Ein TNBS-induziertes Nagetiermodell zur Untersuchung der pathogenen Rolle von mechanischem Stress bei Morbus Crohn
1. März 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Morbus Crohn-ähnlichen Colitis-Modells bei Nagetieren. Eine transmurale Entzündung führt zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle, und eine mechanische Vergrößerung wird im Segment proximal zur Stenose beobachtet. Diese Änderungen ermöglichen die Untersuchung der mechanischen Belastung bei Colitis.
In unserem Protokoll führt die intrakolonale Instillation von TNBS zu einer transmuralen Entzündung an der Instillationsstelle und der mechanischen Dehnung im Segment proximal zur Entzündung. Dies ahmt also den stenotischen Morbus Crohn nach. Da das proximale Segment mechanisch aufgebläht ist, aber keine sichtbare Entzündung zeigt, hilft eine vergleichende Untersuchung des proximalen Segments und der Entzündungsstelle festzustellen, ob mechanischer Stress bei Morbus Crohn eine Rolle spielt.
Frühere Studien konzentrieren sich nur auf die Entzündungsstelle. Unser Protokoll, das an verschiedenen Stellen im Modell arbeitet, hebt eine kritische Rolle der mechanischen Belastung bei Morbus Crohn hervor, insbesondere bei stenotischem Morbus Crohn. Legen Sie die Ratten zunächst in Rückenlage auf den Anästhesietisch.
Um Colitis zu induzieren, führen Sie einen medizinischen, offenen Polyurethankatheter für etwa sieben bis acht Zentimeter vom Analrand durch den Anus ein und instillieren Sie vorsichtig TNBS in den Dickdarm. Verabreichen Sie die Scheinkontrollratten mit 250 Mikrolitern Kochsalzlösung. Um die Verteilung von TNBS oder Kochsalzlösung zu unterstützen und Verschüttungen zu vermeiden, halten Sie die Ratten in Rückenlage mit dem Kopf nach unten in einem Winkel von etwa 30 Grad, wobei der Anus für zwei Minuten geschlossen ist.
Öffnen Sie den Hinterleib der Ratte mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dickdarm über dem Analkanal und übertragen Sie den Dickdarm sofort in den eiskalten 1x HBSS-Puffer. Begradigen Sie den Doppelpunkt im Puffer und messen Sie die Dickdarmlänge mit einem Lineal.
Nehmen Sie einen Nylonfaden und kreisen Sie ihn um den Dickdarm, um den äußeren Umfang der Dickdarmsegmente in Kontroll- und TNBS-behandelten Ratten zu messen. Nehmen Sie Gewebe in voller Dicke für die Histologie. Schneiden Sie den Dickdarm entlang der Mesenterialtafel auf und reinigen Sie den Dickdarm gründlich mit HBSS-Puffer.
Beurteilen Sie den Dickdarm für makroskopische Entzündungswerte basierend auf den vordefinierten Kriterien mit minimalen Modifikationen. Sammeln Sie Kolongewebeproben von TNBS-behandelten Ratten an den Stellen P, I und D.Site P ist der Teil, der zwei bis drei Zentimeter vor dem oralen Rand der Entzündungsstelle liegt. Site I ist die Entzündungsstelle, an der TNBS eingeträufelt wird, typischerweise vier bis sechs Zentimeter vom Ende des Dickdarms entfernt.
Schließlich ist Punkt D der Teil ein bis zwei Zentimeter distal zum Aboralrand der Entzündungsstelle. Die intrakolonale Instillation von TNBS bei Ratten induzierte eine lokalisierte transmurale Entzündung von etwa zwei Zentimetern Länge mit verdickter Darmwand und verengtem Lumen an der Instillationsstelle im distalen Dickdarm. Die Stelle der TNBS-Instillation wurde als Ort bezeichnet, I.As Folge einer transmuralen Entzündung und Stenose, sowohl Entzündungen als auch mechanische Belastungen waren an Ort I vorhanden.Die Stenose an Ort I führte zu einer ausgeprägten Lumendehnung im Segment proximal zur Stelle der TNBS-Instillation, die als Standort P bezeichnet wird.Der Dickdarmumfang war an den Stellen P und I im Vergleich zum Scheinkontrollkolon signifikant erhöht.
Obwohl mechanisch aufgebläht, zeigte die Stelle P keine sichtbare Entzündung. Im Gegenteil, das als Ort D bezeichnete Dickdarmsegment distal zur TNBS-Instillation zeigte weder eine Entzündung noch eine mechanische Dehnung. Der makroskopische Score der Entzündung an Ort I bei den mit TNBS behandelten Ratten war im Vergleich zu Scheinkontrollen an den Stellen P und D von Colitis-Ratten dramatisch erhöht.
Die Entzündungswerte an den Stellen P und D waren im Vergleich zur Täuschung nicht signifikant erhöht. Daher ist es wichtig, nicht nur Ort I, sondern auch die Standorte P und D im Modell zu untersuchen, da dies hilft, die pathogene Bedeutung mechanischer Belastung bei Morbus Crohn zu erkennen. Um weiter festzustellen, ob mechanischer Stress ein pathogener Faktor bei Darmentzündungen ist, kann man auch versuchen, mechanische Dehnungen freizusetzen, indem man die Tiere ausschließlich mit flüssiger Nahrung füttert und sieht, ob dies bei Entzündungen und Darmfunktion hilft.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines colitisähnlichen Modells bei Nagetieren, das auf transmurale Entzündungen und mechanische Belastung fokussiert ist. Es ermöglicht die Untersuchung mechanischer Veränderungen bei Colitis, insbesondere unter stenotischen Bedingungen.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Gastroenterologie
- Entzündliche Darmerkrankung
Hintergrund
- Die Morbus Crohn zeichnet sich durch transmurale Entzündungen aus.
- Mechanischer Stress könnte eine bedeutende Rolle beim Fortschreiten der Erkrankung spielen.
- Bisherige Studien konzentrierten sich hauptsächlich auf Entzündungsherde.
- Dieses Modell ermöglicht vergleichende Untersuchungen von befallenen und nicht befallenen Darmabschnitten.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Nagetiermodells, das eine stenotische Morbus Crohn nachahmt.
- Untersuchung der Rolle mechanischer Belastung bei der Kolitis.
- Vergleich mechanischer Veränderungen in entzündeten und nicht entzündeten Darmabschnitten.
Verwendete Methoden
- Intrakolonale Applikation von TNBS zur Induktion einer Entzündung.
- Beurteilung der mechanischen Dehnung in proximalen Segmenten.
- Vergleichende Analyse zwischen entzündeten und nicht entzündeten Bereichen.
- Verwendung von Anästhesie zur Vorbereitung von Nagetieren.
Hauptergebnisse
- Eine transmurale Entzündung wurde erfolgreich an der TNBS-Stelle induziert.
- Eine mechanische Dehnung wurde im proximalen Segment beobachtet.
- Die Befunde deuten auf eine entscheidende Rolle mechanischer Belastung bei Morbus Crohn hin.
- Das Modell unterstreicht die Bedeutung der Untersuchung unterschiedlicher anatomischer Lokalisationen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Modell eignet sich zur Untersuchung einer Colitis im Sinne von Morbus Crohn.
- Mechanische Belastung könnte zur Krankheitspathologie beitragen.
- Zukünftige Studien sollten die Implikationen dieser Befunde untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der unabhängigen Rolle mechanischer Belastung bei der Pathogenese von Morbus Crohn ist entscheidend, um Risiken in der frühen Entdeckung und Zielvalidierung bei der Entwicklung von IBD-Arzneimitteln zu minimieren. Das durch TNBS induzierte Nagetiermodell ermöglicht eine präzise Unterscheidung mechanischer von entzündlichen Faktoren und stützt die Vorhersagekraft translationaler Forschung sowie die Portfolioauswahl für anti-fibrotische und anti-stenotische Strategien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung mechanischer Spannung als unabhängigen pathogenetischen Faktor bei Morbus Crohn.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem mechanische von entzündlichen Beiträgen zur Fibrose und Stenose unterschieden werden.
- Erleichtert die mechanistische Ent风险bewertung neuer therapeutischer Hypothesen, die auf die Gewebeumbildung abzielen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes In-vivo-System zur quantitativen Beurteilung der Genexpression, Immunantwort und Fibrose unter definierten mechanischen Bedingungen.
- Ermöglicht die reproduzierbare Messung makroskopischer Entzündungen und mechanischer Dehnung an verschiedenen anatomischen Stellen.
- Unterstützt die Standardisierung von Assays zur Evaluierung von Wirkstoffen, die auf mechanische Belastungspfade abzielen.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt präklinische Modelle auf krankheitsrelevante Merkmale der Pathologie von Morbus Crohn ab, einschließlich transmuraler Entzündung und luminaler Stenose.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung antifibrotischer und antistenotischer Therapieansätze.
- Bietet translationsrelevante Biomarker-Möglichkeiten, indem mechanische Belastung mit Genexpression und Gewebeumbau korreliert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Modell schließt die Lücke zwischen früher Entdeckung und präklinischer Validierung, indem es die Überprüfung von Hypothesen zur mechanischen Belastung bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) ermöglicht und die Identifizierung von Leitverbindungen sowie risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Untersucht die pathogene Bedeutung mechanischer Belastung im Vergleich zu Entzündungen bei Morbus Crohn.
- Screening: Liefert quantitative, ortsspezifische Messgrößen für Entzündung, Fibrose und mechanische Dehnung.
- Analytik: Ermöglicht den vergleichenden Nachweis von Genexpression und Immunantwort an definierten anatomischen Stellen.
- Translationale Forschung: Modelliert klinisch relevante Merkmale zur präklinischen Bewertung antifibrotischer Strategien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für mechanistische Studien und Wirkstoffscreenings in der IBD-Forschung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung und der Absicherung von Wirkmechanismen für die Morbus Crohn.
- Operationaler Wert: Standardisiert die in-vivo-Bewertung mechanischer und entzündlicher Faktoren in Modellen der entzündlichen Darmerkrankung (IBD).
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über die Weiterentwicklung oder Einstellung von Wirkstoffkandidaten gegen Fibrose und Stenose.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Entdeckungs- und präklinischen Wirkstoffen, die auf die Gewebeumgestaltung abzielen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in chirurgischen Verfahren an Nagetieren und Modellen der Kolitis.
- Setzt Zugang zu histologischen, molekularen und makroskopischen Analyseinfrastrukturen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Durchführung der Entzündungsbewertung und Gewebeprobenahme über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann je nach Nagetierstamm oder Modell, das für entzündliche Darmerkrankungen relevant ist, Anpassungen erfordern.
- Die Quantifizierung mechanischer Belastung beschränkt sich auf definierte anatomische Stellen und erfasst möglicherweise keine systemischen Effekte.
