Name: Analysen der Proteinurie, der renalen Infiltration von Leukozyten und der renalen Ablagerung von Proteinen bei zu Lupus neigenden MRL/lpr-Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Analyse von Proteinurie, Leukozyteninfiltration und Proteinablagerung in Nieren bei MRL/lpr-Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Verfolgung des Lupusverlaufs.

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Wir danken der Flow Cytometry Core Facility, dem Histopathology Laboratory, dem Fralin Imaging Center am Virginia Polytechnic Institute und der State University für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.

Das vorliegende Protokoll wird vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech genehmigt. Da die Lupuserkrankung bei Weibchen häufiger vorkommt, wurden nur weibliche MRL/lpr-Mäuse verwendet. Die Probenentnahme wurde im Alter von 4 Wochen begonnen und nach 15 Wochen beendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle) und wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gemäß den institutionellen Richtlinien gezüchtet und gehalten.
1. Proteinurie-Test
<ol><li>Sammeln Sie Urin, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Sterilisieren Sie die Haube, indem Sie 70% Ethanol sprühen. Legen Sie eine sterile Plastikfolie auf die Oberfläche. Bereiten Sie Spitzen, 1,5-ml-Röhrchen und eine Pipette vor, um etwa 20 μL der Flüssigkeit zu sammeln. HINWEIS: Spitzen und Schläuche müssen steril und ohne Vorbehandlung sein.</li>
		<li>Nehmen Sie den Käfig und sprühen Sie 70% Ethanol, bevor Sie ihn in die Haube legen.</li>
		<li>Halten Sie die Maus mit einer Hand und massieren Sie mit der anderen Hand den Bauchbereich sanft von oben nach unten.</li>
		<li>Verwenden Sie ein 1,5-ml-Röhrchen oder eine Pipette, um den Urin direkt zu sammeln, oder wenn die Probe fällt, sammeln Sie ihn von der Plastikfolie. Verwenden Sie für jede Probe frische Handschuhe, Laken und Spitzen. HINWEIS: Wenn dies nicht funktioniert, verwenden Sie ein steriles Becherglas, um die Maus zu isolieren, und sammeln Sie dann den Urin aus dem Becherglas, nachdem die Maus uriniert hat.</li>
		<li>Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig. Nehmen Sie eine andere Maus heraus und wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.4. HINWEIS: Reinigen Sie die Plastikfolie und das Becherglas immer mit 70% Ethanol, nachdem Sie die Probe für jede Maus entnommen haben. Mindestens fünf Mäuse pro Gruppe sind für die statistische Signifikanz notwendig. Urinproben können bei -80 °C gelagert werden, bis sie bis zu 12 Monate verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifizieren Sie die Proteine mit der Bradford-Methode24.<ol><li>Lassen Sie Urinproben, Albuminstandard und das Bradford-Reagenz auf Raumtemperatur (RT) kommen, indem Sie sie für 10-20 Minuten außerhalb des Gefrierschranks aufbewahren. HINWEIS: Bradford-Reagenz und Albumin-Standard sind in einem handelsüblichen Kit enthalten (siehe Materialtabelle). Die Ausgangskonzentration des Albumin-Standards beträgt 2 mg/ml. Serielle Verdünnungen (1:2 sechsmal) müssen mit Wasser durchgeführt werden.</li>
		<li>Bradford-Reagenz wird unverdünnt in eine 96-Well-Platte (200 μL/Well) gegeben.</li>
		<li>Pipettieren Sie 5 μL unverdünnte Urinprobe pro Vertiefung und verwenden Sie die Spitze, um mehrmals nach oben und unten zu pipettieren, um richtig zu mischen.</li>
		<li>Fügen Sie Standards (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg / dl) in Duplikaten hinzu. Lassen Sie ein paar Vertiefungen als Leerzeichen. HINWEIS: Das Hinzufügen von Mustern und Standards muss schnell erfolgen.</li>
		<li>Lassen Sie es 5-10 min bei RT stehen.</li>
		<li>Lesen Sie die Platte bei 595 nm in einem Plattenleser gemäß dem Protokoll des Herstellers ab (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolierung der Nierenzellen
<ol><li>Euthanasieren Sie die Maus mit CO2 (Flussrate: 30% -70% Volumen / min, um Bewusstlosigkeit oder Tod zu erreichen) in einer Kammer, gefolgt von zervikaler Dislokation. Fahren Sie mit der Sektion fort, um beide Nieren zu sammeln. Legen Sie eineinhalb Nieren in ein eiskaltes C10-Medium. Legen Sie die andere Hälfte der Niere in OCT (Schritt 3.1.1). HINWEIS: C10 wird mit RPMI 1640 hergestellt, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1% 100x MEM-nicht essentiellen Aminosäuren, 10 mM HEPES, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die Nieren in Korngröße schneiden (1-2 mm3 Stück) und in 5 ml Verdauungspuffer mit 1 mg/ml Kollagenase und 0,2 mg/ml DNase I (siehe Materialtabelle) in RPMI 1640 Medium mit 10 mmol/L HEPES für 1 h mit kontinuierlichem sanftem Schütteln bei 37 °C aufrühren. HINWEIS: Fügen Sie 1 ml Verdauungspuffer in ein steriles 2 ml Röhrchen und verwenden Sie eine sterile Schere, um die Niere zu hacken.</li>
	<li>10 mL 1x eiskaltes PBS mit 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugeben und 10 min auf Eis inkubieren. Dann wirbeln Sie die Aufhängung zweimal durch.</li>
	<li>Die Zellsuspension durch ein 100 μM Sieb filtrieren und mit 10 mL HBSS-full waschen. HINWEIS: HBSS-full enthält 5 mM EDTA, 0,1% BSA und 10 mM HEPES.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 350 x g für 10 min bei RT.</li>
	<li>Bereiten Sie 30%, 37% und 70% Stock Isotonic Percoll (SIP) Lösung vor. HINWEIS: Mischen Sie 1 Teilvolumen von 10x PBS und 9 Teile Volumen von Percoll, um SIP vorzubereiten (siehe Materialtabelle); Verwenden Sie HBSS-full, um SIP auf 30%, 37% und 70% SIP zu verdünnen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml 30% SIP und laden Sie 37% von 5 mL (oben) und 70% von 5 ml (unten), wobei der SIP-Gradient langsam mit einer Pasterpipette entsteht.</li>
	<li>Zentrifugieren mit Up9 unten0 (oder Bremse 0) bei 1000 x g für 30 min bei RT.</li>
	<li>Sammeln Sie Leukozyten von der 37%-70% Grenzfläche und resuspendieren Sie sie in 5 ml C10.</li>
	<li>Bei 350 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml FACS-Puffer. Die Zellen sind bereit für die FACS-Färbung. HINWEIS: Der FACS-Puffer enthält 1x PBS und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA).</li>
	<li>Bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand (SN) verwerfen, wobei etwa 50 μL übrig bleiben. HINWEIS: Um den Überstand zu entfernen, gießen oder pipettieren Sie die Lösung vorsichtig vom Feststoff weg oder saugen Sie den Überstand mit einem halbautomatischen Vakuum ab.</li>
	<li>50 μL FcR-Block (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen hinzufügen (vorverdünnt 1/50 in 1x PBS); Mischen und 10 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml FACS-Puffer zum Waschen hinzu.</li>
	<li>Bei 350 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und SN verwerfen, wobei etwa 50 μL übrig bleiben.</li>
	<li>20 μL des entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffs zugeben (1/100 mit 1x PBS verdünnen, siehe Materialtabelle) und 15-30 min auf Eis stehen lassen.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL Antikörper 15 Mischung pro Röhrchen hinzu: CD138-BV711 (1/200 in 1x PBS) und CD45-AF700 (1/200 in1x PBS) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Auf Eis im Dunkeln für 15-30 min inkubieren und 3 ml FACS-Puffer hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 350 x g für 5 min bei 4 °C und Vakuum SN, wobei etwa 50 μL übrig bleiben. Resuspendieren in 200 μL 1x PBS. Dies ist nun bereit, mittels Durchflusszytometrie analysiert zu werden.</li>
</ol>3. Immunfluoreszierende Färbung
<ol><li>Führen Sie die Beispielsammlung aus.<ol><li>Betten Sie die halbe Niere in das kleine Kunststoffkryomold mit der OCT-Verbindung (Optimal Cutting Temperature) ein (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Trockeneis in eine Styroporschaumbox geben (siehe Materialtabelle) und das Kryomold vorsichtig auf das Trockeneis legen. Stellen Sie sicher, dass die Kryoformen flach platziert werden. HINWEIS: Es dauert 3-4 Minuten, bis die OCT-Verbindung erstarrt und weiß wird.</li>
		<li>Nehmen Sie das Kryomold heraus und wickeln Sie es in Aluminiumfolie ein. Bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern. HINWEIS: Dieser kann bei -80 °C für mindestens 1 Jahr gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das Schneiden und Fixieren der Probe durch.<ol><li>Die Proben in 4 μm Abschnitte schneiden, mindestens 2-3 h zum Trocknen warten und dann 10 min mit kaltem Aceton (bei 4 °C) fixieren. HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei der Verwendung von Aceton, das eine spezielle chemische Haube erfordert.</li>
		<li>Nach dem Befestigen der Objektträger 0,5-1 h an der Luft trocknen und kurz bei -20 °C oder lange bei -80 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Färben Sie die Proben.<ol><li>Fixieren Sie die Objektträger in kaltem Aceton für 5-10 min.</li>
		<li>Lassen Sie die Abschnitte auf RT erwärmen. Verwenden Sie einen PAP-Stift (siehe Materialtabelle) um den Abschnitt herum und lassen Sie ihn trocknen. HINWEIS: Nagelschmelz kann ebenfalls verwendet werden. Dieser Schritt verhindert, dass die Antikörperverdünnung über den gesamten Objektträger schwimmt.</li>
		<li>Dias in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 20 min in das Coplin-Glas (siehe Materialtabelle) geben, das Glas auf den Shaker stellen und vorsichtig schütteln.</li>
		<li>Gießen Sie 1x TBS ab und füllen Sie das Glas mit 1x TBS, 5% BSA und 0,1% Tween 20. 20 min auf dem Shaker inkubieren, vorsichtig schütteln.</li>
		<li>Nehmen Sie die Objektträger heraus und wischen Sie den Boden der Objektträger trocken. Falls erforderlich, schütteln Sie die Objektträger trocken. Fügen Sie dem Abschnitt 100 μL konjugierte Antikörper25 C3-FITC (1/100) und IgG2a-PE (1/100) hinzu (siehe Materialtabelle). Inkubieren bei RT in einer befeuchteten Kammer für 1 h.</li>
		<li>Waschen Sie den Abschnitt 3 mal in 1x TBS, 5% BSA und 0,1% Tween 20 für 10 min auf dem Shaker.</li>
		<li>Schütteln Sie die Objektträger trocken und montieren Sie den Abschnitt mit einem Antifade-Reagenz (siehe Materialtabelle) und einem Deckglas.</li>
		<li>Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C bis zur Betrachtung unter dem Mikroskop (z.B. konfokales Mikroskop oder bildgebendes Systemmikroskop). Quantifizieren Sie Bilder mit Software und subtrahieren Sie Hintergrundsignale, wenn Sie die Fluoreszenzintensität zwischen Regionen vergleichen.</li>
		<li>Für die Bildanalyse mit der ImageJ-Software (siehe Materialtabelle) skizzieren Sie den gewünschten Bereich.</li>
		<li>Legen Sie Standardparameter fest, indem Sie auf Analysieren und dann auf Messungen und Messbereich festlegen klicken, um die Ergebnisse zu erhalten.</li>
		<li>Übertragen Sie die aus den Messfenstern erhaltenen Daten in eine Tabelle. HINWEIS: Ein kleiner Bereich kann aus dem Bild als Hintergrund ausgewählt werden. Es sollte keine Fluoreszenz haben.</li>
		<li>Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Analysieren , um die Region zu messen und die Daten erneut in die vorherige Tabelle zu übertragen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.3.11-3.3.12 für mehrere Regionen.</li>
		<li>Berechnen Sie die mittlere Fluoreszenz als korrigierte Zellfluoreszenz (CCF) = Integrierte Dichte - (Ausgewählte Zellregion x mittlere Hintergrundfluoreszenz).</li>
		<li>Berechnen Sie für jede Region und analysieren Sie Daten mit der Grafik- und Statistiksoftware (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

LN ist eine der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, und Faktoren, die die Krankheit verschlimmern, bleiben unklar. Die Anwendung dieses Protokolls besteht darin, die Nierenfunktion mit mehreren Methoden zu charakterisieren, einschließlich der Messung der Proteinurie, der FACS-Analyse isolierter Nierenleukozyten und der Immunfluoreszenzfärbung von gefrorenen Nierenabschnitten.
Ein wichtiger Punkt, der beim Sammeln von Urin zu beachten ist, ist, dass man mit der Tageszeit und dem Ort der...

Die Hauptfunktion der Niere ist die Ausscheidung toxischer Substanzen durch den Urin unter Aufrechterhaltung der Homöostase von Wasser und Salzen1. Diese Funktion ist bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) bedroht, was zu einer sogenannten Lupusnephritis (LN) führt. LN ist eine Folge des Immunsystems, das die Niere angreift, was zu anhaltenden Nierenentzündungen führt und daher seine Fähigkeit verliert, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren. Dies führt schließlich zu Nierenversagen, das tödlich sein kann. Während des nephritischen Prozesses werden zirkulierende B-Zellen, T-Zellen und Monozyten in die Niere rekrutiert und sezernieren Chemokine, Zytokine und immunkomplexbildende Autoantikörper. Dies führt letztendlich zu Endothelzellschäden, membranösen Verletzungen, renaler tubulärer Atrophie und Fibrose2.
MRL/Mp-Fas lpr (MRL/lpr) Lupus-anfällige Mäuse sind ein klassisches Mausmodell, das lupusähnliche klinische Symptome aufweist, die dem menschlichen SLE3 ähneln. Dieses Modell hat maßgeblich zum Verständnis einer der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, der Lupusnephritis (LN)4, beigetragen. Sowohl beim menschlichen als auch bei der Maus-SLE ist LN durch eine allmähliche Entzündung gekennzeichnet, die durch renale Ablagerung von Immunkomplexen ausgelöst wird, gefolgt von Komplementaktivierung, Rekrutierung von Entzündungszellen und Verlust der Nierenfunktion5. Die Immunkomplexablagerung ist der erste Schritt, um die Chemokin- und Zytokinproduktion durch intrinsische Nierenzellen zu induzieren, die die Entzündungsreaktion durch Rekrutierung von Immunzellen erweitert6. Das aktuelle Protokoll präsentiert mehrere Techniken, um das Fortschreiten der Nierenerkrankung zu verfolgen, die die Zellinfiltration und die Ablagerung von Immunkomplexen analysieren.
Der wöchentlich gesammelte Urin ermöglicht die Erkennung und Visualisierung des zeitlichen Verlaufs der Proteinurie vor, während und nach dem Beginn des Lupus. Proteinurie als Biomarker kann das biologische Fortschreiten von LN bestimmen. Weitere Vorteile dieser Technik sind, dass sie nicht-invasiv, kostengünstig und einfach zu implementieren ist7. Wenn die Niere perfekt funktioniert, ist der Proteinurie-Spiegel konstant niedrig; Bei MRL/LPR-Mäusen wird jedoch nach einem Alter von 8-9 Wochen ein allmählicher Anstieg des Proteinuriespiegels beobachtet, der schließlich hoch genug ist, um Nierenversagen zu verursachen8. Mehrere Reagenzienstreifen und kolorimetrische Reagenzien sind im Handel erhältlich, um das Problem zu überwachen. Der Bradford-Test ist jedoch billig und sehr genau bei der Bestimmung des Beginns der Proteinurie und des Verlaufs der Lupusnephritis. Dieser Assay ist schnell und das Reagenz wird nicht durch das Vorhandensein von Lösungsmitteln, Puffern, Reduktionsmitteln und Metallchelatbildnern beeinflusst, die sich in Ihrer Probe 9,10,11 befinden können.
Ein wichtiger zu berücksichtigender Aspekt ist die Zellinfiltration in der Niere. Diese Infiltrate fördern die Pathogenese, indem sie die Sekretion löslicher Faktoren wie Zytokine auslösen, um die Entzündung zu verschlimmern12. Um besser zu verstehen, welche Zellpopulationen in den Infiltraten vorhanden sind, ist eine nützliche Methode, Leukozyten zu isolieren13. Hier wird der Nachweis einer renalen Infiltration von B-Zellen als Beispiel verwendet. Das Verfahren beginnt mit einem Verdauungsprozess mit Desoxyribonuklease (DNase) und Kollagenase, gefolgt von einer Dichtegradiententrennung, die Trümmer, rote Blutkörperchen und dichte Granulozyten entfernt. Der Grund für die Isolierung von B-Zellen (CD19+) und Plasmazellen (CD138+) ist, dass Lupusnieren diese Zellen konzentrieren können14. Es wird vermutet, dass das Vorhandensein von B-Zellen in kleinen Aggregaten in der Niere auf eine klonale Expansion und folglich auf die Produktion von Immunglobulin (Ig) hinweisen kann. Es ist bekannt, dass Plasmazellen auch in diesen Aggregaten vorhanden sind15. Sobald Leukozyten isoliert wurden, kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet werden, um die interessierenden Zellen nach Färbung mit verschiedenen fluoreszenzkonjugierten Antikörpern zu analysieren.
Die Immunfluoreszenz ist eine der immunhistochemischen (IHC) Nachweismethoden, die eine fluoreszierende Visualisierung von Proteinen in 4 μm dicken Nierengewebeproben ermöglicht. Andere IHC-Nachweismethoden hängen von der Art der Analyten, der Bindungschemie und anderen Faktoren ab16. Immunfluoreszenz ist eine schnelle Identifizierungsmethode, bei der das Antigen seinem Gegenstück Antikörper ausgesetzt wird, der mit einem spezifischen Fluorochrom (oder einem Fluoreszenzfarbstoff) markiert ist. Wenn es angeregt wird, erzeugt es Licht, das ein Fluoreszenzmikroskop erkennen kann. Diese Technik kann verwendet werden, um die Ablagerung von Komplement C3 und IgG2a17 zu beobachten. Eine übermäßige Aktivierung der Komplementkaskade könnte mit einer unkontrollierten Immunantwort und einem Funktionsverlust in Verbindung gebracht werden18. Die Immunablagerung von Anti-Doppelstrang-DNA-Autoantikörpern (Anti-dsDNA) in der Niere ist ein Hauptanliegen19, wo diejenigen mit IgG2a-Isotyp mit LN20 assoziiert wurden. Insbesondere zeigen Anti-dsDNA-Antikörper mehr Pathogenität und Affinität zu Kernmaterialien und bilden Immunkomplexe21. Wenn IgG2a vorhanden ist, wird die Komplementkaskade, einschließlich C3, aktiviert, um die Immunkomplexezu beseitigen 22. Die C3- und IgG2a-Marker können einzeln quantifiziert oder überlagert werden, um ihre Korrelation herzustellen.
Insbesondere die Serumkreatininmessung ist eine weitere zuverlässige Technik, die zusammen mit mikroskopischer Hämaturie und Nierenbiopsien zur Diagnose von LN23 verwendet werden kann. Das Vorhandensein von Proteinurie ist jedoch ein starker Indikator für glomeruläre Schäden. In diesem Sinne kann die Überwachung des Proteinurie-Spiegels während Lupus den Ausbruch der Krankheit erkennen und andere Methoden zur Diagnose von Lupus ergänzen. Darüber hinaus können Immunkomplexe, die in Glomeruli abgelagert werden, eine Entzündungsreaktion auslösen, das Komplementsystem aktivieren und mehr Entzündungszellen rekrutieren. Ein weiterer bemerkenswerter Punkt dieses Protokolls ist die B-Zell-Infiltration in der Niere. Zusammen mit den infiltrierten T-Zellen verstärkt dies lokale Immunantworten, die Organschäden auslösen. Wichtig ist, dass die Klassifizierung von LN nicht nur auf glomerulären morphologischen Veränderungen basiert, die in der Mikroskopie beobachtet werden, sondern auch auf Immunablagerungen, die mit Immunfluoreszenz beobachtet werden. Daher werden in diesem Protokoll genaue und kostengünstige Methoden zur Analyse der Nierenfunktion im Labor angeboten.

<table><tbody><tr><td>10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60764. K2</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mensch/Maus C3</td><td>Cedarlan</td><td>CL7632F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD138 BV711</td><td>Biolegend</td><td>142519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 AF700</td><td>Biolegend</td><td>103127</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Tiegel</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradient Medium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>DEPC-Behandeltes Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA-EC</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-ecdna</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Mikroskop Bildgebungssystem</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific AMF5000</td><td></td></tr><tr><td>FACS Fusion Zellsortierer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Fusion</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - Premium, hitzeinaktiviertes</td><td>R& D systems</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 96-Well-Platten aus Polystyrol</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prisma</td><td>GraphPad N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of</td><td>Health N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mäuse (MRL/lpr)</td><td>Jackson Lab</td><td>485</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Any conventional store</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tisse-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Einweg-Einbettungsformen</td><td>Polysciences</td><td>R-30</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 20x TBS Puffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28358</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23236</td><td>Albumin Standard enthalten</td></tr><tr><td>ProLon Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>FcR Block</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>SoftMax Pro 6.1 Software</td></tr><tr><td>Sterile Zellsiebe 100 & Mikro; M</td><td>Fisher</td><td>Scientific 22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vancomycinhydrochlorid</td><td>Goldbio</td><td>V-200-1</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>Fluoreszenzfarbstoff für die Durchflusszytometrie-Analyse</td></tr></tbody></table>

analysen der proteinurie, der renalen infiltration von leukozyten und der renalen ablagerung von proteinen bei zu lupus neigenden mrl/lpr-mäusen

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung ohne bekannte Heilung und ist durch anhaltende Entzündungen in vielen Organen, einschließlich der Nieren, gekennzeichnet. Unter solchen Umständen verliert die Niere ihre Fähigkeit, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und die Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren, was schließlich zu Nierenversagen führt. Frauen, insbesondere solche im gebärfähigen Alter, werden neunmal häufiger diagnostiziert als Männer. Nierenerkrankungen sind die häufigste Todesursache bei SLE-Patienten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Messung der ausgeschiedenen Proteinspiegel im gesammelten Urin und verfolgt das Fortschreiten des Lupus im Laufe der Zeit. Darüber hinaus wird ein Ansatz zur Isolierung mononukleärer Nierenzellen basierend auf der Auswahl von Größe und Dichte bereitgestellt, um die renale Infiltration von Leukozyten zu untersuchen. Darüber hinaus wurde eine immunhistochemische Methode entwickelt, um die Proteinablagerung in den Glomeruli und die Leukozyteninfiltration im tubulointerstitiellen Raum zu charakterisieren. Zusammen können diese Methoden helfen, das Fortschreiten chronischer Entzündungen im Zusammenhang mit den Nieren von Lupus-anfälligen MRL / lpr-Mäusen zu untersuchen.

Das Protokoll verwendet mehrere Methoden, um MRL / lpr-Mäuse auf Lupusnephritis zu untersuchen. Zunächst wird ein Verfahren beschrieben, um erhöhte Proteinuriespiegel aufgrund von Nierenfunktionsstörungen im Laufe der Zeit zu untersuchen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurden weibliche Mäuse mit oraler Sonde von 200 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) als Kontrollgruppe und probiotischem Lactobacillus reuteri als Behandlungsgruppe in einer Konzentration von 109 KB...

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Verfolgung des Lupusverlaufs bei Mäusen. Zwei zusätzliche Verfahren werden vorgestellt, um die Lupusnephritis basierend auf Zellinfiltration und Proteinablagerung in den Nieren zu charakterisieren.

Analysen der Proteinurie, der renalen Infiltration von Leukozyten und der renalen Ablagerung von Proteinen bei zu Lupus neigenden MRL/lpr-Mäusen

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Diese Methoden können helfen, das Fortschreiten chronischer Nierenentzündungen bei Lupuspatienten zu untersuchen. Wir bieten eine zuverlässige und kostengünstige Alternative, mit der der Krankheitsverlauf bei Lupus überwacht werden kann. Beginnen Sie mit der Sterilisation der Haube, indem Sie 70% Ethanol sprühen und eine sterile Plastikfolie auf die Oberfläche legen.Dann bereiten Sie Spitzen, 1,5-Milliliter-Röhrchen und eine Pipette vor, um etwa 20 Mikroliter des Urins zu sammeln. Nehmen Sie den Käfig und sprühen Sie 70% Ethanol, bevor Sie ihn in die Haube legen. Danach halten Sie die Maus mit einer Hand und massieren mit der anderen Hand sanft den ventralen Bereich von oben nach unten.Sammeln Sie den Urin mit einem 1,5-Milliliter-Röhrchen oder einer Pipette direkt. Oder wenn die Probentropfen sie von der Plastikfolie sammeln. Setzen Sie dann die Maus wieder in den Käfig.Die sezierten Nieren in Korngröße schneiden und in fünf Milliliter Verdauungspuffer mit Kollagenase und DNase 1 in RPMI 1640 Medium mit HEPES für eine Stunde unter kontinuierlichem sanftem Schütteln bei 37 Grad Celsius verdauen. Fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS mit 10 Millimol EDTA hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten auf Eis. Dann wirbeln Sie die Aufhängung zweimal durch.Später filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb und waschen Sie sie mit 10 Milliliter HBSS voll. Danach bei 350 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Bereiten Sie eine isotonische 30-, 37- und 70%ige Standard-Percoll-Lösung vor und fügen Sie eine Schicht 37%iger Percoll-Lösung auf die 70%ige Lösung auf.Resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter von 30% Standard-isotonischem Percoll. Mit einer Pasteur-Pipette werden langsam 37% von fünf Milliliter oben und 70% von fünf Milliliter unten geladen, wodurch ein isotonischer Percoll-Gradient entsteht. Dann zentrifugieren Sie mit oben Nummer neun und unten Nummer Null bei 1000 mal G für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Danach sammeln Sie Leukozyten von der 37 bis 70%-Schnittstelle und suspendieren sie in fünf Milliliter C10. Auch hier zentrifugieren Sie bei 350 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend wird das Zellpellet in drei Milliliter Faxpuffer resuspendiert und bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Dann verwerfen Sie den Überstand, der etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig lässt. Fügen Sie 50 Mikroliter FC-Rezeptorblock pro Röhrchen hinzu. Danach mischen und 10 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren.Fügen Sie später zwei Milliliter Faxpuffer zum Waschen hinzu. Dann zentrifugieren Sie bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand, so dass etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig bleiben. Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter des entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffs hinzu und lassen Sie ihn 15 bis 30 Minuten auf Eis stehen.50 Mikroliter Antikörpermischung pro Röhrchen mit CD 138 brillantviolett sieben 11 und CD 45 Alexa Fluor 700 zugeben und 15 bis 30 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie anschließend drei Milliliter Faxpuffer hinzu. Zentrifugieren bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie den Überstand durch Vakuum, wobei etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig bleiben. Später suspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS. Um die Probe zu sammeln, betten Sie die halbe Niere in den kleinen Kunststoffkryomold mit der optimalen Schnitttemperaturverbindung ein.Dann Trockeneis in eine Styroporschaumbox geben und das Kryomold vorsichtig auf das Trockeneis legen. Als nächstes entfernen Sie die Kryoform, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Anschließend fixieren Sie die trockenen auf vier Mikrometer Abschnitte mit kaltem Aceton für 10 Minuten.Nach dem Befestigen der Dias 0,5 bis eine Stunde an der Luft trocknen und kurzzeitig bei minus 20 Grad Celsius oder lange bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die Proben zu färben, fixieren Sie die Objektträger für fünf bis 10 Minuten in kaltem Aceton und lassen Sie die Abschnitte auf Raumtemperatur erwärmen. Zeichnen Sie anschließend mit einem Klapsstift einen hydrophoben Kreis um den Abschnitt und lassen Sie ihn trocknen.Dann legen Sie die Dias in TBS für 20 Minuten in das Copeland-Glas und schütteln Sie vorsichtig, indem Sie das Glas auf den Shaker stellen. Anschließend TBS abgießen und das Glas mit TBS 5% BSA und 0,1% TW 20 füllen. Später inkubieren Sie das Glas für 20 Minuten, indem Sie leicht auf dem Shaker schütteln.Nehmen Sie dann die Folien heraus und wischen Sie die Unterseite der Folien ab. Fügen Sie 100 Mikroliter konjugierte Antikörper C3 fit C und IgG2 APE in den Abschnitt und inkubieren Sie die Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für eine Stunde. Waschen Sie den Abschnitt dreimal in PBS 5% BSA und 0,1% TW 20 für 10 Minuten auf dem Shaker und schütteln Sie dann die Objektträger trocken.Montieren Sie den Abschnitt mit einem Anti-Fade-Reagenz und dann mit einem Abdeckglas. Dann lagern Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius, bis sie unter dem Mikroskop betrachtet werden. Für die Bildanalyse mit der Image J-Software skizzieren Sie den gewünschten Bereich.Danach legen Sie Standardparameter fest, indem Sie auf Analysieren klicken, dann Messungen und Messbereich festlegen, um die Ergebnisse zu erhalten. Als nächstes übertragen Sie die aus den Messfenstern erhaltenen Daten in eine Tabelle. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Analysieren, um die Region zu messen und die Daten erneut in die vorherige Tabelle zu übertragen.Die Proteinspiegel im Urin von MRL LPR-Mäusen wurden im Laufe der Zeit nachgewiesen, wo sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Kontrollgruppe und Lactobacillus reuteri als Behandlungsgruppe behandelt wurden. Die Mäusegruppe behandelte mit L.reuteri eine aggressivere Proteinurie-Progression als die Kontrollgruppe. Die Faxanalyse wurde für die isolierten Nierenleukozyten durchgeführt, um die Plasmazellen zu analysieren.Weiterhin wurden die Mäuse mit Vancomycin oder Vancomycin zusammen mit Escherichia coli doppelsträngiger DNA behandelt. Obwohl erwartet wurde, dass Escherichia coli doppelsträngige DNA die Niereninfiltration auslöst, wurde kein signifikanter Unterschied im Prozentsatz der Plasmazellen gefunden. Die Komplemente C3 und IgG2a wurden durch Immunfluoreszenzfärbung an weiblichen MRL-IPR-Nierenabschnitten nachgewiesen.Die effektiven Umweltfaktoren auf die renale Ablagerung von C3 und IgG2a wurden für das hauseigene Mäusebrot in der Tierhaltung und das von einem Verkäufer gekaufte verglichen. Die immunhistochemische Analyse zeigte keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Das Hinzufügen jeder Schicht der prozentualen ISO 20 Percoll-Lösung kann eine Herausforderung sein, und wenn sie gemischt werden, müssen Sie von vorne beginnen.Dieses Verfahren hilft beim Durchflusszytometer und in Vitter-Experimenten, so dass Sie die verschiedenen Nierenzelltypen von Populationen nicht untersuchen können. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die in den Nieren infiltrierten B-Zellen zu untersuchen, und es gibt nicht viele Informationen in der Literatur.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Der Transfer von bm12-Lymphozyten in einen C57BL/6-Empfänger ist ein etabliertes Modell des systemischen Lupus erythematodes. Hier beschreiben wir, wie man mit diesem Modell eine Krankheit auslösen kann und wie man T-follikuläre Helferzellen, Keimzentrum-B-Zellen und Plasmazellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert.

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Induktion eines nephrotischen Syndroms bei Mäusen durch retrobulbären Injektion von Doxorubicin und Verhinderung von Volume Retention von verzögerter Freisetzung Aprotinin

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Analysen der Proteinurie, der renalen Infiltration von Leukozyten und der renalen Ablagerung von Proteinen bei zu Lupus neigenden MRL/lpr-Mäusen (Video) | JoVE Journal

Analysen der Proteinurie, der renalen Infiltration von Leukozyten und der renalen Ablagerung von Proteinen bei zu Lupus neigenden MRL/lpr-Mäusen

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