Name: Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Lernen Sie einen Reporter-Assay zur Analyse der microRNA-Reifung in Säugetierzellen. Diese Methode untersucht RNA-bindende Proteine mittels Luciferase-Aktivität und ist für verschiedene eukaryotische Zelllinien anwendbar.

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Die Autoren danken E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapur) für die HeLa-Cre-Zellen und pRD-RIPE- und pCAGGS-Cre-Plasmide. Wir danken Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes und Anselmo Moriscot für ihre Unterstützung.

Eine Übersicht über das hier beschriebene Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Plasmidaufbau
<ol><li>pCAGGS-Cre: Dieses Plasmid wurde von Dr. E. Makeyev21 zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Amplifizieren Sie pre-miR-17-92 durch PCR unter Verwendung von 0,5 μM jedes spezifischen Primers (Table of Materials), 150 ng cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR-Puffer und 5 U High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase. Führen Sie eine PCR-Reaktion ohne Schablonenkontrolle durch (verwenden Sie Wasser anstelle von cDNA), um nach DNA-Verunreinigungen zu suchen.</li>
		<li>Ligate das PCR-Produkt in pRD-RIPE (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapore)21 innerhalb des Introns zwischen den EcoRI- und EcoRV-Restriktionsstellen unter Verwendung von DNA-Ligase, wodurch pRD-miR-17-92 entsteht. Bestätigen Sie die Sequenzintegrität durch Sanger-Sequenzierung.</li>
	</ol></li>
	<li>pmiRGLO-RAP-IB<ol><li>Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, flankiert von XhoI/XbaI-Restriktionsstellen und mit einer NotI-Restriktionsstelle im Inneren. Mischen Sie äquimolare Mengen von Vorwärts- und Rückwärtsprimern und inkubieren Sie die Mischung bei 90 °C für 5 min, dann auf 37 °C für 15 min. Verwenden Sie als Steuerelemente Primer mit verschlüsselten Zielsequenzen (Table of Materials).</li>
		<li>Spaltet die geglühten Fragmente mit XhoI/XbaI-Restriktionsenzymen und ligiert sie stromabwärts der luc2-Sequenz in pmiR-GLO, wodurch pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) und pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled) Reporterkonstrukte erzeugt werden. Bestätigen Sie die Ligatur mit NotI-Spaltung. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Überhänge, die nach dem Primerglühen entstehen, komplementär zum Vektor nach der Spaltungsreaktion sind.</li>
	</ol></li>
	<li>pFLAG-HuR<ol><li>Um ein HuR-überexprimierendes Plasmid zu erzeugen, amplifizieren Sie die HuR-Sequenz mit spezifischen Primern. Mischen Sie 300 ng cDNA, 0,5 μM jedes spezifischen Primers, 1 mM dNTPs-Mix, 1x PCR-Puffer und 5 U High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase.</li>
		<li>Ligate das PCR-Produkt in pGEM-T und Bestätigung der DNA-Sequenzintegrität durch Sanger-Sequenzierung. Entfernen Sie das HuR-Fragment aus pGEM-T und subklonen Sie es in den pFLAG-CMV-3-Säugetierexpressionsvektor, um den pFLAG-HuR-Vektor zu erzeugen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zellkultur
HINWEIS: Die HeLa-Cre-Zelllinie war ein Geschenk von Dr. E. Makeyev21, und die papilläre Schilddrüsenkrebszelle (BCPAP) wurde freundlicherweise von Dr. Massimo Santoro (Universität "Federico II", Neapel, Italien) zur Verfügung gestellt. HeLa-Zelle, papilläre Schilddrüsenkrebszelle (BCPAP) und HEK-293T wurden verwendet, um HuR zu überexprimieren.
<ol><li>Halten Sie die Zellen in DMEM / hoher Glukose, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 200 mM L-Glutamin und 1x Penicillin-Streptomycin (100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin) in 100 mm Petrischale, sofern nicht anders angegeben. Die Zellen werden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit kontrollierter Atmosphäre (5% CO2) inkubiert.</li>
	<li>Adhärente Zellen mit Trypsin/EDTA (0,5%ige Lösungsmischung) bei 37 °C für 3-5 min inkubieren. Lassen Sie sie sich von der Platte lösen (die Inkubationszeit kann je nach Zelltyp variieren).</li>
	<li>Führen Sie Transfektionen mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Stellen Sie sicher, dass die Zellkulturen zu ca. 70% konfluent sind. Verwenden Sie ähnliche DNA-Mengen für alle Transfektionskombinationen, wie unten beschrieben, indem Sie die entsprechenden DNAs hinzufügen. Durchführung von Transfektionsexperimenten in Replikaten.<ol><li>Mischen Sie 200 ng DNA und 1,25 μL Transfektionsreagenz in 100 μL des Kulturmediums. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den Zellen hinzu. Die Zellen mit den Transfektionsmischungen 4 h bei 37 °C inkubieren. Dann ersetzen Sie das Medium durch ein Medium, das 10% FBS enthält, und inkubieren Sie für weitere 24 Stunden, bevor Sie die Antibiotika zur Auswahl hinzufügen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. HuR-Überexpression
<ol><li>Transfizieren Sie pFLAG-HuR und leeren Sie pFLAG in HeLa. Selektieren Sie Zellen, indem Sie die Konzentration von Geneticin (G418) (1 μg / ml) von 100 μg / ml auf 1000 μg / ml erhöhen, wodurch stabile Zelllinien erzeugt werden.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Überexpression mit quantitativer PCR unter Verwendung spezifischer Primer für HuR-mRNA, wie in Schritt 7 beschrieben.</li>
</ol>4. Gesamt-RNA-Isolierung
<ol><li>Verwenden Sie frisch gesammelte Zellen. Trypsinisieren von 70% konfluenten Zellkulturen (für diesen Assay wurden HeLa-Cre-Zellen verwendet), wie in Schritt 2.2 beschrieben.</li>
	<li>Das Zellpellet wird 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugiert und mit 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen; Wiederholen Sie die Zentrifugation.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml 1x PBS und geben Sie es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Wiegen Sie das Trockenzellenpellet und passen Sie das Volumen und die Größe der Röhrchen entsprechend an. 1 mg Zellen ergeben etwa 1 μg Gesamt-RNA.</li>
	<li>In einer Haube 500-1.000 μL Phenol / Chloroform in das Zellpellet geben (idealerweise 750 μL pro 0,25 g Zellen) und homogenisieren Sie es, indem Sie auf und ab pipettieren und mit dem Wirbel mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur (20 °C bis 25 °C), um die vollständige Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu ermöglichen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 200 μL Chloroform pro 1 mL verwendetem Phenol:Chloroform hinzufügen. Verschließen Sie die Probenröhrchen sicher.</li>
	<li>15 s kräftig mischen (von Hand oder kurz bei geringerer Geschwindigkeit wirbeln) und bei Raumtemperatur (20 °C bis 25 °C) 2 min bis 3 min inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine Zwischenphase und eine farblose obere wässrige Phase vorhanden sind. RNA verbleibt in der oberen wässrigen Phase. Sammeln Sie in einer Haube die wässrige Phase, vermeiden Sie den Kontakt mit der Zwischenphase und übertragen Sie sie in ein frisches Röhrchen.</li>
	<li>Fällen Sie RNA aus, indem Sie die wässrige Phase mit 400 μL Isopropanol in molekularer Qualität (1: 1-Verhältnis zu Phenol / Chloroform verwendet) und 2 μL Glykogen in jedem Röhrchen mischen (es hilft, das Vorhandensein des Pellets sichtbar zu machen).</li>
	<li>Von Hand kräftig mischen oder mit der Spitze für ~10 s homogenisieren. 15 min oder über Nacht bei −20 °C inkubieren.</li>
	<li>Die Probe wird bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.</li>
	<li>Waschen Sie das RNA-Pellet durch Zugabe von 3 Volumina 100% Ethanol (ca. 1 ml, verdünnt mit DEPC-Wasser) und mischen Sie die Probe durch Wirbeln, bis das Pellet freigesetzt ist und vom Boden schwimmt.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie das RNA-Pellet 1x durch Zugabe von 1 ml 75% Ethanol und mischen Sie die Probe durch Wirbeln, bis das Pellet freigesetzt ist und vom Boden schwimmt. Wiederholen Sie die Zentrifugation wie in Schritt 4.17 beschrieben.</li>
	<li>Führen Sie einen zusätzlichen Zentrifugationsschleuder von 5 s durch, um Restflüssigkeit von der Seite des Röhrchens zu sammeln und Restflüssigkeit mit einer Pipette zu entfernen, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Trocknen Sie das RNA-Pellet kurz an der Luft, indem Sie die Kappe des Röhrchens bei Raumtemperatur für 3-5 min öffnen und lösen Sie das RNA-Pellet in 20-50 μL RNase-freiem DEPC-behandeltem Wasser auf. Inkubieren Sie die RNA für 10 min bei 55-60 °C, um die Resuspension des Pellets zu erleichtern.</li>
</ol>5. Bestimmung der Gesamt-RNA-Konzentration und -Qualität
<ol><li>Bestimmen Sie die RNA-Konzentration, indem Sie die Absorption bei 260 nm und 280 nm mit einem Spektralphotometer messen. Erhalten Sie vollständige spektrale Daten, bevor Sie die Proben in nachgelagerten Anwendungen verwenden.</li>
	<li>Kontrollieren Sie die RNA-Qualität, indem Sie 800-1000 ng auf einem 1,5% igen Agarosegel unter Verwendung eines 0,5-fachen FSME-Puffers (45 mM Tris-Base, 45 mM Borsäure, 1 mM EDTA) auflösen. Die Gesamt-RNA trennt sich in zwei Banden, die sich auf 28S- und 18S-rRNAs beziehen.<ol><li>Stellen Sie alle Reagenzien her und waschen Sie alle Geräte, die für den Betrieb des Gels verwendet werden, mit DEPC-behandeltem Wasser. DEPC-behandeltes Wasser wird in der Haube durch Zugabe von 1 ml Diethylpyrocarbonat zu 1000 ml Reinstwasser hergestellt. Inkubieren für ~2 h bei Raumtemperatur oder bei 37 °C und Autoklav. Bei Raumtemperatur bis zu 10 Monate lagern. HINWEIS: Die Elektrophorese von Säugetier-Gesamt-RNAs führt zur Trennung von 28S- und 18S-rRNAs in einem Verhältnis von etwa 2:1. Die Bänder sollten intakt und als zwei scharfe Bänder sichtbar sein. Degradierte RNA führt zu verschwommenen Banden.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Reverse Transkription
<ol><li>Stellen Sie die umgekehrte Transkriptionsreaktion mit 1 μg Gesamt-RNA ein.</li>
	<li>Führen Sie eine umgekehrte Transkription (RT) unter Verwendung des Enzyms der reversen Transkriptase (siehe Materialtabelle) und 50 ng/μL zufälliger Decamer-Primer durch.<ol><li>Mischen Sie RNA, zufällige Primer und 1 mM dNTP-Mischung (10 mM) in 10 μL. Inkubieren Sie bei 65 °C für 5 min und auf Eis für 1 min. Fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu: 1x RT-Puffer, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U RNase-Inhibitor und 200 U Reverse Transkriptase.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 10 min bei 25 °C und für 1 h bei 50 °C (die Temperaturen können sich ändern, wenn verschiedene Enzyme verwendet werden). Beenden Sie die Reaktion durch Inkubation bei 85 °C für 5 min. cDNAs können bei −20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Quantitative PCR
<ol><li>Um die Reaktion in einem Endvolumen von 15 μL zusammenzusetzen, mischen Sie 3 μL cDNA (100 ng / μL), 3,2 pmol jedes Primers, 6 μL Master-Mix, die die dNTPs und das Enzym enthält, und 2,8 μL Reinstwasser. HINWEIS: Verwenden Sie Primer für endogene konstitutive Gene als Kontrollen (Housekeeping-Gene), um die Expressionsniveaus von HuR-mRNA und miRNAs zu normalisieren. β-Actin und snRNA U6 (RNU6B) sind verfügbare Optionen für die Normalisierung von mRNAs bzw. miRNAs, aber je nach Fall können auch andere Gene geeignet sein.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Expressionsniveaus mit der Delta-Delta-Ct-Methode (2-ΔΔCt)20.</li>
</ol>8. Der Reporter-Assay
<ol><li>Für den Assay verwendete Zellen<ol><li>Transfizieren Sie die Plasmide in HeLa-Cre-Zellen wie folgt. Transfekt mit pTK-Renilla (40 ng), dann pRD-miR-17-92, Erzeugung von HeLa-Cre-miR-17-92 und Selektion mit 1 μg/ml Puromycin.</li>
		<li>Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla mit pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR oder pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, separat. Wählen Sie mit Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 μg / ml). Diese Transfektionen erzeugen Luc-RAP-1-B und Luc-scrambled.</li>
		<li>Transfizieren Sie die Zellen mit pFLAG-HuR oder leerem pFLAG (Schritt 3).</li>
		<li>Fahren Sie mit der Zellkultur fort, wie in Schritt 2.2. beschrieben, mit HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR und HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc bis etwa 80% des Zusammenflusses. Mit 1 μL Doxycyclin (1 μg/ml) für 30 min bei 37 °C induzieren. Halten Sie auch alle Zellen ohne Doxycyclin als Kontrollen für den gleichen Zeitraum. HINWEIS: Die endgültige Konzentration von Doxycyclin hängt von der Zelllinie der Wahl ab. Ein Überschuss an Doxycyclin kann für Säugetierzellen toxisch sein.</li>
	</ol></li>
	<li>Lumineszenz-Assay<ol><li>Um verschiedene Lumineszenzintensitäten zu quantifizieren und zu vergleichen, verwenden Sie das Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit. Luciferase-Assay-Lösungen auftauen und bei Raumtemperatur belassen, bevor Sie mit dem Assay beginnen.</li>
		<li>Bereiten Sie die Mischung Stop und Glo (blaue Kappenröhrchen) vor, indem Sie 200 μL des Substrats in 10 mL Luciferase Assay Buffer II mischen. Bereiten Sie die Mischung LAR II (Green Cap Tubes) vor, indem Sie 10 ml Luciferase Assay Buffer II in die bernsteinfarbene Durchstechflasche von Luciferase Assay Substrat II mischen und gut schütteln.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösungen in 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die zuvor identifiziert und vor Licht geschützt wurden. HINWEIS: Alternativ können die Lösungen zuvor in 1-2 mL Aliquots hergestellt und bei −80 °C lichtgeschützt in Aluminiumfolie eingefroren werden.</li>
		<li>Führen Sie die Lumineszenzmessungen mit einem Gerät wie Synergy durch. Maß ausgedrückt Luciferase als relative Lichteinheiten (RLU).</li>
		<li>Exportieren Sie die Ergebnisse zur weiteren statistischen Analyse in eine Tabelle.</li>
		<li>Führen Sie eine Normalisierung der Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität durch die Steuerung Renilla (Luciferase / Renilla) durch und zeichnen Sie diese als relative Lichteinheiten (RLU) in einer Grafik auf. Wiederholen Sie dies für Gruppen mit und ohne Doxycyclin-Induktion.</li>
		<li>Berechnen Sie den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Führen Sie einen studentischen t-Test oder eine Zwei-Wege-ANOVA durch, gefolgt von Tukeys Post-Test, um einen Gruppenvergleich zu ermöglichen. Diese Analysen sind in einem Paket wie GraphPad Prism verfügbar. Unterschiede bei p-Werten < 0,05 gelten als signifikant.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312(2014).</li>
<li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+HuR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li>
<li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li>
<li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das Pre-mRNA-Spleißen ist ein wichtiger Prozess für die Regulation der Genexpression, und seine Kontrolle kann starke Auswirkungen auf die phänotypischen Modifikationen der Zellen auslösen22,23. Mehr als 70% der miRNAs werden von Introns beim Menschen transkribiert, und wir stellten die Hypothese auf, dass ihre Verarbeitung und Reifung durch Spleißen regulatorischer Proteine erleichtert werden könnte24,25...

Das Vorläufer-mRNA-Spleißen ist ein wichtiger Prozess für die Regulation der Genexpression in Eukaryoten1. Die Entfernung von Introns und die Vereinigung von Exons in reifer RNA wird durch das Spleißosom katalysiert, einen 2-Megadalton-Ribonukleoproteinkomplex, der aus 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 und U6) zusammen mit mehr als 100 Proteinen 2,3 besteht. Die Spleißreaktion erfolgt kotranskriptionell, und das Spleißosom wird an jedem neuen Intron zusammengesetzt, geleitet durch die Erkennung konservierter Spleißstellen an Exon-Intron-Grenzen und innerhalb des Introns4. Verschiedene Introns können trotz der bemerkenswerten Erhaltung des Spleißosomenkomplexes und seiner Komponenten unterschiedliche Spleißraten aufweisen. Zusätzlich zu den Unterschieden in der Konservierung von Spleißstellen können regulatorische Sequenzen, die auf Introns und Exons verteilt sind, RNA-bindende Proteine (RBP) steuern und das Spleißen stimulieren oder unterdrücken 5,6. HuR ist ein ubiquitär exprimiertes RBP und ein wichtiger Faktor zur Kontrolle der mRNA-Stabilität7. Frühere Ergebnisse unserer Gruppe zeigten, dass HuR an Introns binden kann, die miRNAs enthalten, was darauf hindeutet, dass dieses Protein ein wichtiger Faktor sein könnte, um die miRNA-Verarbeitung und -Reifung zu erleichtern, was auch zur Erzeugung alternativer Spleißisoformenführt 6,8,9.
Viele microRNAs (miRNAs) werden aus intronischen Sequenzen kodiert. Während einige Teil des Introns sind, sind andere als "Mirtrons" bekannt und werden vom gesamten Intron10,11 gebildet. miRNAs sind kurze nicht-kodierende RNAs mit 18 bis 24 Nukleotiden der Länge12. Ihre ausgereifte Sequenz zeigt eine teilweise oder vollständige Komplementarität mit Zielsequenzen in mRNAs, was sich auf die Translations- und/oder mRNA-Zerfallsraten auswirkt. Die Kombinationen von miRNAs und Targets treiben die Zelle zu unterschiedlichen Ergebnissen. Mehrere miRNAs können Zellen zu pro- oder antitumoralen Phänotypen treiben13. Onkogene miRNAs zielen in der Regel auf mRNAs ab, die eine suppressive Eigenschaft auslösen, was zu einer erhöhten Zellproliferation, Migration und Invasion führt14. Auf der anderen Seite könnten tumorsuppressive miRNAs auf onkogene mRNAs oder mRNAs abzielen, die mit einer erhöhten Zellproliferation zusammenhängen.
Auch die Verarbeitung und Reifung von miRNAs hängt von ihrer Herkunft ab. Die meisten intronischen miRNAs werden unter Beteiligung des Mikroprozessors verarbeitet, der aus der Ribonuklease Drosha und den Protein-Cofaktoren12 besteht. Mirtrons werden mit der Aktivität des Spleißosoms unabhängig von Drosha15 verarbeitet. In Anbetracht der hohen Häufigkeit von miRNAs, die in Introns gefunden werden, stellten wir die Hypothese auf, dass RNA-bindende Proteine, die am Spleißen beteiligt sind, auch die Verarbeitung und Reifung dieser miRNAs erleichtern könnten. Bemerkenswerterweise wurde das RBP hnRNP A2/B1 bereits mit dem Mikroprozessor und der miRNA-Biogeneseassoziiert 16. 
Wir haben bereits berichtet, dass mehrere RNA-bindende Proteine, wie hnRNPs und HuR, durch Massenspektrometrie mit intronischen miRNAs assoziiert sind17. Die Assoziation von HuR (ELAVL1) mit miRNAs aus dem intronischen Cluster miR-17-92 wurde mittels Immunpräzipitation und In-silico-Analyse bestätigt9. miR-17-92 ist ein intronischer miRNA-Cluster, der aus sechs miRNAs mit erhöhter Expression bei verschiedenen Krebsarten besteht18,19. Dieser Cluster wird auch als "oncomiR-1" bezeichnet und besteht aus miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b und miR-92 a. miR-19 a und miR-19b gehören zu den onkogensten miRNAs dieses Clusters 19. Die erhöhte Expression von HuR stimuliert die miR-19a- und miR-19b-Synthese 9. Da intronische Regionen, die diesen Cluster flankieren, mit HuR assoziiert sind, haben wir eine Methode entwickelt, um zu untersuchen, ob dieses Protein die Expression und Reifung von miR-19a und miR-19b regulieren kann. Eine wichtige Vorhersage unserer Hypothese war, dass HuR als regulatorisches Protein die miRNA-Biogenese erleichtern könnte, was zu phänotypischen Veränderungen führt. Eine Möglichkeit war, dass miRNAs durch die Stimulation von HuR verarbeitet wurden, aber nicht ausgereift und funktionsfähig wären und daher die Auswirkungen des Proteins den Phänotyp nicht direkt beeinflussen würden. Daher haben wir einen Spleißreporter-Assay entwickelt, um zu untersuchen, ob ein RBP wie HuR die Biogenese und Reifung einer intronischen miRNA beeinflussen könnte. Durch die Bestätigung der miRNA-Prozessierung und -Reifung zeigt unser Assay die Interaktion mit der Zielsequenz und die Erzeugung einer reifen und funktionellen miRNA. In unserem Assay koppeln wir die Expression eines intronischen miRNA-Clusters mit einem Luciferase-Plasmid, um die miRNA-Target-Bindung in kultivierten Zellen zu überprüfen.

<table><tbody><tr><td>Recombinant DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-Cre (Cre-kodierendes Plasmid)</td><td></td><td></td><td>Ein freundliches Geschenk von E. Makeyev von Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pFLAG-HuR</td><td></td><td></td><td>Erzeugt während dieser Arbeit</td></tr><tr><td>pmiRGLO-RAP-IB</td><td></td><td></td><td>Erzeugt während dieser Arbeit</td></tr><tr><td>pmiRGLO-scrambled</td><td></td><td></td><td>Erzeugt während dieser Arbeit diese Arbeit</td></tr><tr><td>pRD-miR-17-92</td><td></td><td></td><td>Entstanden während dieser Arbeit</td></tr><tr><td>pRD-RIPE-Spender</td><td></td><td></td><td>Ein freundliches Geschenk von E. Makeyev von Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-B-Aktin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>anti-HuR</td><td>Zelluläre Signalübertragung</td><td>mAb&nbsp; 12582</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680CW Ziege Anti-Maus</td><td>IgG Li-Cor Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Experimental Models: Cell Lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Cre</td><td></td><td></td><td>Ein freundliches Geschenk von E. Makeyev von Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92</td><td></td><td></td><td>Erzeugt während dieser Arbeit</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td><td></td><td></td><td>Erzeugt während dieser Arbeit</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td><td></td><td></td><td>Erzeugt während dieser Arbeit</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td><td></td><td></td><td>Erzeugt während dieser Arbeit</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td><td></td><td></td><td>Erzeugt während dieser Arbeit</td></tr><tr><td>Chemicals und Peptide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/hoher Glukosegehalt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>BioBasic</td><td>MB719150</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0301</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E859-EG</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pFLAG-CMV&trade;-3 Expression Vector</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6783</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10966-030</td><td></td></tr><tr><td>pmiR-GLO</td><td>Promega</td><td>E1330</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>752899</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091050</td><td></td></tr><tr><td>Trizol-LS Reagenz</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 10X</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Promega</td><td>R616A</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forward RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATGTGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>vorwärts verschlüsselt pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td><td></td></tr><tr><td>rückwärts gewürfelt pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>vorwärts HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG</td><td></td></tr><tr><td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>GGAACGCTTCACGAATTTGGCGTG</td><td></td></tr><tr><td>vorwärts B-Aktin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td><td></td></tr><tr><td>reverse B-Aktin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td><td></td></tr><tr><td>vorwärts HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG</td><td></td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8 für Mac OS X</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td>https://www.graphpad.com</tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td></td></tr></tbody></table>

ein reporter-assay zur analyse der intronischen microrna-reifung in säugetierzellen

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze RNA-Moleküle, die in Eukaryoten weit verbreitet sind. Die meisten miRNAs werden von Introns transkribiert, und ihre Reifung umfasst verschiedene RNA-bindende Proteine im Zellkern. Reife miRNAs vermitteln häufig Gen-Silencing, und dies ist zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um posttranskriptionelle Ereignisse zu verstehen. Darüber hinaus kann es als vielversprechende Methodik für Gentherapien erforscht werden. Derzeit fehlen jedoch direkte Methoden zur Beurteilung der miRNA-Expression in Säugetierzellkulturen. Hier beschreiben wir eine effiziente und einfache Methode, die bei der Bestimmung der miRNA-Biogenese und -Reifung durch Bestätigung ihrer Interaktion mit Zielsequenzen hilft. Dieses System ermöglicht auch die Trennung der exogenen miRNA-Reifung von ihrer endogenen Aktivität unter Verwendung eines Doxycyclin-induzierbaren Promotors, der in der Lage ist, die primäre miRNA (pri-miRNA) -Transkription mit hoher Effizienz und niedrigen Kosten zu steuern. Dieses Werkzeug ermöglicht auch die Modulation mit RNA-bindenden Proteinen in einem separaten Plasmid. Neben der Verwendung mit einer Vielzahl verschiedener miRNAs und ihren jeweiligen Targets kann es an verschiedene Zelllinien angepasst werden, sofern diese transfektionsfähig sind.

Unsere ursprüngliche Hypothese war, dass HuR die intronische miRNA-Biogenese erleichtern könnte, indem es an seine Prä-miRNA-Sequenz bindet. So könnte der Zusammenhang von HuR-Expression und miR-17-92-Clusterbiogenese auf einen neuen Mechanismus hinweisen, der die Reifung dieser miRNAs steuert. Die Überexpression von HuR bei Transfektion von pFLAG-HuR wurde in drei verschiedenen Zelllinien bestätigt: HeLa, BCPAP und HEK-293T (Abbildung 2). Als Kontrollen wurden untransfizierte Zelle...

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Unser Protokoll befasst sich mit den Auswirkungen regulatorischer RNA-bindender Proteine auf die microRNA-Biogenese und -Reifung direkt aus Zellkulturen. Die von uns beschriebene Methode kann mit gängigen Zellkulturreagenzien durchgeführt werden und ist relativ schnell. Diese Methode kann wichtig sein, um die phänotypischen Wirkungen von microRNAs und ihren Zielen in verschiedenen Arten von eukaryotischen Zellen zu untersuchen.Normale oder krankheitsähnliche Zellen können verwendet werden. Es ist wichtig, Zelllinien auszuwählen, die für die Transfektion geeignet sind, und geeignete Transfektions- und Induktionskontrollen durchzuführen, um die Veränderungen der Zielaffinität durch Luciferase-Aktivität zu beobachten. Um zu beginnen, halten Sie die Zellen in DMEM, hohe Glukose Ergänzung in 100 Millimeter Petrischalen und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten, kontrollierten Atmosphäre Inkubator mit 5% Kohlendioxid.Um adhärente Zellen abzulösen, inkubieren Sie sie mit Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Um Transfektionen durchzuführen, mischen Sie 200 Nanogramm DNA und 1,25 Mikroliter Transfektionsreagenz in 100 Mikroliter de

a-reporter-assay-to-analyze-intronic-microrna-maturation-mammalian

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Hier beschreiben wir einen Test, dass die Macht der Mikroinjektion mit fluoreszierenden gekoppelt...

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und haben gezeigt, dass eine Rolle bei zahlreichen biologischen Prozessen spielen. Um besser zu verstehen miRNA-UTR-Interaktionen, haben wir eine genomweite Sammlung von 3 UTR Luciferase Reporter mit einem neuartigen Luciferase-Gen und Assay-Reagenz, das LightSwitch System gepaart erstellt.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

In diesem Video zeigen wir, dass in Gegenwart eines Phosphodiester-Inhibitors der Eizellzyklus an der Prophase-I gestoppt wird, während der transkribierte mRNAs ohne Translation gespeichert werden. Nach der Freisetzung des Inhibitors wird die Eizellreifung fortgesetzt und die Zellen treten in die Metaphase ein. Das Signal der Reporter-mRNA, die in der Metaphase-I mit dem Zielgen fusioniert ist, deutet auf die Aktivierung der Translationsmaschinerie und der Proteinexpression hin.

Der In-vitro-Reporter-Assay für eine einzelne Eizelle: Eine Technik zur Untersuchung der Regulation der Ziel-mRNA-Translation während der In-vitro-Eizellreifung

Der genetische Reporter-Assay ist ein gut etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug, um die Beziehung zwischen DNA-Sequenzen und ihren genregulatorischen Aktivitäten zu entschlüsseln. Die Kopplung von regulatorischen Elementkandidaten an Reportergene, die identifizierende Sequenz-Tags tragen, ermöglicht eine massive Parallelisierung dieser Assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Hierin schlagen wir eine Strategie vor, um die Wirkung eines interessierenden Transkriptionsfaktors auf das microRNA-Transkriptom unter Verwendung öffentlich zugänglicher Daten, Rechenressourcen und Hochdurchsatzdaten von microRNA-Arrays nach der Transfektion von Zellen mit kleiner Haarnadel (sh)RNA zu untersuchen, die auf einen interessierenden Transkriptionsfaktor abzielt.

Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind kurz und stark homologe RNA-Sequenzen, dienen als Posttranskriptionale Regulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs). Aktuelle MiRNA Nachweismethoden unterscheiden sich in der Sensitivität und Spezifität. Wir beschreiben eine Protokoll, die in Situ Hybridisierung und Immunostaining für die gleichzeitige Erkennung von MiRNA und Protein-Moleküle auf Maus Herz Gewebeschnitte verbindet.

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

Dieses Protokoll verwendet eine sondenbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einen Sulforhodamin-B-Assay (SRB), 3' unübersetztes Klonen (3' UTR) und einen Luziferase-Assay, um die Zielgene einer miRNA von Interesse zu verifizieren und die Funktionen von miRNAs zu verstehen.

Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Reporter-Assay zur Untersuchung der Regulation der mRNA-Translation in einzelnen Eizellen während der In-vitro-Reifung.

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5'-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

Lernen Sie einen Reporter-Assay zur Analyse der microRNA-Reifung in Säugetierzellen. Diese Methode untersucht RNA-bindende Proteine mittels Luciferase-Aktivität und ist für verschiedene eukaryotische Zelllinien anwendbar.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

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