken, die jede Zelltypreaktion sowohl in der Gesundheit als auch in der Krankheit charakterisieren. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und detaillierte biophysikalische Charakterisierung des komplexen zellulären Verhaltens. Wir planen, diese IgG-induzierte Kalziumsignalisierung als Fingerabdruck für die personalisierte Medizin neuroinflammatorischer Erkrankungen zu nutzen.Im wirklichen Leben ist es nicht einfach, alle Prozesse und Ereignisse zu sehen und zu verfolgen, insbesondere diejenigen, die unter dem Mikroskop ablaufen. Daher sind die visuellen Daten wichtig. Nachdem Sie ein bis drei Tage alte Welpen enthauptet haben, legen Sie den Schädel frei, indem Sie die Haut mit einer kleinen Winkelschere aufschneiden.Öffnen Sie dann den Schädel, indem Sie das Foramen magnum in Richtung der Augenhöhlen schneiden und einen senkrechten Mittellinienschnitt machen. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie es in eine Petrischale mit PBS. Verwenden Sie die Spitze der Pinzette, um die Verbindungen zwischen beiden Hemisphären zu reißen, und trennen Sie die Hemisphären mit gebogenen Pinzetten, indem Sie eine Halbkugel vorsichtig von der Mitte zur Seite drücken.Verwenden Sie gerade und gebogene Pinzetten, um die Hirnhäute zu entfernen, indem Sie sie vorsichtig zerreißen. Entfernen Sie dann den Hippocampus, indem Sie ihn mit einer gekrümmten Pinzette einklemmen und verwerfen oder für eine andere Zellkulturzubereitung verwenden. Als nächstes übertragen Sie den Kortex in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das drei Milliliter kaltes PBS enthält, und homogenisieren das Gewebe, indem Sie 10 bis 15 Mal mit einer Ein-Milliliter-Spitze auf und ab pipettieren.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 g für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter kaltem PBS, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Spitze pipettieren. Zentrifugieren Sie noch einmal und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter komplettem DMEM, ergänzt mit 10% FBS und Antibiotika.Nach dem Transfer des Homogenats in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen wird das Homogenat durch 21- und 23-Gauge-Nadeln geleitet, um eine Suspension aus einzelnen Zellen herzustellen. Gießen Sie die aus einem Kortex hergestellte Zellsuspension in eine 60-Millimeter-Petrischale mit drei Milliliter vollständigem DMEM und schütteln Sie die Petrischale leicht, so dass die Suspension gleichmäßig verteilt ist. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid und 95% Luft bei 37 Grad Celsius.Um das Wachstum von Astrozyten zu fördern, entfernen Sie die alten Medien und waschen Sie die Zelle mit vorgewärmtem PBS, um die lose anhaftenden Gliazellen und Spuren von FBS zu entfernen, sobald sie 70 bis 80% Konfluenz erreicht haben. Dann trypsinisieren Sie die darunter liegende Schicht von Astrozyten, indem Sie einen Milliliter vorgewärmter Trypsinlösung hinzufügen und bei 37 Grad Celsius für zwei bis fünf Minuten inkubieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Zellen zu lösen beginnen, und fügen Sie vier Milliliter vollständiges DMEM hinzu.Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter des vollständigen Mediums.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Als nächstes bereiten Sie die Kulturschale vor und fügen Sie ein Kulturmedium hinzu. Replaten Sie die Zellen bei einer Dichte von 10 bis vier Zellen pro Quadratzentimeter in fünf Milliliter frischem komplettem DMEM und waschen Sie die Zellen vor jedem Medienwechsel mit vollständigem DMEM.Nach Erreichen einer Konfluenz von 70 bis 80% die Trypsinisierung wiederholen und fünf mal 10 bis zum dritten Astrozyten auf einem sieben Millimeter dicken, mit Poly-L-Lysin beschichteten kreisförmigen Glasdeckstreifen säen. Lassen Sie sie 10 Minuten lang anbringen und fügen Sie das vollständige DMEM hinzu. Verwenden Sie sie nach 48 Stunden in Experimenten.Nach der Vorbereitung der Mikrogliakulturen, um Mikroglia zu fördern, lassen Sie die Gliazellen konfluieren, und die Mikroglia erscheinen nach 10 bis 15 Tagen auf der Astrozytenschicht. Schütteln Sie die Petrischale auf einem Orbitalschüttler zwei Stunden lang bei 220 U/min. Waschen Sie nun die abgelösten und lose befestigten Zellen leicht, indem Sie den Überstand mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze absaugen.Verteilen Sie den Überstand mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht und stellen Sie sicher, dass die gesamte Zellschichtoberfläche während dieses Waschschritts bedeckt ist. Sammeln Sie das Medium mit den abgelösten Zellen und übertragen Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen, wie zuvor gezeigt.Säen Sie fünf mal 10 bis zum dritten Mikroglia auf einem sieben Millimeter dicken, mit Poly-L-Lysin beschichteten kreisförmigen Glasdecker. Lassen Sie sie für 10 Minuten anbringen und fügen Sie vollständiges DMEM hinzu. Verwenden Sie sie nach 48 Stunden in Experimenten.Um das komplette DMEM auszuwaschen, geben Sie einen Bezugsbeleg in eine Schale mit extrazellulärer Lösung. Die Farbstoffbeladungslösung wird durch Verdünnen eines Millimolaren Fluo-4 AM mit extrazellulärer Lösung hergestellt, um die Endkonzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen. Legen Sie den Deckkörper mit den Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln in die Farbstoffladelösung und waschen Sie die Zellen 20 Minuten in extrazellulärer Lösung.Legen Sie den Abdeckbeleg mit einem Milliliter Arbeitslösung in die Aufnahmekammer. Wählen Sie das Sichtfeld mit einer konsistenten Anzahl von Zellen während des gesamten Experiments. Beginnen Sie die Bildgebung und bestimmen Sie den Ausgangswert, indem Sie den basalen Fluoreszenzspiegel für drei bis fünf Minuten erfassen.Stoppen Sie dann den Fluss der Arbeitslösung und wechseln Sie für die gewünschte Zeit zur Testlösung. Zwischen jeder Testlösung werden die Zellen drei bis fünf Minuten lang mit einem konstanten Fluss der Arbeitslösung gewaschen. Halten Sie das Lösungsvolumen in der Aufnahmekammer bei einem Milliliter, indem Sie einen konstanten Sog von der Oberseite der Lösung veranlassen.Wählen Sie den Frame mit der höchsten Signalintensität und umgeben Sie eine Zelle mit der Polygonal-Werkzeuganwendung. Nachdem Sie alle Zellen im erfassten Feld eingeschlossen haben, wählen Sie mit dem Kreiswerkzeug fünf interessante Bereiche im Hintergrund aus. Messen Sie dann die mittlere Signalintensität einer einzelnen Zelle und den Hintergrund für jeden Zeitrahmen.Wählen Sie alle gewünschten Regionen aus und verwenden Sie den Befehl Multi-Measure im ROI-Manager in ImageJ oder einen gleichwertigen Befehl in kommerzieller Software. Nach dem Import der Daten in die MATLAB-Software ermitteln Sie durchschnittlich fünf Hintergrund-ROIs und subtrahieren den gemittelten Hintergrund jedes Frames von der mittleren ROI-Intensität der gleichzeitig erfassten Frames. Analysieren Sie später die Kalziumaktivität, indem Sie die Amplitude des Kalziumpeaks, die integrierte Änderung des Kalziumtransienten, die Zeit bis zum Peak, die Anstiegszeit, die halbe Breite und die Frequenz bestimmen.GFAP wird verwendet, um Astrozyten sichtbar zu machen, und Iba1, um Mikroglia sichtbar zu machen. hSOD1G93A-Astrozyten reagieren auf ALS-Immunglobulin G mit einer größeren Amplitude des Kalziumtransienten, einer insgesamt stärkeren integrierten Veränderung und einer kürzeren Zeit bis zum Höhepunkt als nicht-transgene Astrozyten. Die Reaktion auf ALS-Immunglobulin G unterscheidet sich von der Reaktion auf ATP.hSOD1G93A-Astrozyten wiesen einen höheren Gehalt an Kalziumionen in den Speichern auf, was auf eine Überlastung dieses Ions hindeutet. Mikroglia wurden kultiviert, und die mittlere Fluoreszenzintensität wurde im Laufe der Zeit extrahiert. Die Kalziumspuren von drei Zellen zeigten, dass nur eine Zelle auf ALS-Immunglobulin G reagierte, während alle Zellen auf ATP reagierten.Die Pseudofarbbilder stellten die Fluoreszenzintensität und Basislinie als Reaktion auf ALS, IgG und ATP dar. Die Zellen müssen ausreichend belastet und die Parameter des Bildgebungssystems entsprechend angepasst werden, damit das Signal während des Experiments nicht getrennt wird. Zusammen mit der Kalziumemittierung kann eine Patch-Klemmung durchgeführt werden.So kann ein vollständigeres Bild der Korrelation zwischen verschiedenen Membranionenströmen und Calcium-emittierenden Strömen gewonnen werden. Das Verständnis der intrazellulären Kalziumhomöostase ist von essentieller Bedeutung für die Erforschung verschiedener Reaktionen auf natürliche sowie auf stressige und äußere Reize.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier bieten wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung von Ratten kortikalen Neuronen in der Gegenwart eines Glia-Feeder-Schicht. Die kultivierten Neuronen zu etablieren Polarität und erstellen Synapsen, und kann von der Glia für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen, wie zB Elektrophysiologie, Kalzium-Imaging, das Überleben der Zelle Assays, Immunzytochemie und RNA / DNA / Protein-Isolierung getrennt werden.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

Isolieren primären Mikroglia aus der zellulären Heterogenität des Gehirns ist wichtig, um deren Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine mechanische Isolation und gemischten Zellkultur-Technik, die eine hohe Ausbeute und hoher Reinheit liefert, lebensfähigen primären Mikrogliazellen...

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Das Video zeigt eine Technik zur Kultivierung primärer Astrozyten aus der Rattenrinde. Die Hirnrinde wird mechanisch dissoziiert, um eine homogene Gliazellsuspension zu erhalten, die dann auf Polypeptid-beschichteten Platten plattiert wird, um die selektive Proliferation von Astrozyten zu fördern. Anschließend werden die Astrozyten enzymatisch von den Platten dissoziiert und auf frische Medien überführt, was die Kultivierung reiner Astrozyten ermöglicht.

Generierung einer Primärkultur von Astrozyten aus dem Gehirn eines Rattenwelpen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen. Dabei werden Mikroglia von anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen mit Hilfe von Platten getrennt, die mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet sind, der spezifisch für Mikroglia ist.

Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen mit serumfreien Medien

Astrozyten wurden erkannt, vielseitige beteiligten Zellen in grundlegender biologischer Prozesse, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion, und das zentrale Nervensystem Reparatur sein. Hier präsentieren wir ein schnelles Verfahren zur reinen Maus Astrozytenkulturen erhalten, um die Biologie dieser wichtigen Klasse von zentralen Nervensystems Zellen zu untersuchen.

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen handelt pathologischen Veränderungen der Wirbelsäule Gliazellen. Eine zuverlässige Gliazellen Kultursystem aus adulten Rückenmarksgewebe abgeleitet und für diese Zellen in vitro zu studieren fehlt. Deshalb zeigen wir hier, wie primären gemischten Glia-Kulturen von adulten Mausrückenmarksgewebe herzustellen.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ist optimal für die Kultivierung von murinen Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen in eine schnelle, einfache und kostengünstige Weise. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + -Signalisierung, Morphologie und gen Expressionsprofile Astrozyten in Vivoähnlich.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Wir beschreiben eine Methode zur Differenzierung von vom Menschen induzierten pluripotenten Astrozyten und Neuronen des Rückenmarks und deren Kokultur für die elektrophysiologische Aufzeichnung.

Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten und Neuronen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von gereinigten Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtert spätere Anwendungen wie RNA-Analyse und Zellkultur. Es umfasst detaillierte Zelldissoziationsmethoden und -verfahren, die darauf ausgelegt sind, sowohl die Qualität als auch die Ausbeute isolierter Zellen zu verbessern.

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Lernen Sie die Primärkultur von Rattenastrozyten und Mikroglia für die Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose. Diese Methode ermöglicht die Analyse intrazellulärer Ca²⁺-Signalwege bei neuroinflammatorischen Erkrankungen.

Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

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