Name: Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie die 3D-Rekonstruktion von interorganellären Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht zellbiologische Studien zu Organellenmorphologie und Membraninteraktionen.

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Wir danken Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro und Ania Straatman-Iwanowska für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken auch den Stefan-Labormitgliedern und Ian J. White für die hilfreichen Gespräche. J.J.B. wird durch MRC-Mittel für das MRC Laboratory of Molecular Cell Biology am UCL, Award Code MC_U12266B, unterstützt. C.J.S. wird durch MRC-Mittel für das MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit am UCL, Vergabecode MC_UU_00012/6, unterstützt. P.G. wird gefördert durch den Europäischen Forschungsrat, Förderkennzeichen ERC-2013-StG-337057.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Eine zugängliche vEM-Technik zur Visualisierung der Organellenstruktur und -interaktionen in 3D wird in diesem Protokoll beschrieben. Die Morphologie der interorganellen Kontakte in Hepatozyten wird hier als Fallstudie vorgestellt. Dieser Ansatz wurde jedoch auch zur Untersuchung einer Vielzahl anderer Proben und Forschungsbereiche angewendet, darunter Schwann-Zell-Endothel-Interaktionen in peripheren Nerven 45, Weibel-Palade-Körper-Biogenese in Endothelzellen46, Frachtsekretion in Nierenzellen 47...

Seit ihrer Erfindung in den 1930er Jahren haben Elektronenmikroskope es Forschern ermöglicht, die strukturellen Bestandteile von Zellen und Geweben zu visualisieren 1,2. Die meisten Untersuchungen haben 2D-Informationen geliefert, da das Erstellen von 3D-Modellen eine sorgfältige Sammlung serieller Abschnitte, manuelle Fotografie, Negativverarbeitung, manuelle Nachverfolgung und die Erstellung und Montage von 3D-Modellen aus Glas-, Kunststoff- oder Styropor 3,4 erfordert. Fast 70 Jahre später gab es erhebliche Fortschritte in zahlreichen Aspekten des Prozesses, von der Mikroskopleistung, der seriellen Schnittsammlung, der automatisierten digitalen Bildgebung, der ausgefeilten Software und Hardware für die 3D-Rekonstruktion, Visualisierung und Analyse bis hin zu alternativen Ansätzen für das, was heute allgemein als Volume EM (vEM) bezeichnet wird. Es wird allgemein angenommen, dass diese vEM-Techniken ultrastrukturelle 3D-Informationen bei Nanometerauflösungen über Mikrometerskalen liefern und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und neuere Rasterelektronenmikroskopie- (REM) Techniken umfassen. Siehe Bewertungen 5,6,7,8.
Zum Beispiel verwendet der fokussierte Ionenstrahl SEM (FIB-SEM) einen fokussierten Ionenstrahl in einem REM, um die Oberfläche des Blocks zwischen sequentiellen REM-Bildaufnahmen der Blockoberfläche wegzufräsen, was das wiederholte automatisierte Fräsen / Abbilden einer Probe ermöglicht und einen 3D-Datensatz für die Rekonstruktion 9,10 erstellt. Im Gegensatz dazu verwendet serielles Blockgesicht SEM (SBF-SEM) ein Ultramikrotom im REM, um Material von der Blockfläche vor der Bildgebung zu entfernen 11,12, während die Array-Tomographie ein zerstörungsfreier Prozess ist, der die Sammlung von seriellen Abschnitten auf Deckgläsern, Wafern oder Bändern erfordert, bevor ein automatisierter Workflow der Bildgebung des interessierenden Bereichs in sequenziellen Abschnitten im REM eingerichtet wird, um den 3D-Datensatz zu generieren 13 . Ähnlich wie bei der Array-Tomographie erfordert die serielle Schnitt-TEM (ssTEM), dass vor der Bildgebung physikalische Schnitte gesammelt werden. Diese Abschnitte werden jedoch in TEM-Rastern gesammelt und in einem TEM14,15,16 abgebildet. ssTEM kann durch Tilttomographie17,18,19 erweitert werden. Die serielle Neigungstomographie bietet die beste Auflösung in x, y und z, und obwohl sie zur Rekonstruktion ganzer Zellen20 verwendet wurde, ist sie eine ziemliche Herausforderung. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die praktischen Aspekte von ssTEM als der am besten zugänglichen vEM-Technik, die vielen EM-Labors zur Verfügung steht, die derzeit möglicherweise keinen Zugang zu spezialisierten Schnitt- oder vEM-Instrumenten haben, aber von der Generierung von 3D-vEM-Daten profitieren würden.
Die serielle Ultramikrotomie für die 3D-Rekonstruktion wurde bisher als Herausforderung angesehen. Es war schwierig, gerade Bänder mit gleichmäßiger Schnittstärke zu schneiden, in der Lage zu sein, Bänder der richtigen Größe in der richtigen Reihenfolge auf Gittern mit ausreichender Unterstützung anzuordnen und aufzunehmen, aber ohne Gitterbalken, die Bereiche von Interesse verdeckten, und vor allem, ohne Abschnitte zu verlieren, da eine unvollständige Serie eine vollständige 3D-Rekonstruktion verhindern kann21. Verbesserungen an kommerziellen Ultramikrotomen, Diamantschneid- und Trimmmessern 22,23, elektronenluzenten Stützfolien auf Gittern 21,24 und Klebstoffen zur Unterstützung der Schnitthaftung und Bandkonservierung 13,21 sind jedoch nur einige der inkrementellen Fortschritte im Laufe der Jahre, die die Technik in vielen Labors zur Routine gemacht haben. Sobald serielle Abschnitte gesammelt wurden, ist die serielle Bildgebung in TEM einfach und kann EM-Bilder mit Subnanometer-px-Größen in x und y liefern, was eine hochauflösende Abfrage der subzellulären Strukturen ermöglicht - eine potenzielle Anforderung für viele Forschungsfragen. Die hier vorgestellte Fallstudie zeigt die Verwendung von ssTEM und 3D-Rekonstruktion bei der Untersuchung von endoplasmatischen Retikulum (ER)-Organellenkontakten in Leberhepatozyten, wo ER-Organellen-Kontakte zuerst beobachtet wurden25,26.
Während die Notaufnahme an die Kernhülle angrenzt, nimmt sie auch enge Kontakte zu zahlreichen anderen Zellorganellen auf, darunter Lysosomen, Mitochondrien, Lipidtröpfchen und die Plasmamembran27. ER-Organellen-Kontakte wurden mit dem Fettstoffwechsel28, dem Phosphoinositid- und Calcium-Signalsystem29, der Autophagieregulation und der Stressreaktion30,31 in Verbindung gebracht. Die ER-Organellenkontakte und andere interorganelle Kontakte sind hochdynamische Strukturen, die auf zelluläre Stoffwechselbedürfnisse und extrazelluläre Hinweise reagieren. Es wurde gezeigt, dass sie morphologisch in ihrer Größe und Form und den Abständen zwischen Organellenmembranenvariieren 32,33. Es wird angenommen, dass diese ultrastrukturellen Unterschiede wahrscheinlich ihre unterschiedliche Protein-Lipid-Zusammensetzung und Funktionwiderspiegeln 34,35. Es ist jedoch immer noch eine herausfordernde Aufgabe, interorganelle Kontakte zu definieren und zu analysieren36. Daher ist ein zuverlässiges und dennoch einfaches Protokoll zur Untersuchung und Charakterisierung von interorganellen Kontakten für weitere Untersuchungen erforderlich.
Da ER-Organellenkontakte bei der Membran-zu-Membran-Trennung zwischen 10 und 30 nm liegen können, war der Goldstandard für die Identifizierung in der Vergangenheit TEM. Dünnschnittiges TEM hat eine spezifische Subdomänenlokalisation für residente ER-Proteine an verschiedenen Membrankontakten37 aufgedeckt. Traditionell hat dies ER-Organellen-Kontakte mit nm-Auflösung aufgedeckt, aber oft nur eine 2D-Ansicht dieser Wechselwirkungen präsentiert. vEM-Ansätze zeigen jedoch die ultrastrukturelle Darstellung und den Kontext dieser Kontaktstellen in 3D, was eine vollständige Rekonstruktion von Kontakten und eine genauere Klassifizierung von Kontakten (Punkt vs. röhrenförmig vs. zisternalähnlich) und Quantifizierung38,39 ermöglicht. Hepatozyten sind nicht nur der erste Zelltyp, bei dem ER-Organellenkontakte beobachtet wurden25,26, sondern haben auch ein umfangreiches System anderer interorganeller Kontakte, die in ihrer Architektur und Physiologie eine wichtige Rolle spielen 28,40. Eine gründliche morphologische Charakterisierung von ER-Organellen und anderen interorganellen Kontakten in Hepatozyten fehlt jedoch noch. Dementsprechend ist die Art und Weise, wie sich interorganelle Kontakte während der Regeneration und Reparatur bilden und umgestalten, von besonderer Relevanz für die Biologie und Leberfunktion der Hepatozyten.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Spritzenfilter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumschalen</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/Dodecenyl Bernsteinsäureanhydrid</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>Epon Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Diamantmesser</td><td>DiaTOME</td><td>ultra 45°;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>Epon Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette N5</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>Fidschi TrakEM2 Plugin</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>Formaldehyd 36% Lösung</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Beschichtetes Schlitzgitter</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>Alternative: EMS Diasum (FF2010-Cu)</td></tr><tr><td>Glasflasche mit Applikatorstab</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyd 25% Lösung</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/Methyl Nadic Anhydrid</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>Epon Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Osmium Tetroxid 2% Lösung</td><td>TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0050/PB08</td><td></td></tr><tr><td>Wiederverwendbarer Klebstoff</td><td>Blue Tack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Bleicitrat</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>Schnittfleck</td></tr><tr><td>Natriumcacodylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0250</td><td>bis make 0.1 M Caco buffer</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>RS Components</td><td>918-6872</td><td>Cyanacrylat-Kleber, Schritt 1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812 Harz</td><td>TAAB</td><td>T023</td><td>Epon-Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>Gerbsäure</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Zweiteiliges Epoxidharz</td><td>RS Components</td><td>132-605</td><td>Alternativ: Schritt 2.13</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>Vibrierendes Mikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td>100 &micro; m dicke Scheiben, 0,16 mm/s Schneiden bei 1 mm Amplitude.</td></tr><tr><td>Weldwood Original Contact Zement</td><td>DAP</td><td>107</td><td>Kontaktkleber: Schritt 3.1.4</td></tr></tbody></table>

dreidimensionale charakterisierung von interorganellen kontaktstellen in hepatozyten mittels serieller schnittelektronenmikroskopie

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Die Transmissionselektronenmikroskopie gilt seit langem als Goldstandard für die Visualisierung zellulärer Ultrastrukturen. Die Analyse ist jedoch oft auf zwei Dimensionen beschränkt, was die Fähigkeit behindert, die dreidimensionale (3D) Ultrastruktur und die funktionelle Beziehung zwischen Organellen vollständig zu beschreiben. Die Volumenelektronenmikroskopie (vEM) beschreibt eine Sammlung von Techniken, die die Abfrage der zellulären Ultrastruktur in 3D bei mesoskaligen, mikroskaligen und nanoskaligen Auflösungen ermöglichen. 
Dieses Protokoll bietet eine zugängliche und robuste Methode zur Erfassung von vEM-Daten mittels serieller Schnittübertragung EM (TEM) und deckt die technischen Aspekte der Probenbearbeitung bis hin zur digitalen 3D-Rekonstruktion in einem einzigen, unkomplizierten Workflow ab. Um die Nützlichkeit dieser Technik zu demonstrieren, wird die ultrastrukturelle 3D-Beziehung zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien und ihren Kontaktstellen in Leberhepatozyten vorgestellt. Interorganelle Kontakte spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung von Ionen, Lipiden, Nährstoffen und anderen kleinen Molekülen zwischen Organellen. Trotz ihrer ersten Entdeckung in Hepatozyten gibt es jedoch noch viel über ihre physikalischen Eigenschaften, Dynamik und Funktionen zu lernen. 
Interorganellenkontakte können eine Reihe von Morphologien aufweisen, die sich in der Nähe der beiden Organellen zueinander (typischerweise ~ 10-30 nm) und der Ausdehnung der Kontaktstelle (von punktuellen Kontakten bis zu größeren 3D-zisternenartigen Kontakten) unterscheiden. Die Untersuchung enger Kontakte erfordert eine hochauflösende Bildgebung, und der serielle Schnitt TEM eignet sich gut, um die ultrastrukturelle 3D-Struktur von interorganellen Kontakten während der Hepatozytendifferenzierung sowie Veränderungen in der Hepatozytenarchitektur im Zusammenhang mit Stoffwechselerkrankungen zu visualisieren.

Für diese Technik werden interessante Regionen auf der Grundlage des biologischen Forschungsziels ausgewählt und vor dem Trimmen und Schneiden von eingebettetem Gewebe identifiziert. Ebenso kann die Größe der Blockfläche durch die Forschungsfrage diktiert werden; In diesem Fall wurde die Probe so beschnitten, dass eine Blockfläche von etwa 0,3 mm x 0,15 mm übrig blieb (Abbildung 4A). Dies ermöglichte zwei Gitter von 9 seriellen Abschnitten pro Gitter, die 18 serielle Abschnitte lieferten und...

Ein einfaches und umfassendes Protokoll, um dreidimensionale Details von Membrankontaktstellen zwischen Organellen in Hepatozyten aus der Leber oder Zellen in anderen Geweben zu erfassen.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Dieses Protokoll ermöglicht die 3D-Rekonstruktion von Organellen auf einfache und robuste Weise, während es für Labors zugänglich ist, die derzeit nicht über spezielle Volumenelektronenmikroskope verfügen. Diese Technik ist extrem flexibel und bietet eine hervorragende X / Y-Auflösung, während sie bei Bedarf in der Lage ist, Proben erneut abzubilden. Es ist auch mit der Neigungstomographie kompatibel, wenn eine sehr hohe Z-Auflösung erforderlich ist.Diese Technik ermöglicht die Abfrage der Organellenmorphologie im interorganellen Kontext. Daher kann es erweitert werden, um pathologische Zustände mit Organellendefekten zu untersuchen. Dieser Ansatz kann Einblicke in Organelleninteraktionen und zelluläre Handelsereignisse geben.Diese Methode kann neben Hepatozyten auch auf andere Gewebe, Organoidmodelle und Zellkultursysteme angewendet werden. Erstbenutzer können serielle Abschnitte finden und ohne Verlust eine Herausforderung darstellen. Es wird empfohlen, sich mit regelmäßigen ultradünnen Schnitten vertraut zu machen, bevor Sie dieses Protokoll auf eine wertvolle Probe anwenden.Beginnen Sie mit dem sorgfältigen Trimmen des in Harz eingebetteten Gewebes mit einer Rasierklinge, wobei

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

Dieses Protokoll zielt auf bestimmte Zellen im Gewebe für die Bildgebung mit nanoskaligen Auflösung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM). Große Anzahl von Schnittserien aus biologischem Material Harz eingebettet werden zuerst in einem Lichtmikroskop, das Ziel zu identifizieren und dann hierarchisch im SEM abgebildet.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von Maushepatozyten aus erwachsenen Mauslebern mit einer modifizierten Kollagenase-Perfusionstechnik vorgestellt. Ebenfalls beschrieben ist die Langzeitkultur von Hepatozyten in einer 3D-Kollagen-Sandwich-Einstellung sowie die Immunkennzeichnung der zytoskelettalen Komponenten zur Untersuchung der Gallenkanalbildung und deren Reaktion auf die Behandlung.

Isolation und 3D Kollagen Sandwich Kultur der primären Maus Hepatozyten, um die Rolle des Zytoskeletts in Bile Canalicular Formation In Vitro zu studieren

Hier beschreiben wir eine einfache und zugängliche Strategie zur Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeabschnitten. Diese Methode kombiniert vorhandene Bildgebungs- und digitale Analysetechniken mit dem Ziel, die Multiplexing-Fähigkeit und die Multiparameteranalyse von Imaging-Assays zu erweitern.

Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung

Der Bedarf an neuen Ansätzen zur Untersuchung von Membrankontaktstellen (MCS) ist aufgrund des zunehmenden Interesses an der Untersuchung dieser zellulären Strukturen und ihrer Komponenten gestiegen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das bisher verfügbare Mikroskopietechnologien integriert, um intra- und interorganelle Proteinkomplexe, die sich an MCS befinden, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endogener intraorganeller Proteininteraktionen an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen durch Proximity-Ligation-Assays

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt, wie mitochondriale Cristae rekonstruiert werden, um eine 3D-Bildgebung mit hoher Genauigkeit, hoher Auflösung und hohem Durchsatz zu erreichen.

Eine dreidimensionale Technik zur Visualisierung mitochondrialer ultrastruktureller Veränderungen in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebende Pipeline, um die Morphologie hepatischer Stellatenzellen im intakten Lebergewebe zu visualisieren und zu modellieren. Dieser Ansatz kombiniert fluoreszierende Markierung von Fibroblasten mittels Mausgenetik, in situ leberperfusionsbasierte Gewebevorbereitung und eine modifizierte iDISCO-Gewebereinigungsmethode, um optische Transparenz zu erreichen.

Kartierung der Morphologie hepatischer stellater Zellen in Mausmodellen der Leberfibrose

Erfahren Sie die 3D-Rekonstruktion von interorganellären Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht zellbiologische Studien zu Organellenmorphologie und Membraninteraktionen.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

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