Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der Histonassemblierung mittels DNA-Vorhangtechnik

Dieses Protokoll zeigt, wie die DNA-Vorhangtechnik zur Untersuchung der Chromatindynamik eingesetzt wird, insbesondere zur Untersuchung der molekularen Funktion von Histon-Chaperonen. Der DNA-Vorhang mit der Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Bildgebungstechnik überwindet die Einschränkungen von Massenexperimenten und erleichtert die Echtzeit-Bildgebung, wodurch die detaillierte Charakterisierung von Biomolekül-Wechselwirkungen ermöglicht wird. Legen Sie ein sauberes Papier der Größe 5 x 35 Millimeter auf die Mitte des doppelseitigen Klebebandes.

Befestigen Sie das Klebeband über dem Objektträger, um die beiden Löcher und Nanomuster mit dem Papier zu bedecken. Schneiden Sie dann das Papier mit einer sauberen Klinge heraus. Legen Sie ein Deckglas auf das doppelseitige Klebeband und reiben Sie das Deckglas mit einer Pipettenspitze ab, um eine mikrofluidische Kammer zu bilden.

Platzieren Sie die zusammengebaute Durchflusszelle zwischen zwei Objektträgern und befestigen Sie sie. Die Durchflusszelle in einem 120 Grad Celsius heißen Vakuumofen 45 Minuten backen. Befestigen Sie den Flüssigkeitsanschluss für die chipbasierte Analyse mit einer Heißklebepistole an jedem offenen Loch.

Und verbinden Sie die beiden Leitungen der Köderschloss-Schläuche. Schließen Sie eine Köderverschlussspritze mit drei Millilitern deionisiertem Wasser an und waschen Sie die Kammer. Waschen Sie die Kammer erneut mit drei Millilitern Lipidpuffer über eine Tropfen-für-Tropfen-Verbindung.

Injizieren Sie einen Milliliter 0,04-faches biotinyliertes Lipid in Lipidpuffer in zwei Schüssen mit einer fünfminütigen Inkubation pro Schuss in die Kammer. Injizieren Sie 0,025 Milligramm pro Milliliter Streptavidin in einen Milliliter BSA mit zwei Spritzen und einer 10-minütigen Inkubation pro Schuss. Injizieren Sie etwa 30 Picomomar biotinylierter Lambda-Phagen-DNA in einem Milliliter BSA-Puffer mit zwei Schüssen und 10-minütigen Inkubationen pro Schuss in die Kammer.

Schließen Sie eine Spritze mit 10 Millilitern Bildgebungspuffer an eine Spritzenpumpe an und entfernen Sie Blasen in allen Schlauchleitungen im mikrofluidischen System. Koppeln Sie die vorbereitete Durchflusszelle über eine Tropfen-zu-Tropfen-Verbindung mit dem Mikrofluidiksystem, um eine Blaseninjektion in die Durchflusszelle zu vermeiden. Montieren Sie die Durchflusszelle und die Durchflusszellenhalter und montieren Sie die Baugruppe auf einem speziell angefertigten Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop.

Injizieren Sie 200 Mikroliter YOYO-1-Farbstoff in den Bildgebungspuffer durch eine 100-Mikroliter-Probenschleife, um Lambda-DNA-Moleküle zu färben. Führen Sie eine Bildgebungssoftware aus und schalten Sie den 488-Nanometer-Laser ein, um zu überprüfen, ob die DNA-Vorhänge gut geformt sind. Nachdem der YOYO-1-Farbstoff entfernt wurde, injizieren Sie die vorinkubierte Proteinprobe.

Wenn die Proteine den DNA-Vorhang erreichen, schalten Sie die Spritzenpumpe aus, schalten Sie das Absperrventil aus und inkubieren Sie 15 Minuten lang, um die Histonbeladung mit Abo1 zu erreichen. Waschen Sie die ungebundenen Abo1- und Histonproteine fünf Minuten lang aus. Schalten Sie den Pufferfluss vorübergehend aus, um zu überprüfen, ob Histonproteine auf die DNA geladen sind.

Die Bildung von DNA-Vorhängen wurde durch Färbung von DNA-Molekülen mit einem interpolierenden Farbstoff überprüft. Grüne Linien, die in parallelen Arrays gezeigt wurden, zeigten, dass YOYO1, das in DNA-Moleküle eingelagert war, gut ausgerichtet und an einer Diffusionsbarriere unter hydrodynamischer Strömung gestreckt war. Wenn Cy5-H3-H4-Dimere in Abwesenheit von Abo1 in den DNA-Vorhang injiziert wurden, bindete Cy5-H3-H4 nicht an DNA, was auf einen Mangel an spontaner Bindung von H3-H4-Dimeren an DNA hindeutet.

Als Cy5-H3-H4 mit Abo1 injiziert wurde, wurden rot fluoreszierende Punkte auf DNA-Molekülen gesehen, was darauf hindeutet, dass Abo1 H3-H4-Dimere auf die DNA lädt. Die Fluoreszenzsignale verschwanden in Abwesenheit des Pufferflusses und tauchten wieder auf, wenn der Fluss wieder aufgenommen wurde, was darauf hindeutet, dass H3-H4-Dimere an DNA binden. Die Bindung von H3-H4-Dimeren an DNA wurde auch durch den Kymographen bestätigt, bei dem die Fluoreszenzsignale verschwanden, wenn der Fluss ausgeschaltet wurde.

Nur wenige fluoreszierende Punkte traten im DNA-Vorhang auf, entweder in Abwesenheit von Nukleotid oder in Gegenwart von ADP, was darauf hindeutet, dass H3-H4-Dimere selten an DNA binden, weder im Apo-Zustand noch in Gegenwart von ADP. Die quantitative Analyse zeigt, dass die Anzahl der an DNA gebundenen H3-H4-Dimere in Gegenwart von ATP zunimmt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ATP-Hydrolyse für die H3-H4-Beladung der DNA durch Abo1 essentiell ist.

Die Vermeidung von Blaseninjektionen in die Durchflusszelle ist bei allen Schritten am kritischsten. In diesem Protokoll legen wir den Schwerpunkt auf Drop-by-Drop-Verbindungen. Der DNA-Vorhang-Assay kann auf Doppel-Tether-DNA-Vorhänge mit dualen Nanomustern erweitert werden.

Darüber hinaus können wir eine andere Art von DNA-Vorhang mit einzelsträngigen DNA-, RNA- oder Aktinfilamenten herstellen. Der DNA-Vorhang ermöglicht die Visualisierung der Proteinbewegung auf der DNA und erleichtert die Untersuchung des Zielsuchmechanismus. Der DNA-Vorhang kann für die Untersuchung des DNA-Stoffwechsels einschließlich Replikation und Transkription verlängert werden.